Référence : Heliyon 2022. — PMC9636486 · DOI 10.1016/j.heliyon.2022.e11183 Type : étude in vivo / in vitro (cancer du sein) · Plante : Brunelle commune · Propriété → Cancer Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Prunella vulgaris L. (P. vulgaris) est une plante herbacée vivace appartenant à la famille des Labiées et largement répandue en Chine, au Japon, en Corée et en Europe. Des monographies médicales et des études antérieures ont montré que P. vulgaris possède une activité anticancéreuse mammaire significative et que son utilisation dans le traitement du sein a une longue histoire. Cependant, les publications systématiques concernant la base matérielle et le mécanisme de l’activité anticancéreuse mammaire de P. vulgaris sont limitées. Dans la présente étude, nous avons d’abord sélectionné la meilleure fraction active parmi l’extrait brut (PVE) et les fractions éluées à l’éthanol de P. vulgaris, à l’aide des modèles cellulaires MDA-MB-231, MCF-7 et 4T1 in vitro et d’un modèle murin de cancer du sein à tumeur 4T1 transplantée chez des souris BALB/c in vivo. En outre, le mécanisme anticancéreux mammaire de la meilleure fraction active a été étudié. Les résultats ont démontré que le PVE et les fractions éthanoliques présentaient une activité anticancéreuse mammaire, en particulier la fraction éluée avec 50 % d’éthanol (PV50), qui régulait efficacement le cycle des cellules 4T1, inhibait la prolifération des cellules tumorales et favorisait l’apoptose des cellules cancéreuses. Dans les essais in vivo, PV50 a inhibé la croissance tumorale et les métastases pulmonaires, tout en induisant l’apoptose cellulaire par la promotion des lésions de l’ADN nucléaire et l’augmentation de l’expression de la caspase-3 clivée. En outre, les compositions chimiques de PV50 ont été analysées par HPLC et UPLC-MS/MS et identifiées comme étant des flavonoïdes, des triterpènes modérément polaires et une faible quantité d’acides phénoliques. PV50 pourrait être employée comme source naturelle contre le cancer du sein dans l’industrie pharmaceutique. Ces résultats fournissent une base permettant de comprendre le mécanisme de l’activité anticancéreuse mammaire de P. vulgaris.
La tradition populaire chinoise attribue le cancer du sein à l’accumulation de toxines, de chaleur, de gonflements et de stase sanguine dans l’organisme. Cette pathologie est désignée sous le nom de « roche du sein » dans les textes médicaux chinois les plus anciens. Le cancer du sein triple négatif (CSTN) est le deuxième sous-type de cancer du sein le plus fréquent dans le monde et représente environ 15 % des types de cancer du sein. Le CSTN présente un pronostic défavorable, un taux élevé de récidive, un taux élevé de métastases, une progression rapide et un faible taux de survie, ce qui en fait depuis quelques années un domaine de recherche majeur. À ce jour, la chimiothérapie cytotoxique demeure le traitement standard du CSTN et des autres cancers du sein. Actuellement, la mastectomie et la chimiothérapie offrent le meilleur pronostic de survie à long terme, mais environ 70 % des patients sont malheureusement inopérables en raison d’une croissance tumorale avancée ou de métastases osseuses. Parallèlement, l’utilisation prolongée des médicaments entraîne une pharmacorésistance et la perte de leur effet cytotoxique spécifique sur les cellules tumorales. Il est donc urgent de mettre au point de nouvelles méthodes et stratégies thérapeutiques. Les composés naturels d’origine végétale, notamment les polyphénols tels que les flavonoïdes, les tanins, la curcumine, le resvératrol et la gallocatéchine ; les composés stéroliques des brassinostéroïdes et leurs dérivés cyanosidiques ; ainsi que la vitelline, les saponines, la lignine, le pentane et le paclitaxel, présentent tous de bons effets anticancéreux, et certains ont été développés en nouveaux médicaments cliniques, notamment le paclitaxel et le docétaxel. Par comparaison avec la chimiothérapie et les autres traitements, les produits naturels présentent l’avantage d’une toxicité et d’effets indésirables moindres et sont progressivement devenus l’une des principales classes de médicaments destinés au traitement du cancer.
P. vulgaris, plante médicinale et alimentaire également connue sous le nom de brunelle commune, possède, selon les publications, un large éventail d’activités ; en médecine traditionnelle chinoise, elle est notamment utilisée pour éliminer la chaleur interne, améliorer la vue, dissiper les masses et réduire les gonflements. P. vulgaris est riche en constituants chimiques, dont les triterpénoïdes, les acides phénoliques, les flavonoïdes et les polysaccharides constituent les principaux composants actifs et exercent divers effets pharmacologiques, notamment des effets hypolipidémiants, antitumoraux, anti-inflammatoires, antioxydants et immunorégulateurs. Selon la théorie de la médecine traditionnelle chinoise, les tumeurs sont principalement des masses tangibles. Outre un traitement fondé sur les symptômes, la prise en charge doit inclure le ramollissement et la dispersion de ces masses afin de les éliminer. La méthode consistant à ramollir et à disperser les masses est également un traitement courant des tumeurs. Ces dernières années, plusieurs études cliniques ou précliniques ont montré que P. vulgaris était efficace contre le cancer du sein, le cancer du poumon, le cancer de l’œsophage, l’adénocarcinome gastrique, etc.
Les monographies médicales et les études antérieures ont montré que P. vulgaris possède une longue histoire d’utilisation pour le sein et une activité anticancéreuse mammaire clairement établie. La décoction Ruanjian Sanjie (RJSJ) est composée de Xia Ku Cao (P. vulgaris) et de trois autres plantes ; elle est traditionnellement utilisée pour ramollir les nodules durs et résorber les masses tissulaires indurées. Zhao J et ses collaborateurs ont rapporté qu’une chimiothérapie associant P. vulgaris et un taxane pouvait améliorer les effets thérapeutiques contre le cancer du sein et réduire les effets indésirables. Le polysaccharide de P. vulgaris peut inhiber les fibroblastes associés au carcinome mammaire humain en inhibant l’expression du facteur de croissance basique des fibroblastes et la croissance des cellules cancéreuses mammaires. L’activité antiproliférative du polysaccharide de P. vulgaris à 2,0 mg/mL sur la croissance des cellules humaines de cancer du sein MCF-7 était de 31,8 %. En outre, certaines études ont démontré que l’acide 19α-hydroxyursolique et la quercétine présents dans l’extrait éthanolique de P. vulgaris pouvaient inhiber de manière dose-dépendante la migration des cellules tumorales MDA-MB-231, la quercétine réduisant la prolifération des cellules tumorales par inhibition de la voie PI3K/Akt. Les CI50 de l’acide 19α-hydroxyursolique et de la quercétine vis-à-vis de la migration des cellules MDA-MB-231 étaient respectivement de 1,676 μmol·L−1 et de 1,145 μmol·L−1. Il a été montré que l’extrait méthanolique de racines de P. vulgaris exerçait de puissants effets anticancéreux sur les cellules de cancer du sein MCF-5, tant in vitro qu’in vivo, accompagnés d’une induction de l’apoptose, d’une inhibition de l’angiogenèse, d’un arrêt du cycle cellulaire et d’une modulation de la voie de signalisation PI3K/AKT. En outre, puisque la signalisation œstrogénique est essentielle à la croissance des cellules cancéreuses mammaires, des stratégies destinées à la supprimer ont été employées pour traiter les patientes atteintes d’un cancer du sein. Une étude récente a démontré que les extraits de P. vulgaris présentaient des effets antiœstrogéniques in vitro et in vivo et pouvaient être utilisés comme agents thérapeutiques pour le traitement des tumeurs œstrogénodépendantes. En résumé, P. vulgaris est une plante de la médecine traditionnelle chinoise qui offre des perspectives de recherche pour le traitement antitumoral et adjuvant du cancer du sein. Cependant, à ce jour, les recherches in vivo consacrées à l’activité anti-CSTN et au mécanisme de P. vulgaris sont relativement rares.
