Référence : Molecules 2019 · PMID 31717557 · DOI 10.3390/molecules24224060 Type : etude in vitro · Plante : Bouleau pubescent · Propriété → Cancer Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
La présente étude a examiné l’ampleur et le mécanisme de l’effet cytotoxique sur des lignées de cellules cancéreuses sélectionnées de l’acide 3,4-seco-urs-4(23),20(30)-dién-3-oïque (1), de l’acide 3,4-seco-oléan-4(24)-én-19-oxo-3-oïque (2) et de l’acide 3,4-seco-urs-4(23),20(30)-dién-19-ol-3-oïque (3) isolés des bourgeons de bouleau pubescent (Betula pubescens) par extraction par fluide supercritique au dioxyde de carbone et chromatographie sur colonne à gradient. La viabilité cellulaire dans six lignées de cellules cancéreuses humaines exposées à ces composés a été déterminée par le test au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). L’apoptose a été quantifiée par coloration à l’annexine V/iodure de propidium des cellules de cancer gastrique AGS et de cancer colorectal DLD-1. Pour évaluer le mécanisme de l’apoptose, l’expression des protéines liées à l’apoptose a été analysée par Western blot. Le composé 1 a présenté une toxicité non spécifique, tandis que les composés 2 et 3 étaient spécifiquement toxiques pour les cellules cancéreuses du côlon et de l’estomac. La toxicité des composés 2 et 3 contre ces deux lignées cellulaires était supérieure à celle du composé 1. Le clivage des caspases-8, -9 et -3 a été observé dans les cellules AGS et DLD-1 traitées avec les trois seco-acides, indiquant l’induction de l’apoptose par les voies extrinsèque et intrinsèque. Par conséquent, les acides seco-triterpéniques (1–3) ont diminué la viabilité cellulaire par induction de l’apoptose. Les cellules AGS et DLD-1 étaient plus sensibles aux seco-acides possédant un C19 oxydé que les fibroblastes normaux. Ainsi, ils constituent un nouveau groupe de triterpènes à activité anticancéreuse potentielle.
Les bouleaux sont des espèces à bois dur et à feuilles caduques de la famille des Betulaceae et sont largement répandus dans l’hémisphère Nord. Depuis l’Antiquité, différentes parties de ces plantes ont été utilisées en médecine traditionnelle. En particulier, des teintures éthanoliques de bourgeons d’hiver ont été utilisées pour traiter les maux de dents, les rhumes et les affections rhumatoïdes. Un certain nombre d’études de laboratoire et cliniques ont confirmé les propriétés thérapeutiques des extraits de bourgeons de bouleau, notamment leur action diurétique ainsi que leurs propriétés antiseptiques et antioxydantes. En Russie, une préparation de bourgeons de bouleau, Gemmae Betulae, est un médicament standardisé utilisé principalement pour traiter les maladies des voies urinaires.
Au cours des dernières décennies, un certain nombre d’études ont été menées sur l’activité anticancéreuse des bourgeons de bouleau. En particulier, il a été constaté que divers extraits des bourgeons de deux espèces de bouleau blanc présentaient une cytotoxicité distincte, dépendante du temps et de la concentration, vis-à-vis de nombreuses lignées de cellules cancéreuses humaines. Dans le même temps, l’activité cytotoxique la plus élevée a été démontrée par les extraits obtenus par extraction par fluide supercritique au dioxyde de carbone (SFE). Ces résultats suggèrent que les bourgeons de bouleau sont une source prometteuse de composés à activité cytotoxique contre diverses formes de cancer. Notamment, les bourgeons de bouleau ont une teneur élevée en composés triterpéniques. De nombreux membres de ce groupe de métabolites secondaires ont une activité anticancéreuse bien documentée. Cependant, à ce jour, les recherches se sont limitées à l’action des extraits entiers obtenus à partir des bourgeons de bouleau, et aucune tentative n’a été faite pour étudier l’effet anticancéreux des composés constitutifs individuels.
