Référence : Frontiers in Pharmacology 2018;9:323. — PMC5897738 · DOI 10.3389/fphar.2018.00323 Type : étude expérimentale in vitro (bains d’organe : iléon de cobaye, tissus de rat, jéjunum humain) · Plante : Camomille romaine · Propriété → Digestion Accès : ⭐ libre (open access, licence Creative Commons) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels de références
[n]omis ; renvois figures/tableaux notés « [ ] ». Les mentions d’agences (EMA, pharmacopées) font partie du texte des auteurs.
Les fleurs séchées de Chamaemelum nobile (L.) All. ont été utilisées en médecine traditionnelle pour différentes affections liées au spasme du système gastro-intestinal. Cependant, il n’y a eu aucune étude expérimentale pour étayer l’effet relaxant sur le muscle lisse de cette plante. Le but de notre recherche était d’évaluer les effets de l’extrait hydroéthanolique de camomille romaine, de ses fractions, de quatre de ses flavonoïdes (apigénine, lutéoline, hispiduline et eupafoline) et de son huile essentielle sur les muscles lisses. Les compositions phytochimiques de l’extrait et de ses fractions ont été caractérisées et quantifiées par HPLC-DAD, l’huile essentielle a été caractérisée par GC et GC-MS. Les effets à médiation neuronale et sur le muscle lisse ont été testés dans des expériences en bain d’organe isolé sur des préparations de muscle lisse de cobaye, de rat et humaines. L’extrait végétal brut a induit une contraction immédiate, modérée et transitoire de l’iléon de cobaye via l’activation des neurones cholinergiques de la paroi intestinale. Les antagonistes des purinorécepteurs et des récepteurs de la sérotonine n’ont pas influencé cet effet. L’effet relaxant plus soutenu de l’extrait, mesuré après pré-contraction des préparations, était remarquable et n’était pas affecté par un antagoniste des récepteurs bêta-adrénergiques. L’activité relaxante sur le muscle lisse s’est avérée associée à la teneur en flavonoïdes des fractions. L’huile essentielle n’a montré que l’effet relaxant, sans activité contractante. L’effet relaxant sur le muscle lisse a aussi été détecté sur les tissus gastro-intestinaux de rat, ainsi que sur des préparations en bandelettes d’intestin grêle humain. Ces résultats suggèrent que l’extrait de camomille romaine a un effet relaxant direct et prolongé sur le muscle lisse de l’iléon de cobaye, lié à sa teneur en flavonoïdes. Dans certaines préparations, une stimulation transitoire des motoneurones cholinergiques entériques a aussi été détectée. L’huile essentielle a aussi eu un effet relaxant remarquable sur le muscle lisse dans ce contexte. Des effets relaxants similaires ont aussi été détectés sur d’autres préparations viscérales, y compris le jéjunum humain. Il s’agit du premier rapport sur l’activité de la camomille romaine sur les muscles lisses, qui pourrait conforter le fondement de l’usage traditionnel de cette plante dans les troubles gastro-intestinaux spasmodiques.
Chamaemelum nobile (L.) All. (Astéracées), largement connue sous le nom de camomille romaine, est une herbe vivace native du Sud-Ouest de l’Europe, mais elle est cultivée comme plante médicinale dans toute l’Europe ainsi qu’en Afrique. Les fleurs séchées de la variété cultivée à fleurs doubles de l’espèce sont officielles dans la Pharmacopée européenne. L’incorporation de la plante dans les médicaments traditionnels à base de plantes a été reconnue par l’Agence européenne des médicaments. La substance végétale fragmentée (en tisane) et un extrait liquide de la plante (solvant d’extraction : éthanol 70 % v/v) peuvent être utilisés pour le traitement symptomatique des troubles gastro-intestinaux spasmodiques légers, notamment les ballonnements et les flatulences. La Pharmacopée britannique à base de plantes indique son usage comme carminatif, anti-émétique, antispasmodique et sédatif.
La camomille romaine (CR) est utilisée comme plante médicinale depuis le Moyen Âge. La culture de la plante a commencé en Angleterre au XVIᵉ siècle. La variété double de la fleur, qui sert aujourd’hui de principale drogue commerciale, est certainement connue depuis le XVIIIᵉ siècle. La plante a gagné le nom de « nobile » (latin, noble) pour illustrer son efficacité thérapeutique supérieure à celle de Matricaria recutita L. (camomille allemande). La plante a été listée pour la première fois dans la Pharmacopée du Wurtemberg (1741) comme carminatif, antalgique, diurétique et aide digestive. Dans la médecine populaire de différentes régions d’Europe, la CR a été utilisée pour de nombreuses affections, notamment la dyspepsie, les flatulences, les nausées et vomissements, l’anorexie, les vomissements de la grossesse, la dysménorrhée, et spécifiquement pour les crampes gastro-intestinales et la dyspepsie flatulente associée au stress mental. Dans la région méditerranéenne, la tisane de CR est consommée pour améliorer l’appétit et aussi après le repas pour prévenir l’indigestion. L’usage traditionnel de la CR est largement lié à son activité supposée relaxante sur le muscle lisse.