Dans cette étude, une résine macroporeuse D101 a été utilisée pour séparer et préparer différentes fractions de l’extrait aqueux de P. vulgaris. Un modèle murin de cancer du sein à tumeur 4T1 transplantée chez des souris BALB/c et trois modèles cellulaires de cancer du sein, dont deux modèles de CSTN, ont été utilisés pour sélectionner les groupes actifs de P. vulgaris contre le cancer du sein. Ces résultats devraient contribuer à surmonter les limitations cliniques actuelles liées au caractère mal défini de la base matérielle de l’action de P. vulgaris contre le cancer du sein et fournir une nouvelle stratégie thérapeutique contre le CSTN.
P. vulgaris a été achetée au marché de matières médicinales de Gaoqiao, à Changsha, dans la province du Hunan, en Chine. L’origine de la plante médicinale a été déterminée et authentifiée par le professeur Tasi Liu de l’Université de médecine chinoise du Hunan.
Le matériel de P. vulgaris a été réduit en poudre de 60 à 80 mesh et extrait à l’eau bouillante pendant 1 h, à trois reprises, selon un rapport masse/volume de 1:10. Les extraits ont été filtrés, réunis et concentrés sous pression réduite afin d’obtenir l’extrait aqueux de P. vulgaris (PVE).
Conformément au manuel d’instructions, après prétraitement de la résine d’adsorption macroporeuse D101, lot HG 2-885-76, achetée auprès du Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, le PVE a été successivement élué avec de l’eau et des solutions d’éthanol à 20 %, 50 % et 95 %. Le débit était d’environ 60 mL/min et chaque élution à une concentration donnée représentait cinq à six fois le volume de la colonne. Après concentration sous pression réduite, les composants élués ont été précongelés à −20 °C pendant 24 h, puis lyophilisés afin d’obtenir les poudres correspondant à la fraction éluée à l’eau (PVW), à la fraction éluée avec 20 % d’éthanol (PV20), à la fraction éluée avec 50 % d’éthanol (PV50) et au composant élué avec 95 % d’éthanol (PV95). Le rendement de chaque composant a été calculé.
Chaque fraction a été reconstituée avec 10 mL de méthanol de pureté chromatographique. Un millilitre a été prélevé, filtré à travers une membrane microporeuse de 0,22 μmol/L et utilisé pour l’analyse en phase liquide. La solution reconstituée a été diluée séparément cinq fois et centrifugée à basse température à 12 000 × g pendant 10 min ; 800 μL de surnageant ont été utilisés pour l’analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse.
Un milligramme de chacun des étalons d’acide rosmarinique, de salviaflaside, de lutéoline (B20888, pureté de 98 %, Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.), d’acide ursolique (B21403, pureté de 98 %, même fournisseur) et d’acide oléanolique (B20954, pureté de 98 %, même fournisseur) a été pesé avec précision et dissous dans 1 mL de méthanol. Des volumes de 0,2 mL des solutions d’acide rosmarinique, de pureté de 95 % et préparé au laboratoire, de salviaflaside, de pureté de 95 % et préparé au laboratoire, et de lutéoline ont été mélangés et dilués dix fois pour préparer une solution étalon mixte. Les solutions d’acide ursolique et d’acide oléanolique, à raison de 0,2 mL, ont été diluées dix fois afin de préparer respectivement les étalons d’acide oléanolique et d’acide ursolique.
Un système HPLC Waters e2695, muni d’une colonne Agilent ZORBAX SB-C18 de 4,6 × 250 mm et 5 μm, a été utilisé pour l’analyse préliminaire du PVE, de PVW, de PV20, de PV50 et de l’étalon mixte. La température de la colonne était de 30 °C, le volume d’injection de 5 μL et la longueur d’onde de 256 nm. Une solution aqueuse d’acide formique à 0,1 % constituait la phase mobile A et l’acétonitrile la phase mobile B. Les conditions précises d’élution en gradient sont présentées dans le tableau 1.
[ ]
Un système UPLC Waters Acquity, muni d’une colonne Waters ACQUITY UPLC@BEH-C18 de 2,1 × 50 mm et 1,7 μm, a été utilisé pour l’analyse préliminaire de PV95 et des étalons d’acide oléanolique et d’acide ursolique. La température de la colonne était de 30 °C, le volume d’injection de 5 μL et la longueur d’onde de 210 nm. Une solution aqueuse d’acide formique à 0,1 % constituait la phase mobile A et l’acétonitrile la phase mobile B. Les conditions précises d’élution en gradient sont présentées dans le tableau 2.
[ ]
Un système UHPLC-H-CLASS/XEVO G2-XS Qtof a été utilisé pour identifier de manière préliminaire les composants de P. vulgaris. Les conditions chromatographiques étaient les suivantes : solution aqueuse d’acide formique à 0,1 % comme phase mobile A, acétonitrile comme phase mobile B et élution en gradient de 0,00 à 4,00 min, 5,0 à 20 % de B ; de 4,00 à 8,00 min, 20 à 30 % de B ; de 8,00 à 15,00 min, 30 à 50 % de B ; de 15,00 à 20,00 min, 50 à 85 % de B ; de 20 à 22 min, 85 à 100 % de B ; de 22 à 24 min, 100 à 100 % de B ; et de 24,00 à 28,00 min, 100 à 5,0 % de B. Le débit était de 0,3 mL/min, la température de la colonne de 30 °C et le volume d’injection de 5 μL. Les conditions de spectrométrie de masse étaient les suivantes : mode d’ionisation ES− ; capillaire, 2,500 kV ; cône d’échantillonnage, 40,000 ; température de la source, 100 °C ; température de désolvatation, 400 °C ; plage de masse, 100 à 1 500 Da ; débit du gaz de cône, 50,0 L/h ; et débit du gaz de désolvatation, 800,0 L/h. La détermination préliminaire des structures a été réalisée par spectrométrie de masse primaire et multiétagée.
Les lignées de cancer du sein MDA-MB-231, MCF-7 et 4T1 ont été achetées auprès de la Banque de cellules de Shanghai, située à l’Académie chinoise des sciences, à Shanghai, en Chine. Les cellules MDA-MB-231 ont été cultivées dans du milieu complet DMEM à forte teneur en glucose contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine. Les cellules MCF-7 et 4T1 ont été cultivées dans du milieu complet RPMI 1640 contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine. Les cellules ont été cultivées à 37 °C sous 5 % de CO₂.