Ce travail rend compte de l’effet cytotoxique des acides seco-triterpéniques (1–3), qui ont été isolés pour la première fois à partir des bourgeons de bouleau pubescent, Betula pubescens, comme le montre la Figure 1.
Les cellules cancéreuses A375, AGS, DLD-1, HeLa, LN229, MDA-MB-231 et les fibroblastes cutanés normaux ont été traités avec des doses croissantes (25–400 μM) de seco-acides (composés 1–3) pendant 24, 48 et 72 h, et les changements de viabilité cellulaire ont été quantifiés à l’aide du test MTT, comme illustré dans la Figure 2. Une diminution de la viabilité cellulaire dépendante de la dose et du temps a été observée. À partir des courbes dose-réponse, les valeurs d’IC₅₀ ont été calculées. Il a été constaté que la diminution de la viabilité des cellules traitées avec le seco-acide (1) était similaire. En revanche, les composés bifonctionnels céto-seco-acide (2) et hydroxy-seco-acide (3) ont exercé une activité plus élevée contre les cellules DLD-1. De plus, les cellules DLD-1 étaient plus sensibles à l’action de ces seco-acides que les fibroblastes normaux. Les valeurs d’IC₅₀ les plus pertinentes sont présentées dans le Tableau 1.
[ tableau ]
Puisque les extraits de bourgeons de bouleau étaient utilisés en médecine russe comme agent diurétique pris par voie orale, des cellules de cancer gastrique (AGS) et des cellules de cancer colorectal (DLD-1) ont été choisies pour l’examen de l’activité apoptotique des acides seco-triterpéniques isolés de ceux-ci. L’apoptose a été quantifiée par triple coloration des cellules avec le conjugué annexine V-FITC, l’iodure de propidium (PI) et le Hoechst 33342, et les cellules ont été visualisées par microscopie à fluorescence, comme illustré dans la Figure 3. Les cellules apoptotiques étaient caractérisées par l’exposition de la phosphatidylsérine sur le feuillet externe de la membrane cellulaire. Ainsi, l’annexine V, un ligand naturel de la phosphatidylsérine, a été utilisée pour leur détection. L’intégrité membranaire des cellules apoptotiques précoces les rendait imperméables au PI ; cependant, l’ADN des cellules apoptotiques tardives ou mortes pouvait le lier. Contrairement au PI, le Hoechst 33342 avait la capacité de lier l’ADN des cellules vivantes et mortes. Nous avons constaté qu’après 24 h de traitement, les acides seco-triterpéniques augmentaient la mort cellulaire apoptotique de manière dose-dépendante. Le composé 1 à 200 μM a induit un stade apoptotique tardif dans presque toutes les cellules AGS, tandis que le nombre de cellules DLD-1 apoptotiques précoces et tardives était similaire. En revanche, le traitement des cellules AGS avec les composés 2 et 3 à 200 μM a entraîné une augmentation similaire du nombre de cellules apoptotiques précoces et tardives, et a mis presque toutes les cellules DLD-1 dans un stade apoptotique tardif.
Pour évaluer le mécanisme d’induction de l’apoptose par les acides seco-triterpéniques dans les cellules AGS et DLD-1, l’expression des protéines liées à l’apoptose a été analysée par Western blot, comme le montre la Figure 4. Le stade final de l’apoptose était réalisé par les caspases — un groupe de protéases spécifiques de la cystéine-aspartyle. L’activation des caspases dépendait du clivage intrachaîne de zymogènes inactifs pour former des caspases clivées actives. Il existait deux voies majeures déclenchant l’apoptose : extrinsèque et intrinsèque.
La voie extrinsèque était activée par des ligands de récepteurs de mort transmembranaires, entraînant l’activation de la caspase-8. Une augmentation du traitement de la caspase-8 a été observée pour tous les acides seco-triterpéniques dans les deux lignées cellulaires utilisées dans l’étude, les données suggérant l’induction de la voie apoptotique extrinsèque.