L’activité proliférative cellulaire a été déterminée par la méthode MTT. Les cellules en phase de croissance logarithmique, à 1 × 10⁶/mL, ont été ensemencées dans une plaque de culture à 96 puits (Beaver, 40196), à raison de 100 μL par puits, puis incubées à 37 °C pendant 24 h. Elles ont ensuite été traitées avec des concentrations croissantes des substances pendant 24 à 96 h supplémentaires. Puis 100 μL de MTT à 0,5 mg·mL−1 ont été ajoutés dans chaque puits. Les cultures ont poursuivi leur croissance pendant 4 h avant l’ajout de 150 μL de DMSO. La viabilité cellulaire relative a été calculée en mesurant l’absorbance de chaque puits à 490 nm au moyen d’un lecteur de microplaques, et les expériences ont été répétées trois fois. Le taux de survie cellulaire en réponse aux traitements et la concentration de substance inhibant la croissance cellulaire de 50 % (CI50) ont été calculés.
L’essai de formation de colonies a été réalisé selon une méthode précédemment décrite. Les cellules 4T1 en phase de croissance logarithmique ont été inoculées dans des plaques à six puits, à raison de 1,2 × 10³ cellules par puits. Après une nuit de culture, des solutions de PV50 à 62,5, 125, 250, 500 et 1 000 μg·mL−1 ont été ajoutées aux cellules du groupe traité ; du milieu complet a été ajouté au groupe témoin. Les cellules ont été traitées pendant 7 à 10 jours. Elles ont ensuite été lavées deux fois avec du PBS prérefroidi, fixées avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 1 h, colorées pendant 15 min avec une solution de violet de cristal à 0,5 %, puis lavées de nouveau avec du PBS. Le taux d’inhibition de la formation clonale a été calculé d’après le nombre de colonies de plus de 50 cellules observées au microscope. L’expérience a été répétée trois fois.
L’effet de PV50 sur la morphologie cellulaire a été observé par coloration au Hoechst 33342. Les cellules 4T1 en phase de croissance logarithmique ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits, à raison de 1,0 × 10⁵ cellules par puits, puis traitées pendant 48 h avec différentes formulations de PV50 à 62,5, 125, 250, 500 et 1 000 μg·mL−1. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS et colorées pendant 25 min avec une solution de Hoechst 33342 à 10 μg/mL. Enfin, les cellules colorées ont été lavées deux fois avec du PBS et observées par microscopie en fluorescence avec un microscope Olympus IX-70, Olympus, Japon.
Les cellules 4T1 en phase de croissance logarithmique ont été déposées dans des plaques à six puits, à raison de 1,0 × 10⁶ cellules par puits, puis traitées pendant 48 h avec des concentrations successives de PV50 de 62,5, 125, 250, 500 et 1 000 μg·mL−1. Les cellules ont ensuite été recueillies et lavées deux fois avec du PBS. Elles ont été remises en suspension dans du tampon de liaison 1×, et leur concentration a été ajustée à 1,0 × 10⁶ cellules/100 μL/test. Cinq microlitres d’annexine V et 10 μL d’IP ont été ajoutés à chaque tube, qui a été doucement agité au vortex pour assurer le mélange, puis incubé pendant 15 min à température ambiante dans l’obscurité. Après coloration, l’apoptose a été évaluée par cytométrie en flux.
Les cellules ont été recueillies, ajustées à une densité de 1,0 × 10⁶ cellules/25 cm² et cultivées pendant 24 h. Après leur adhésion, du milieu sans sérum a été ajouté pendant 24 h. Le témoin ou PV50 à 125, 250 ou 500 μg·mL−1 a ensuite été ajouté, puis incubé pendant 48 h. Les cellules traitées avec les différentes concentrations ont été dissociées et recueillies, centrifugées à 1 000 tr·min−1 pendant 5 min, puis lavées deux fois avec du PBS. Deux cents microlitres de PBS ont été ajoutés pour remettre les cellules en suspension, puis 750 μL d’éthanol absolu prérefroidi ont été lentement ajoutés goutte à goutte jusqu’à l’obtention d’une solution d’éthanol à 75 %. Les cellules ont été fixées et conservées à 4 °C pendant 2 h. Après centrifugation, l’éthanol a été éliminé et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Cent microlitres du réactif de coloration à l’IP préparé ont ensuite été ajoutés, mélangés, puis incubés dans l’obscurité à 37 °C pendant 30 min. Après coloration, la proportion de cellules dans chaque phase a été déterminée par cytométrie en flux.
L’essai de cicatrisation par rayure a été réalisé selon la procédure décrite par Razak et ses collaborateurs. Des cellules 4T1 en phase de croissance logarithmique, à raison de 5 × 10⁵ par puits, ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits. Lorsque les cellules ont atteint une quasi-confluence, un embout de pipette de 20 μL a été utilisé pour tracer trois rayures dans chaque puits. Les cellules flottantes de la couche supérieure ont été éliminées par deux lavages avec du PBS. Du milieu frais contenant ou non PV50 à 125, 250 ou 500 μg·mL−1 a ensuite été ajouté. Un microscope inversé a été utilisé pour observer la morphologie cellulaire et prendre des images à 12, 24 et 48 h. ImageJ a été utilisé pour l’analyse des données. L’expérience a été répétée trois fois.
Les expériences animales ont été conduites conformément aux directives relatives à l’expérimentation animale de l’Université de médecine chinoise du Hunan, à Changsha, en Chine. Des souris BALB/c femelles exemptes d’organismes pathogènes spécifiques, âgées de 5 semaines et pesant 18,13 ± 0,37 g, ont été achetées auprès de Slack Jingda Experimental Animal Co., Ltd., Changsha, Chine.
Avant leur récolte, les cellules 4T1 ont été cultivées dans un flacon de culture cellulaire de 75 cm² (Beaver, 40175). Lorsqu’elles ont atteint une confluence de 90 %, elles ont été trypsinisées, recueillies, rincées, puis mises en suspension dans du PBS à une concentration de 7 × 10⁶ cellules/mL. Les cellules ont été recueillies moins de 1 h avant l’établissement du modèle.
Après une semaine d’acclimatation de 60 souris BALB/c femelles âgées de 5 semaines, 50 d’entre elles ont reçu une injection sous-cutanée de 7 × 10⁵ cellules 4T1 dans du PBS au niveau de la deuxième paire de coussinets mammaires gauches ; les dix autres constituaient le groupe témoin normal (NC), sans induction tumorale. Le septième jour après l’inoculation des cellules 4T1, les souris porteuses du modèle ont été réparties aléatoirement entre les groupes témoin tumoral (TC, 0,2 mL d’eau pure), tamoxifène (Tam, 5 mg·kg−1), PV20 (300 mg·kg−1), PV50 (300 mg·kg−1), PV95 (300 mg·kg−1) et NC. Une administration intragastrique a été réalisée pendant 21 jours afin de sélectionner les composants de P. vulgaris efficaces contre le cancer du sein in vivo.
Soixante souris BALB/c femelles âgées de 5 semaines ont été acclimatées pendant une semaine. Cinquante d’entre elles ont ensuite reçu une injection sous-cutanée de 7 × 10⁵ cellules 4T1 dans du PBS au niveau de la deuxième paire de coussinets mammaires gauches ; les dix autres constituaient le groupe témoin normal (NC), sans induction tumorale. Le septième jour, les souris porteuses du modèle ont été réparties aléatoirement entre les groupes témoin tumoral (TC, 0,2 mL d’eau pure), comprimé de citrate de tamoxifène (Tam, 5 mg·kg−1), PV50 à faible, moyenne et forte dose (PV50D, 150 mg·kg−1 ; PV50Z, 300 mg/kg ; PV50G, 600 mg/kg) et NC (0,2 mL d’eau pure). Les traitements ont été administrés par voie intragastrique pendant 21 jours afin d’évaluer l’effet antitumoral de PV50 chez des souris BALB/c atteintes d’un cancer du sein 4T1.
Le poids corporel et le volume tumoral ont été enregistrés tous les trois jours. La taille des tumeurs a été mesurée à l’aide d’un pied à coulisse numérique. Le volume tumoral a été calculé selon la formule suivante : volume tumoral (mm³) = 0,5 × longueur × largeur². À la fin de l’expérience, les tumeurs et les organes correspondants — rate, cœur, foie, rein et poumon — ont été prélevés, pesés et préparés pour une coloration à l’hématoxyline-éosine à un grossissement de 200×. Le taux d’inhibition tumorale a été calculé selon la formule suivante : taux d’inhibition tumorale (%) = [(poids tumoral moyen du groupe TC − poids tumoral du groupe traité) ÷ poids tumoral moyen du groupe TC] × 100.
Un essai d’apoptose cellulaire TUNEL in situ a été utilisé pour détecter l’apoptose dans les échantillons tumoraux. Pour l’essai de marquage des extrémités libres par la désoxynucléotidyl-transférase terminale et le dUTP (TUNEL), un bloc de paraffine a été sectionné, déparaffiné et hydraté. Les coupes ont ensuite été incubées avec de la protéase K conformément aux instructions du fabricant du kit TUNEL, lot 7791-13-1, acheté auprès de Roche. Les échantillons ont ensuite été incubés avec le mélange enzymatique du kit de détection de l’apoptose, conformément au protocole du fabricant, pendant 60 min à 37 °C dans un environnement humide, puis lavés avec du PBS. Les noyaux TUNEL-positifs, correspondant à de l’ADN fragmenté, émettaient une fluorescence vert vif à 460 nm. Enfin, les noyaux ont été colorés au 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), puis rincés. Après ajout de l’agent d’extinction de fluorescence, des photomicrographies ont été obtenues au microscope à fluorescence, à un grossissement de 400×, avec une lumière bleue à 454 nm. L’indice apoptotique (IA), défini comme le pourcentage de cellules apoptotiques, a été calculé selon la formule suivante : IA (% de cellules apoptotiques) = (nombre de cellules TUNEL-positives ÷ nombre total de cellules) × 100.
Une analyse immunohistochimique des tissus tumoraux a été réalisée afin d’examiner l’activité et le mécanisme antitumoraux de PV50 in vivo. Les coupes de tissu tumoral ont été colorées avec un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la caspase-3 clivée proapoptotique (Affinity Biosciences, Cat# AF7022, RRID:AB_2835326), conformément aux instructions du fabricant. L’analyse immunohistochimique a été effectuée sur des coupes tissulaires déparaffinées et réhydratées. Du H₂O₂ à 3 % a été ajouté afin de bloquer l’activité de la peroxydase endogène. Après blocage des sites non spécifiques, les lames ont été incubées pendant une nuit à 4 °C avec l’anticorps primaire dirigé contre la caspase-3 clivée, dilué à 1:100. Après remise à température, des anticorps secondaires et tertiaires ont été ajoutés pour incubation. Après révélation au DAB, les lames ont été contre-colorées à l’hématoxyline, déshydratées et séchées, puis montées et observées avec un microscope optique droit Nikon Eclipse E100, Nikon, Japon, à un grossissement de 400×. Le logiciel ImageJ, National Institute of Health, Bethesda, Maryland, États-Unis, a été utilisé pour compter les cellules immunopositives, c’est-à-dire les cellules exprimant la caspase-3 clivée. Le résultat était exprimé en pourcentage de cellules positivement colorées : nombre de cellules positivement colorées ÷ nombre total de cellules × 100.
Des souris BALB/c femelles âgées de 33 à 37 jours ont reçu en continu 1 000 mg·kg−1 de PV50 pendant 14 jours. Leur morphologie et leur comportement ont été observés afin de déterminer la présence éventuelle d’une toxicité, et leur poids corporel a été enregistré tous les trois jours, la dernière mesure étant réalisée au quinzième jour.
Les données des expériences in vivo sont exprimées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (E.S.M.) et ont été analysées par analyse de variance à un facteur à l’aide du logiciel SPSS, version 21.0. Une valeur de p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative. Les valeurs de CI50 des échantillons ont été calculées avec le logiciel Origin, version 8.0, OriginLab Corporation, Northampton, Royaume-Uni. Le type d’inhibition et la valeur de Ki ont été analysés à l’aide du logiciel GraphPad Prism 7.0, GraphPad Software, Inc., La Jolla, Californie, États-Unis.
Parmi les fractions extraites du PVE éluées à l’aide de la résine D101, le rendement de PV20 était le plus élevé, à 4,55 %, tandis que celui de PV95 était le plus faible, à 1,09 % (tableau supplémentaire 1S).
Les résultats des analyses HPLC (figures supplémentaires 1S et 2S) et UPLC-MS/MS (figure supplémentaire 3S) ont montré que la résine macroporeuse D101 séparait et enrichissait efficacement divers composés du PVE et de PVW. Les compositions de PV20, PV50 et PV95 étaient assez différentes : PVW était principalement enrichie en composants fortement polaires ; PV20 était principalement constituée de salviaflaside, avec un temps de rétention de 7,03 min et [M−H]− 521,130, et de composés de type acides phénoliques fondés sur des isomères de l’acide rosmarinique, avec un temps de rétention de 8,10 à 8,35 min et [M−H]− 359,077 ; PV50 contenait une faible quantité d’acide rosmarinique et ne contenait pas de salviaflaside. D’après la structure déterminée par spectrométrie de masse, PV50 ne comportait pas de composés caractéristiques, mais de multiples isomères et des composés d’un même type, supposés être des flavonoïdes, des triterpènes modérément polaires et une faible quantité d’acides phénoliques. PV95 était principalement enrichie en composants triterpénoïdes polaires, tels que l’acide ursolique et l’acide oléanolique.
D’après les publications, l’extrait aqueux et d’autres composants de P. vulgaris inhibent efficacement la prolifération de diverses lignées de cellules tumorales, notamment les cellules humaines de cancer thyroïdien TPC-1 et SW579 et les cellules humaines de carcinome colique HT-29. Dans la présente étude, trois lignées de cancer du sein — MDA-MB-231, lignée humaine de CSTN ; MCF-7, lignée humaine de cancer du sein positive pour les récepteurs aux œstrogènes ; et 4T1, lignée murine de CSTN — ont été utilisées afin d’étudier les effets anticancéreux des extraits bruts et fractions de PV. La viabilité cellulaire a été observée après 24 h à différentes concentrations [ ]. L’inhibition de croissance de 50 % (CI50) a ensuite été évaluée (tableau supplémentaire 2S).