De multiples stimuli internes sont connus pour déclencher la voie intrinsèque de l’apoptose en augmentant la perméabilité des membranes mitochondriales externes. Cela entraînait la translocation du cytochrome c dans le cytoplasme et l’activation de la caspase-9. Parmi les protéines inductrices de la voie intrinsèque, les niveaux d’expression de BID et de p53 ont été dosés. Il a été précédemment montré que BID était clivée par la caspase-8 pour former BID tronquée (tBID), qui se transloquait dans les membranes mitochondriales, entraînant la libération de cytochrome c. Nos données ont montré une diminution de l’expression de BID dans les deux lignées, à l’exception des cellules AGS traitées avec le seco-acide (1). En revanche, il n’y avait pas d’augmentation du niveau de p53 dans les cellules AGS contenant p53 de type sauvage ni dans les cellules DLD-1 porteuses d’une mutation inactivatrice du gène TP53. Ainsi, BID mais pas p53 pourrait médier l’induction de la voie intrinsèque. Enfin, nous avons constaté une augmentation du clivage de la caspase-9 dans les deux lignées cellulaires traitées avec les trois acides seco-triterpéniques, indiquant l’induction de la voie intrinsèque.
Il a été précédemment montré que les deux voies de l’apoptose convergent dans l’induction des caspases exécutrices, telles que la caspase-3 et la caspase-7, qui catalysent à leur tour la dégradation protéolytique de nombreux composants cellulaires, conduisant à la mort cellulaire. Le traitement avec les trois acides seco-triterpéniques a induit une augmentation des niveaux de caspase-3 clivée active dans les cellules AGS et DLD-1 avec une diminution concomitante de l’expression de la pro-forme de la caspase-3 dans les cellules DLD-1. Bien que la caspase-7 clivée n’ait pas été détectée dans les cellules DLD-1 après 24 h de traitement, la diminution observée du niveau de sa pro-forme indique une activation de la caspase-7. En revanche, le traitement des cellules AGS avec les seco-acides a entraîné non seulement une augmentation des niveaux de caspase-3 clivée mais aussi une augmentation de l’expression des pro-formes des caspases exécutrices. Le clivage de la poly(ADP-ribose) polymérase (PARP), le substrat de la caspase-3, était concomitant au traitement de la caspase-3 dans les deux lignées cellulaires, indiquant l’activation enzymatique de la caspase-3. Prises ensemble, ces données suggèrent l’activation des caspases exécutrices par les voies extrinsèque et intrinsèque de l’apoptose. Les niveaux les plus élevés de caspases-8, -9 et -3 clivées et de PARP clivée ont été observés dans les cellules AGS traitées avec le composé 1, et dans les cellules DLD-1 traitées avec les composés 2 et 3. Ainsi, les cellules reconnues comme apoptotiques tardives à la coloration à l’annexine V et au PI présentaient des niveaux plus élevés de marqueurs d’apoptose.
Le genre Betula est une riche source de triterpènes qui exercent une activité cytotoxique et sont donc considérés comme des agents anticancéreux potentiels, l’acide bétulinique en étant un exemple bien connu. À leur tour, des composés moins actifs tels que la bétuline, qui est le constituant majeur de l’écorce externe des bouleaux, sont utilisés pour obtenir des dérivés semi-synthétiques à l’activité prometteuse. Les voies de biosynthèse des triterpènes varient selon l’organe végétal ; par conséquent, la recherche de triterpènes ne se limite pas à l’écorce de bouleau. En effet, la présence de triterpènes de type ursane et oléanane a été rapportée dans les épis floraux de Betula platyphylla. Les triterpènes appartenant aux groupes oléanane et lupane, outre les dérivés ursane, présentent également un intérêt en raison de leur utilisation possible en thérapie anticancéreuse.
Les bourgeons de bouleau semblent être une autre source intéressante de triterpènes. Dans un article récent, la cytotoxicité de divers extraits de bourgeons de bouleau contre un large éventail de cellules cancéreuses a été démontrée. Dans la présente étude, nous avons isolé des acides seco-triterpéniques (composés 1–3) à partir des bourgeons de B. pubescens et déterminé leur cytotoxicité vis-à-vis des cellules cancéreuses et des fibroblastes normaux.