[ ] Le PVE exerçait un effet inhibiteur sur la prolifération des cellules MDA-MB-231 dans une plage donnée de concentrations. L’effet inhibiteur de PVW sur la prolifération des cellules MDA-MB-231 était faible et PVW favorisait leur prolifération aux faibles concentrations. PV20 avait le même effet que le PVE et exerçait un certain effet inhibiteur sur la prolifération. PV50 exerçait un puissant effet inhibiteur sur la prolifération des cellules MDA-MB-231, avec une CI50 de 330,66 ± 7,36 μg·mL−1. Parmi l’extrait brut et les fractions, PV95 exerçait l’effet inhibiteur le plus puissant sur la prolifération des cellules MDA-MB-231, avec une CI50 de 73,32 ± 7,45 μg·mL−1.
Pour les cellules MCF-7 [ ], le PVE exerçait un certain effet sur leur prolifération. Les composants PVW et PV20 n’inhibaient pas la prolifération des cellules MCF-7. PV50 exerçait un effet inhibiteur significatif sur leur prolifération, avec une CI50 de 596,63 ± 11,28 μg·mL−1. Parmi l’extrait brut et les fractions, PV95 exerçait l’effet inhibiteur le plus puissant sur la prolifération des cellules MCF-7, avec une CI50 de 116,73 ± 6,83 μg·mL−1.
Pour les cellules 4T1 [ ], le PVE, PVW et PV20 ne présentaient aucun effet inhibiteur manifeste sur la prolifération. PV50 exerçait un meilleur effet inhibiteur sur la prolifération et PV95, parmi l’extrait brut et les fractions, exerçait l’effet inhibiteur le plus puissant de manière dose-dépendante. PV50 présentait une plus grande activité sur les cellules MDA-MB-231 et 4T1 que sur les cellules MCF-7.
[ ]
Les tumeurs des souris et les tissus présentaient des densités similaires, et la comparaison des volumes ne pouvait pas être obtenue directement par tomodensitométrie in vivo. Un dispositif fabriqué sur place, constitué d’une spirale d’injecteur, a été utilisé pour séparer délicatement la tumeur des autres parties. La taille des tumeurs pouvait être comparée visuellement sous la lentille gauche. Les résultats [ ] ont montré que les tumeurs du groupe TC étaient les plus volumineuses, tandis que celles des groupes Tam et PV50 étaient les plus petites. En outre, la tomodensitométrie permettait d’observer des os intacts et non affectés.
[ ]
L’activité anticancéreuse mammaire in vivo de chaque fraction de PV a été évaluée en établissant un modèle de souris porteuses de tumeurs 4T1. Le volume tumoral des groupes traités était inférieur à celui du groupe témoin [ ]. Les tumeurs traitées présentaient une réduction remarquable de leur poids, en particulier dans le groupe PV50 [ ]. Les résultats ont montré que Tam, avec 45,05 ± 0,06 %, PV50, avec 62,42 ± 0,03 %, et PV95, avec 41,13 ± 0,05 %, inhibaient efficacement la croissance tumorale, PV50 étant la plus efficace (tableau supplémentaire 3S).
Les résultats de la coloration à l’hématoxyline-éosine [ ] ont indiqué que les cellules tumorales du groupe du modèle transplanté (TC) étaient étroitement disposées, croissaient vigoureusement et présentaient des atypies cellulaires, avec de grands noyaux et des nucléoles nettement visibles. Après traitement, les cellules tumorales étaient disposées de manière lâche et des cellules nécrotiques étaient observées dans les groupes Tam, PV50 et PV95. La formation de vacuoles contribue souvent à la mort cellulaire, principalement en raison de la perte d’intégrité membranaire et du détachement des cellules de leur substrat. Dans la présente étude, par comparaison avec le groupe modèle, le nombre de vacuoles augmentait, tandis que le nombre de cellules tumorales diminuait à des degrés variables dans les groupes traités par Tam, PV50 et PV50, ce qui indiquait un certain degré de mort des cellules cancéreuses. [ ] Il n’existait aucune différence significative de poids corporel entre les groupes [ ]. Après transplantation tumorale, la rate des souris était significativement hypertrophiée. Tam réduisait efficacement le rapport poids de la rate/poids corporel, et PV50 présentait une tendance à la réduction de ce paramètre [ ].
Dans la rate du groupe TC, il n’existait aucune structure complète de pulpe blanche et seules quelques hématies étaient présentes ; en revanche, un grand nombre de lymphocytes et davantage de cellules hématopoïétiques extramédullaires étaient observés dans le tissu. Dans le groupe PV50, les limites entre la pulpe rouge et la pulpe blanche étaient plus nettes, et les lymphocytes de la pulpe blanche étaient disposés de manière légèrement lâche. Un grand nombre d’hématies, davantage de lymphocytes et davantage de cellules hématopoïétiques extramédullaires étaient visibles dans la pulpe rouge. Le modèle murin de cancer du sein à cellules 4T1 transplantées présentait des caractéristiques hautement métastatiques. Les cellules tumorales des tissus pulmonaires des groupes TC, PV20 et PV95 étaient actives et un grand nombre d’hématies apparaissaient, tandis que les groupes Tam et PV50 présentaient moins de métastases [ ]. En outre, un grand nombre de substances éosinophiles en forme de gouttelettes et une faible quantité de cellules épithéliales bronchiques desquamées ont été observés dans la lumière bronchique du tissu pulmonaire du groupe NC. Dans le groupe TC et les autres groupes, la structure pulmonaire était désorganisée et celle des alvéoles et de leur paroi était mal définie. Des nodules tumoraux apparaissaient dans les groupes TC et PV95. Une infiltration lymphocytaire était présente dans la lumière des vaisseaux du groupe PV50.
[ ]
En résumé, comparées aux autres fractions, PV95 et PV50 présentaient une activité inhibitrice plus importante contre les trois lignées de cancer du sein, en particulier PV95. Cependant, dans les expériences in vivo, PV50 présentait la meilleure activité anticancéreuse mammaire. Nous avons donc sélectionné PV50 pour étudier ensuite le mécanisme moléculaire de l’action de P. vulgaris contre le cancer du sein. Le carcinome mammaire 4T1 est une lignée de cellules tumorales transplantables initialement isolée par Fred Miller et ses collaborateurs. Le modèle 4T1 fait partie des rares modèles murins de CSTN produisant spontanément, chez un hôte immunocompétent, des métastases dans les sites touchés lors du cancer du sein humain, notamment les poumons. La lignée 4T1 a été retenue pour les expériences ultérieures parce qu’il s’agit d’une lignée murine de CSTN similaire au CSTN humain de stade IV et que la transplantation orthotopique de cellules 4T1 fournit un modèle tumoral pertinent pour étudier l’efficacité de candidats médicaments ou de protocoles d’immunothérapie.
Le test MTT a été utilisé pour déterminer l’effet de PV50 sur l’activité proliférative des cellules 4T1. Après traitement par différentes doses de PV50 pendant 24, 48 et 72 h, PV50 inhibait les cellules 4T1 de manière dépendante du temps et de la dose par comparaison avec le groupe témoin [ ]. La CI50 de PV50 sur la prolifération des cellules 4T1 était de 355,83 ± 22,16 μg·mL−1 à 24 h, de 272,17 ± 15,57 μg·mL−1 à 48 h et de 200,53 ± 2,40 μg·mL−1 à 72 h [ ]. Les expériences de clonage sur plaque ont permis de vérifier davantage l’activité inhibitrice de PV50 sur la prolifération des cellules 4T1 ; les résultats ont montré que PV50 inhibait de manière dose-dépendante la formation de colonies de cellules 4T1 [ ].
[ ]
La coloration au Hoechst 33342 a été utilisée pour observer la morphologie cellulaire et analyser qualitativement l’effet de PV50 sur les cellules 4T1. À mesure que la dose de PV50 augmentait, les cellules 4T1 présentaient des caractéristiques apoptotiques [ ], notamment une coloration bleu vif intense, des noyaux condensés ou fragmentés et une réduction du volume nucléaire. En champ clair, des modifications morphologiques telles qu’une rétraction cellulaire étaient visibles. Après un traitement de 48 h par PV50, les taux d’apoptose cellulaire étaient de 2,61 ± 0,14 %, 4,03 ± 0,63 %, 6,7 ± 1,09 %, 7,4 ± 1,52 %, 12,84 ± 2,46 % et 33,61 ± 2,08 % (tableau supplémentaire 4S) et augmentaient avec les doses de PV50 [ ].
[ ]
La coloration à l’IP et la cytométrie en flux ont été utilisées pour détecter l’effet de PV50 sur le cycle des cellules 4T1. Après 48 h de traitement, la proportion de cellules 4T1 en phase G0/G1 augmentait avec les doses de PV50 par comparaison avec le groupe témoin [ ]. PV50 induisait un arrêt des cellules 4T1 en phase G0/G1 [ ].
L’essai de cicatrisation par rayure a été utilisé pour déterminer les effets de différentes concentrations de PV50 sur la migration cellulaire à 12, 24 et 48 h. Le groupe témoin approchait de la cicatrisation après 24 h. Les résultats ont montré que la cicatrisation des rayures diminuait et que l’aire de migration se réduisait à mesure qu’augmentaient les concentrations de PV50 [ ], ce qui indiquait que PV50 exerçait un meilleur effet inhibiteur sur l’activité migratoire des cellules.
Le volume tumoral des souris a été examiné par tomodensitométrie. [ ] Dans le groupe TC, la tumeur se développait vers le membre antérieur, mais son volume diminuait avec l’augmentation des doses de PV50. Les os des souris n’étaient pas significativement affectés, quel que soit le groupe. Les tumeurs traitées présentaient une réduction remarquable de leur volume [ ] et de leur poids [ ] dans les groupes Tam et PV50G (p < 0,05). Des analyses histopathologiques des tumeurs ont été réalisées dans tous les groupes expérimentaux [ ]. Dans les groupes TC et PV50D, les cellules tumorales présentaient une structure complète, une disposition compacte et des noyaux réguliers. Après traitement par Tam, PV50Z ou PV50G, une nécrose des cellules tumorales et une infiltration de cellules inflammatoires telles que des neutrophiles et des lymphocytes étaient observées. En outre, de nombreuses cellules tumorales étaient gonflées, leur cytoplasme était lâche ou vacuolisé, leur noyau était pycnotique, et une importante caryorrhexie et caryolyse étaient observées. La densité des cellules tumorales diminuait significativement avec l’augmentation de la dose de PV50.
[ ]
Le modèle murin de cancer du sein 4T1-BALB/c a produit un bon effet tumorigène. Aucun décès n’est survenu chez les souris, qui présentaient des masses palpables manifestes après 6 à 7 jours. Il n’existait aucune différence significative de poids corporel entre les groupes traités et le groupe normal [ ]. Après l’administration, les souris ont été préparées et les différents organes ont été mesurés. Les résultats ont montré qu’il n’existait aucune différence manifeste entre les cœurs des différents groupes, aucune modification structurelle manifeste du cœur et aucune métastase tumorale manifeste [ ]. En outre, les reins ne présentaient pratiquement aucune différence manifeste ni modification pathologique [ ].
Par comparaison avec le groupe normal, le foie était hypertrophié dans chaque groupe et présentait une infiltration de cellules inflammatoires, ce qui pourrait être lié à l’obstruction du retour veineux hépatique. Le groupe ayant reçu la forte dose de PV50 présentait une réduction de l’hypertrophie hépatique [ ]. Les résultats de la coloration H-E des poumons ont montré que la structure du groupe TC était désorganisée, que celle des alvéoles et de leurs parois était mal définie, qu’un grand nombre de cellules tumorales proliféraient et croissaient et qu’un grand nombre de cellules inflammatoires exsudaient. Une prolifération et une croissance importantes de cellules tumorales étaient également observées dans le groupe PV50D. La structure tissulaire du groupe traité par le médicament positif et de celui traité par la forte dose de PV50 n’était pas nette, mais le nombre de cellules tumorales métastatiques avait diminué [ ].
En général, la présence d’une tumeur peut entraîner une hypertrophie de la rate et une augmentation de l’indice splénique. L’hypertrophie splénique est associée à une augmentation de la cellularité. L’accumulation de cellules dans la rate fournit le support cellulaire permettant à celle-ci d’exercer une immunorégulation, qui est associée à l’échappement immunitaire tumoral. Certaines études ont montré que la rate est un tissu immunologique dont la taille augmente lors de différents processus inflammatoires, notamment les infections et le cancer, et qui déclenche une réponse immunitaire dirigée vers les tissus spécifiques nécessitant une réparation. Comme dans [ ], Tam et PV50G réduisaient efficacement l’indice poids de la rate/masse corporelle des souris porteuses de tumeurs, et le degré des lésions spléniques était efficacement atténué [ ]. Cela pourrait être lié à l’immunorégulation exercée par Tam et PV50. La tumeur 4T1 est hautement métastatique, les poumons et le foie constituant ses principaux organes cibles. En outre, après transplantation orthotopique dans les coussinets adipeux mammaires de souris BALB/c femelles, la tumeur 4T1 peut provoquer une splénomégalie.
[ ]
Lorsque les cellules normales entrent en apoptose, leurs caractéristiques morphologiques se modifient progressivement. Ces modifications comprennent une diminution du volume cellulaire, une rétraction cytoplasmique, une densification des noyaux et une condensation chromosomique. Les modifications de la morphologie cellulaire constituent la base permettant de déterminer si une apoptose se produit. L’apoptose a été évaluée d’après les modifications morphologiques du noyau cellulaire après coloration au DAPI. Le colorant DAPI peut traverser la membrane cellulaire intacte, puis se lier au petit sillon riche en AT de l’ADN double brin, produisant une fluorescence bleue uniforme. Lorsqu’une cellule entre en apoptose, la perméabilité et l’intégrité de sa membrane diminuent et son noyau subit une pycnose importante. La quantité de DAPI présente dans les cellules apoptotiques augmente donc, ce qui entraîne une augmentation de la surface présentant une fluorescence bleu vif. En outre, l’ADN fragmenté par l’apoptose produit une grande quantité d’extrémités cohésives 3′-OH. La coloration TUNEL permet de relier le dUTP marqué par la fluorescéine et la biotine à l’extrémité 3′-OH par l’intermédiaire de la désoxynucléotidyl-transférase terminale. Les cellules colorées par TUNEL présentent des points de forte fluorescence verte, indiquant une fragmentation de l’ADN.