L’un des composés isolés, le seco-acide 1, avait été précédemment rapporté comme montrant une faible toxicité cellulaire dans de multiples lignées cellulaires. Nos données ont étayé ces constatations ; cependant, nous avons également démontré une dépendance au temps dans toutes les lignées cellulaires testées. De plus, l’ajout d’un groupe hydroxyle au C19 du seco-acide 1 a provoqué une augmentation de la cytotoxicité dans certaines des lignées cellulaires — en particulier dans les cellules de cancer colorectal et gastrique. Par conséquent, l’incorporation de groupes polaires dans les seco-acides de type ursane, comme dans le composé 3, pourrait avoir un impact bénéfique sur la plage d’application possible. De plus, il semblait que cette caractéristique n’était pas propre aux seco-acides de type ursane, car le dérivé de type oléanane 2, caractérisé par un groupe céto en C19, conservait une cytotoxicité élevée en culture de cancer colorectal. Cela était cohérent avec un rapport antérieur selon lequel une augmentation de la polarité des triterpènes provoque une augmentation de l’activité anticancéreuse.
Les cellules cancéreuses sont caractérisées par une résistance à l’apoptose, et l’induction de l’apoptose est un mécanisme commun des médicaments anticancéreux. L’apoptose est un processus hautement régulé caractérisé par un bourgeonnement membranaire, une condensation de la chromatine et un rétrécissement cellulaire. L’un des événements les plus importants définissant le destin cellulaire est la perte de l’asymétrie phospholipidique avec l’externalisation de la phosphatidylsérine, qui fonctionne comme un signal chimique pour la phagocytose. Il a été montré que les triterpènes oléanane et ursane favorisent l’apoptose dans de nombreuses cellules cancéreuses. Dans la présente étude, les cellules de cancer colorectal et gastrique traitées avec les acides seco-triterpéniques ont montré une externalisation de la phosphatidylsérine, indiquant l’apoptose. De plus, à des degrés divers, les cellules ont perdu leur intégrité membranaire — un phénomène commun au stade tardif de l’apoptose ou à la nécrose.
La majorité des événements apoptotiques sont pilotés par les caspases. Ces membres des cystéine-protéases existent dans le cytoplasme sous forme de zymogènes. Les caspases exécutrices (par exemple, la caspase-3 et -7) catalysent la dégradation des enzymes et des protéines structurales. L’activation des caspases exécutrices est régulée par les caspases initiatrices (par exemple, la caspase-8 et -9). Il a été rapporté que les triterpénoïdes oléanane et ursane activent la voie intrinsèque de l’apoptose. De plus, les trois acides seco-triterpéniques examinés dans la présente étude ont agi comme des activateurs de la caspase-9, qui était un médiateur de la voie intrinsèque. Par conséquent, l’activation de la caspase-3, -7 et la dégradation de la PARP se sont produites dans les cellules DLD-1 et AGS. Notamment, le niveau de p53 était inchangé dans les deux lignées cellulaires ; cependant, BID était régulée à la baisse. tBID sert de commutateur pour l’activation de la voie intrinsèque par la caspase-8, qui agit à son tour comme l’intermédiaire principal de la voie extrinsèque. Il a été rapporté que les triterpènes peuvent favoriser l’apoptose via la voie extrinsèque. En effet, l’activation de la caspase-8 par les trois acides seco-triterpéniques a été observée dans la présente étude. En conséquence, l’apoptose induite par les acides seco-triterpéniques était le résultat de l’activation des voies extrinsèque et intrinsèque.
En conclusion, cette étude a montré que les acides seco-triterpéniques diminuent la viabilité cellulaire par induction de l’apoptose dans les cellules de cancer gastrique et colorectal. De plus, ces cellules cancéreuses étaient plus sensibles à la toxicité des seco-acides lorsqu’ils possédaient un C19 oxydé, par rapport aux fibroblastes normaux. À ce titre, ils pourraient être considérés pour des investigations ultérieures comme un nouveau groupe de candidats-médicaments pour le traitement du cancer colorectal.