Les expériences d’apoptose cellulaire TUNEL in situ ont montré qu’après la coloration TUNEL, le groupe TC ne présentait aucune fluorescence verte, tandis que le groupe PV50 et le groupe traité par le médicament positif présentaient des signes de fluorescence verte. L’intensité de la fluorescence verte du groupe PV50 augmentait avec les doses de PV50, ce qui indiquait que PV50 et les médicaments positifs induisaient la production de fragments d’ADN dans les cellules tumorales [ ]. De plus, la fragmentation de l’ADN augmentait avec la concentration de PV50. La structure cellulaire était complète et régulière dans le groupe TC. Après traitement par PV50 et coloration au DAPI, elle restait relativement complète dans le groupe PV50D. Des caractéristiques manifestes de l’apoptose, avec des modifications de la morphologie cellulaire telles qu’une condensation de la chromatine, la formation de bourgeonnements membranaires, la fragmentation du noyau cellulaire et la présence de nombreux corps apoptotiques, étaient observées dans les cellules traitées par PV50Z. Ce phénomène était particulièrement manifeste après le traitement par PV50G, dont l’effet était encore plus significatif que celui du médicament témoin positif [ ]. Sur l’image superposant les colorations TUNEL et DAPI, la position spécifique de la fluorescence verte du TUNEL coïncidait avec la condensation de la chromatine révélée par le DAPI et avec la position de la fluorescence bleue des corps apoptotiques, ce qui indiquait que PV50 induisait une fragmentation de l’ADN et une condensation chromosomique. Cela montre que PV50 induit l’apoptose des cellules murines 4T1 en provoquant une perte d’ADN nucléaire.
[ ]
Il est largement reconnu que l’apoptose joue un rôle important dans l’inhibition et la résistance au développement des tumeurs et qu’elle peut être déclenchée par des signaux provenant de l’intérieur de la cellule. Il est généralement admis que la perte du potentiel de membrane mitochondriale peut provoquer la libération de divers signaux proapoptotiques conduisant à la mort cellulaire. Les enzymes caspases contribuent à la capacité de la voie mitochondriale à réguler l’apoptose. Parmi elles, la caspase-3 est l’un des principaux effecteurs de l’apoptose.
Dans la présente étude, le tissu inclus en paraffine a été marqué avec un anticorps dirigé contre la caspase-3 clivée afin d’observer les effets de PV50 sur l’apoptose des cellules tumorales. Les résultats ont montré que la caspase-3 clivée était positive et colorée en brun [ ]. Par comparaison avec le groupe TC, les taux d’expression tissulaire de la caspase-3 clivée augmentaient avec la dose de PV50 [ ]. Cela indique que PV50 favorise l’apoptose, effet qui pourrait être lié à la caspase-3 clivée.
Pendant les 14 jours d’administration continue de PV50 à 1 000 mg·kg−1, le taux de survie des souris était de 100 %. Une augmentation progressive du poids corporel a été observée, mais les variations n’étaient pas significativement différentes de celles du groupe normal. Aucune modification physique du comportement ni du pelage des souris n’a été observée [ ].
Les remèdes à base de plantes suscitent un intérêt croissant en oncothérapie. P. vulgaris, plante couramment cultivée en Chine, en Corée, au Japon et en Europe, possède des activités anti-inflammatoires, antivirales et anticancéreuses établies. Dans quelques régions de Chine, P. vulgaris est traditionnellement utilisée pour traiter le cancer du foie. Actuellement, elle est principalement utilisée pour traiter le cancer de la thyroïde, le cancer de la gorge et le lymphosarcome, entre autres.
Dans la présente étude, les activités anticancéreuses mammaires de l’extrait aqueux et de différentes fractions de P. vulgaris éluées à l’éthanol ont été comparées in vivo et in vitro, et PV50 a été initialement sélectionnée comme la fraction présentant la meilleure activité anticancéreuse mammaire. Nos résultats montrent clairement que PV50 inhibait significativement la prolifération des cellules tumorales mammaires triple négatives, induisait l’apoptose cellulaire, régulait le cycle cellulaire et inhibait la migration des cellules tumorales in vitro. Il a été démontré que P. vulgaris induisait un arrêt du cycle cellulaire à différents points de contrôle dans les cellules cancéreuses. PV50 induisait un arrêt des cellules 4T1 en phase G0/G1. D’après les publications, après traitement de la lignée de carcinome thyroïdien SW579 par P. vulgaris, la proportion de cellules en phase G0/G1 augmentait significativement par comparaison avec le groupe témoin. L’acide ursolique de P. vulgaris pouvait bloquer en phase G1 la lignée murine de mélanome B16. Cela suggère que P. vulgaris est capable d’induire un arrêt du cycle cellulaire dans diverses lignées de cellules cancéreuses.
L’une des étapes essentielles d’une métastase réussie du cancer du sein est la migration et l’invasion des cellules cancéreuses. Les cellules migrantes peuvent devenir moins sensibles à l’apoptose et à la chimiothérapie standard. Par conséquent, la stratégie visant à prévenir les métastases en ciblant les éléments régulant les capacités migratoires et invasives des cellules cancéreuses semble prometteuse pour réduire la dissémination des cellules tumorales. L’extrait aqueux de P. vulgaris supprime l’invasion et la migration des cellules humaines du cancer du foie en atténuant l’activité des métalloprotéinases matricielles. L’acide rosmarinique, un phénylpropanoïde majeur isolé de P. vulgaris, peut inhiber significativement la viabilité, la croissance, l’invasion et la migration cellulaires ainsi que la transition épithélio-mésenchymateuse des cellules du cancer du pancréas, et induire leur apoptose.
La décoction Ruanjian Sanjie (RJSJ) est composée de quatre plantes, dont Ban Xia (Pinellia ternata), Xia Ku Cao (Prunella vulgaris), Shan Ci Gu (Cremastra appendiculata) et Hai Zao (Sargassum pallidum), et est traditionnellement utilisée pour ramollir les nodules durs et résorber les masses tissulaires indurées. RJSJ présente également une puissante cytotoxicité in vitro contre les cellules du cancer du sein en supprimant les protéines antiapoptotiques B-cell lymphoma 2 et survivine, ce qui entraîne l’activation des caspases-3/7 et de la caspase-9, ainsi que de la cascade apoptotique. La caspase-3 est un important effecteur de l’apoptose appartenant à la famille des caspases ; elle participe à l’inactivation de nombreuses protéines associées qui influent sur la structure cellulaire, le cycle cellulaire et la réparation de l’ADN, ce qui aboutit finalement à l’apoptose.
Les cellules de cancer du sein 4T1 se transplantent facilement dans le coussinet adipeux mammaire, ce qui permet de quantifier aisément la croissance et la progression tumorales. Afin de mieux déterminer l’activité de PV50 contre le cancer du sein triple négatif, un modèle murin BALB/c de cancer du sein par transplantation de cellules 4T1 a été construit. Dans la présente étude, les doses moyenne et élevée de PV50 ralentissaient le développement tumoral et réduisaient la taille des tumeurs, ce qui indique que PV50 possède une activité anticancéreuse mammaire in vivo. La coloration H-E de la structure histopathologique du cancer du sein a montré que PV50, à doses moyenne et élevée, provoquait une nécrose et une perte des cellules tumorales ainsi qu’une infiltration de cellules inflammatoires. Les cellules tumorales anormales entraînent une inhibition de l’apoptose et une prolifération cellulaire excessive, et l’induction de l’apoptose constitue une cible majeure du traitement des tumeurs. La promotion de l’apoptose des cellules du cancer du sein est également un thème majeur de la recherche anticancéreuse mammaire.
Afin de découvrir le mécanisme moléculaire de PV50 contre le cancer du sein, l’apoptose du tissu tumoral a été observée par coloration TUNEL. Les résultats ont montré que PV50 inhibait la croissance tumorale et les métastases pulmonaires, et induisait l’apoptose cellulaire chez les souris BALB/c porteuses de tumeurs transplantées. L’apoptose des cellules tumorales devenait plus importante à mesure que la dose de PV50 augmentait. Le mécanisme pourrait être lié à l’induction de lésions de l’ADN nucléaire et à l’augmentation de l’expression de la caspase-3 clivée. Après dissection des souris porteuses de tumeurs transplantées, la rate était nettement hypertrophiée et terne. Le phénomène de splénomégalie chez les souris porteuses de tumeurs est lié à l’accumulation de cellules immunosuppressives MDSC dans la rate. Cependant, le tamoxifène pouvait réduire ce phénomène chez les souris porteuses de tumeurs. En outre, les rates du groupe PV50 étaient relativement proches de la normale, ce qui indique que PV50 pourrait également jouer un rôle dans l’immunité anticancéreuse.
Les analyses HPLC et UPLC-MS/MS ont permis d’identifier dans PV50 des flavonoïdes, des triterpènes modérément polaires et une faible quantité d’acides phénoliques. Il a également été révélé que P. vulgaris pourrait activer la cascade de la caspase-3 et induire l’apoptose. Les triterpénoïdes, flavonoïdes et phénylpropanoïdes de P. vulgaris ont présenté un effet thérapeutique collectif contre le cancer, médié par de multiples voies. Il a également été montré que plusieurs composés phytochimiques de P. vulgaris, notamment l’acide oléanolique et l’acide ursolique, induisaient ou favorisaient l’apoptose des cellules cancéreuses. Les flavonoïdes totaux de P. vulgaris exercent un effet antihépatocarcinome manifeste, dont le mécanisme pourrait être lié à l’inhibition de l’autophagie et à la promotion de l’apoptose des cellules du cancer du foie.
Dans la présente étude, nous avons d’abord sélectionné la meilleure fraction active parmi l’extrait brut (PVE) et les fractions éluées à l’éthanol de P. vulgaris, à l’aide des modèles cellulaires MDA-MB-231, MCF-7 et 4T1 in vitro et d’un modèle murin de cancer du sein à tumeur 4T1 transplantée chez des souris BALB/c in vivo. En outre, le mécanisme anticancéreux mammaire de la meilleure fraction active a été étudié. Les résultats ont démontré que le PVE et les fractions éthanoliques présentaient une activité anticancéreuse mammaire, en particulier la fraction éluée avec 50 % d’éthanol (PV50), qui régulait efficacement le cycle des cellules 4T1, inhibait la prolifération des cellules tumorales et favorisait l’apoptose des cellules cancéreuses. Dans les essais in vivo, PV50 inhibait la croissance tumorale et les métastases pulmonaires et induisait l’apoptose cellulaire en favorisant les lésions de l’ADN nucléaire et en augmentant l’expression de la caspase-3 clivée. En outre, les compositions chimiques de PV50 ont été analysées par HPLC et UPLC-MS/MS et identifiées comme étant des flavonoïdes, des triterpènes modérément polaires et une faible quantité d’acides phénoliques. L’extrait aqueux de P. vulgaris et ses fractions éthanoliques pourraient être employés comme sources naturelles contre le cancer du sein dans l’industrie pharmaceutique. Ces résultats fournissent une base permettant de comprendre le mécanisme de l’activité anticancéreuse mammaire de P. vulgaris.
Hongshan Luo : réalisation des expériences ; analyse et interprétation des données.
Lingjia Zhao : réalisation des expériences ; analyse et interprétation des données ; rédaction de l’article.
Yamei Li : réalisation des expériences.
Bohou Xia : analyse et interprétation des données.
Yan Lin ; Jingchen Xie : fourniture des réactifs, des matériels, des outils d’analyse ou des données.
Ping Wu : conception et élaboration des expériences.
Duanfang Liao ; Limei Lin : conception et élaboration des expériences ; fourniture des réactifs, des matériels, des outils d’analyse ou des données.
Zhimin Zhang : analyse et interprétation des données ; rédaction de l’article.
Le Dr Zhimin Zhang a bénéficié du soutien du projet du Bureau des sciences et technologies de Changsha [kq2004061] et de la Fondation pour les jeunes chercheurs en sciences naturelles de la province du Hunan [2019JJ50449].
Yamei Li a bénéficié du soutien du Programme de recherche en médecine traditionnelle chinoise de la province du Hunan [2021056].
Limei Lin a bénéficié du soutien du Projet des talents de premier plan en innovation scientifique et technologique de la province du Hunan [2021RC4034], du Projet clé du Département provincial de l’éducation du Hunan [20A380], du Projet des équipes d’innovation scientifique et technologique du Hunan [2021RC4064] et du Projet de discipline de premier rang en pharmacologie chinoise de l’Université de médecine chinoise du Hunan [201803].
Les données sont incluses dans l’article, dans le matériel supplémentaire ou dans les références citées dans l’article.
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Aucune information complémentaire n’est disponible pour cet article.
Étude préclinique sur Prunella vulgaris L. ; le matériel végétal a été réduit en poudre et extrait à l’eau bouillante, puis fractionné sur résine D101 par élution à l’eau et à l’éthanol à 20 %, 50 % et 95 %. Étude in vitro sur les lignées mammaires MDA-MB-231 et 4T1, modèles de cancer du sein triple négatif, et MCF-7, positive pour les récepteurs aux œstrogènes ; étude in vivo chez des souris BALB/c femelles porteuses de tumeurs mammaires orthotopiques 4T1. La fraction PV50, éluée avec 50 % d’éthanol, contenait des flavonoïdes, des triterpènes modérément polaires et une faible quantité d’acides phénoliques. Elle a inhibé la prolifération des cellules 4T1 avec des CI50 de 355,83 ± 22,16 μg·mL−1 à 24 h, 272,17 ± 15,57 μg·mL−1 à 48 h et 200,53 ± 2,40 μg·mL−1 à 72 h, induit un arrêt en G0/G1, réduit la migration et augmenté l’apoptose jusqu’à 33,61 ± 2,08 % après 48 h. In vivo, PV50 a été administrée par voie intragastrique à 150, 300 ou 600 mg·kg−1 pendant 21 jours ; à 300 mg·kg−1, son taux d’inhibition tumorale était de 62,42 ± 0,03 %. Elle a réduit la croissance tumorale et les métastases pulmonaires et augmenté la fragmentation de l’ADN, l’apoptose et l’expression de la caspase-3 clivée. Une administration de 1 000 mg·kg−1 pendant 14 jours a été associée à une survie de 100 %, sans modification physique observée du comportement ou du pelage. Le niveau de preuve est préclinique, fondé sur des expériences cellulaires et un modèle murin ; aucune efficacité clinique chez l’être humain n’a été évaluée.
↩ Retour : Brunelle commune · Cancer · Index : _INDEX études brunelle commune