Les phases stationnaires et les éluants utilisés en chromatographie sur colonne et en extraction étaient : gel de silice (maille 0,063–0,2 mm, Merck, Darmstadt, Allemagne) ; polyamide (Roth, Karlsruhe, Allemagne) ; n-hexane, éther diéthylique, benzène et chloroforme (Chempur, Pekary Śląskie, Pologne) ; méthanol, acétate d’éthyle et acétone (POCH, Gliwice, Pologne).
L’anticorps contre la β-actine (A2066, dilution 1:2000), les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort, anti-lapin (A9169, dilution 1:5000) et anti-souris (A9044, dilution 1:5000), et le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (Poznań, Pologne). Le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), la pénicilline, la streptomycine, le sérum de veau fœtal (FBS), le tampon phosphate salin, la trypsine et le Hoechst 33342 ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific (Varsovie, Pologne). Les anticorps contre la caspase-3 (9662, dilution 1:1000), la caspase-3 clivée (9664, dilution 1:1000), la caspase-7 (12827, dilution 1:1000), la caspase-8 (9746, dilution 1:1000), la caspase-9 (9508, dilution 1:1000), le membre de la famille des protéines Bcl-2, BID (2002, dilution 1:1000), la poly(ADP-ribose) polymérase (PARP ; 9542, dilution 1:1000) et la PARP clivée (5625, dilution 1:1000) ont été obtenus auprès de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, États-Unis). Les anticorps contre p53 (sc-126, dilution 1:1000) ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, États-Unis).
Les bourgeons de bouleau pubescent (B. pubescens Ehrh.) ont été récoltés en août 2015 sur des arbres poussant dans une zone non protégée du Parc national de Biebrza, dans le nord-est de la Pologne (53° 32’ N, 22° 43’ E). Un spécimen de référence (n° BO-17035) a été déposé à l’herbier du Département de pharmacognosie de l’Université médicale de Bialystok, Pologne. L’espèce de bouleau a été identifiée selon l’approche décrite dans [ ].
Les bourgeons de bouleau pubescent (600 g) ont été broyés et extraits par SFE au dioxyde de carbone sur un système Waters SFE-1000F-2-FMC50 (Milford, MA, États-Unis) à 40 °C et à une pression de 300 bar. Le résidu sec de la SFE a été ensuite extrait au n-hexane dans un appareil de Soxhlet. L’extrait SFE (90 g) a été soumis à une filtration sur gel Sephadex LH-20 avec une élution chloroforme:méthanol (1:1). L’extrait hexanique (210 g) a été séparé sur des colonnes de gel de silice, élué avec hexane−chloroforme, puis exposé à un gradient par paliers chloroforme−acétate d’éthyle (la procédure analytique est décrite en détail dans [ ]). Les fractions contenant des composés triterpéniques ont été soumises à une séparation supplémentaire sur des colonnes de polyamide avec du benzène−méthanol comme éluants. Après des séparations chromatographiques en plusieurs étapes et une recristallisation dans l’éthanol, l’acide 3,4-seco-urs-4(23),20(30)-dién-3-oïque pur (composé 1), l’acide 3,4-seco-oléan-4(24)-én-19-oxo-3-oïque (composé 2) et l’acide 3,4-seco-urs-4(23),20(30)-dién-19-ol-3-oïque (composé 3) ont été isolés (Figure 1). La composition des fractions collectées, ainsi que la pureté des seco-acides isolés (1–3) ont été déterminées par une méthode de chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) (pour les détails, voir les Informations supplémentaires). Les spectres de masse des seco-acides isolés, sous forme de leurs dérivés triméthylsilyl (TMS), sont également présentés en Informations supplémentaires (Figures EMS-1–EMS-3). Le Tableau S1 contient les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) du ¹³C dans le solvant chloroforme (CDCl₃) des composés obtenus, enregistrés sur un spectromètre Bruker Advance II 400 à 100 MHz. Les résultats de l’identification par RMN concordaient avec les rapports précédents. Il s’agissait de la première isolation de ces acides seco-triterpéniques à partir des bourgeons de B. pubescens.
Les cellules de cancer du sein MDA-MB-231, de cancer colorectal DLD-1, de cancer gastrique AGS, de glioblastome LN229, de cancer du col de l’utérus HeLa et les fibroblastes cutanés humains CCD-25Sk ont été obtenus auprès de l’American Type Culture Collection. Les cellules de mélanome A375 ont été achetées auprès de Sigma-Aldrich (Poznań, Pologne). Les cellules ont été cultivées dans du DMEM supplémenté avec 10 % de FBS, 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ à 37 °C. Les acides seco-triterpéniques ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et ajoutés au milieu de culture à chaque instant désigné. La concentration finale de DMSO dans le milieu pour les cellules témoins et traitées par les composés était de 0,1 %.
La viabilité des cellules a été déterminée par le test MTT. Les cellules ont été cultivées dans des plaques à 96 puits à raison de 1 × 10⁴ cellules par puits pendant 24 h, puis traitées avec les acides seco-triterpéniques. Après 24, 48 ou 72 h, une solution de MTT a été ajoutée à chaque puits et les cellules ont été incubées à 37 °C pendant 4 h. Le milieu a ensuite été retiré et les cristaux de formazan ont été dissous dans 100 μL de DMSO et 12,5 μL de tampon glycine de Sorensen sur un agitateur de plaques. La densité optique a été mesurée dans un lecteur de microplaques Asys UVM340 (Biochrom Ltd., Cambridge, Royaume-Uni) à 570 nm.
Les cellules ont été ensemencées à une densité de 1 × 10⁵ cellules par puits dans des plaques à 6 puits. Après 24 h, le milieu a été changé et les acides seco-triterpéniques ont été ajoutés pour les 24 h suivantes. Les cellules flottantes et adhérentes ont été collectées et analysées avec un Dead Cell Apoptosis Kit avec de l’annexine V-isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et de l’iodure de propidium (PI) pour la cytométrie en flux (Thermo Fisher Scientific, Varsovie, Pologne), selon le protocole du fabricant, comme décrit dans [ ]. Brièvement, les cellules ont été dispersées dans 100 μL de tampon de liaison à l’annexine contenant 5 μL de solution de conjugué annexine V-FITC, 1 μg/mL de PI et 1 μg/mL de Hoechst 33342, et incubées pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, 400 μL de tampon de liaison à l’annexine ont été ajoutés, et les cellules ont été transférées dans des plaques à 96 puits et visualisées par microscopie à fluorescence sur un système BD Pathway 855 (Becton Dickinson, San Jose, CA, États-Unis). Les cellules apoptotiques précoces montraient une fluorescence verte et bleue, tandis que les cellules apoptotiques tardives montraient une fluorescence verte, rouge et bleue.
Les concentrations de protéines dans les échantillons ont été déterminées par la méthode de Lowry et al. Les protéines ont été résolues par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), transférées sur des membranes de nitrocellulose, et sondées avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C. Ensuite, des anticorps secondaires ont été ajoutés pendant 1 h. Les signaux ont été visualisés à l’aide du réactif de chimiluminescence amplifiée (ECL) acheté auprès de GE Healthcare (Waukesha, WI, États-Unis) et enregistrés avec un BioSpectrum Imaging System (Ultra-Violet Products, Ltd., Murray, UT, États-Unis).
Les résultats ont été soumis à une analyse statistique à l’aide d’une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test de Tukey, en acceptant p < 0,05 comme différence significative par rapport aux témoins. Les valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale (IC₅₀) ont été calculées par analyse de régression non linéaire à l’aide de GraphPad Prism version 7.04 (GraphPad Software, San Diego, CA, États-Unis).