La majorité des métabolites secondaires décrits chez la plante appartiennent aux esters aliphatiques (huile essentielle), aux lactones sesquiterpéniques et aux flavonoïdes. La teneur en polysaccharides de la fleur séchée est notable, 3,9 %. L’activité relaxante supposée sur le muscle lisse de la plante pourrait être attribuée à sa teneur en flavonoïdes. L’apigénine et la lutéoline possèdent des effets relaxants remarquables sur le muscle lisse de l’iléon de cobaye.
Bien que plusieurs études sur les bioactivités de la CR soient disponibles, la majorité de ces études ont été menées à l’aide de l’huile essentielle, qui n’est pas utilisée médicalement, ou bien les activités observées ne sont pas liées à l’usage traditionnel de la plante. Plusieurs études démontrent les effets antimicrobiens de l’huile essentielle de CR contre différentes souches bactériennes et fongiques, et une activité antifongique a aussi été démontrée pour les extraits aqueux de CR. La capacité anti-inflammatoire et les effets modulateurs des protéines de choc thermique des flavonoïdes apigénine et quercétine, ainsi que les activités anti-inflammatoires de l’α-bisabolol, du guajazulène et du chamazulène ont été rapportés dans des études précliniques. Les polysaccharides de la CR ont exercé un effet antiphlogistique (anti-inflammatoire) in vivo.
Bien que l’usage de l’extrait de CR pour les problèmes gastro-intestinaux semble lié à son effet présumé relaxant sur le muscle lisse, aucune étude in vitro ou in vivo n’a été menée jusqu’à présent pour évaluer cette bioactivité — ce qui est intéressant. Cependant, dans une étude in vitro, il a été démontré qu’un extrait aqueux de C. nobile induisait un effet vasorelaxant par la voie NO-cGMP ou possiblement par une combinaison d’inhibition des canaux Ca²⁺ plus des mécanismes modulateurs du NO et inhibiteurs des phosphodiestérases. Après l’administration orale d’extrait aqueux de CR, un effet hypotenseur significatif a été observé dans une étude animale sur des rats spontanément hypertendus, ce qui pourrait être lié à la teneur en flavonoïdes de la plante. L’efficacité clinique des préparations appliquées par voie orale n’a pas encore été étudiée ; seuls les effets de l’application externe et de l’usage aromathérapeutique ont été rapportés.
Le but de la présente étude était d’évaluer les effets d’un extrait hydroéthanolique de CR, de ses fractions et de son huile essentielle sur les muscles lisses gastro-intestinaux et urogénitaux, y compris des préparations de jéjunum humain, afin de clarifier le fondement de l’usage de cette plante pour la relaxation du muscle lisse. Les expériences ont été menées avec un extrait conforme à la monographie de l’Agence européenne des médicaments, ainsi qu’avec les fractions de cet extrait et avec l’huile essentielle de la plante.
Les fleurs de camomille romaine ont été achetées auprès de Pál Bobvos (Hongrie). L’identité du matériel végétal a été confirmée selon les exigences de la Pharmacopée européenne. Un spécimen de référence est conservé à des fins de vérification dans l’herbier du Département de pharmacognosie de l’Université de Szeged. L’huile essentielle de CR a été achetée auprès d’Aromax Ltd. (Hongrie).
Pour les expériences pharmacologiques, les médicaments suivants ont été utilisés : sulfate d’atropine (Sigma), sel de lithium d’α,β-méthylène ATP (Tocris), capsaïcine, dichlorhydrate d’histamine, indométacine, chlorhydrate d’isoprénaline, N^G-nitro-L-arginine, chlorhydrate de papavérine, prostaglandine F2α (Sigma), méthysergide (Sandoz), chlorhydrate de (±)-propranolol (Sigma), sel tétrasodique d’acide pyridoxalphosphate-6-azophényl-2′,4′-disulfonique (PPADS), tétrodotoxine (Tocris), ester 1′-butyl-4′-pipéridinylméthylique de l’acide 8-amino-7-chloro-2,3-dihydro-1,4-benzodioxan-5-carboxylique (SB204070), chlorhydrate de N-(1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-yl)-6-chloro-4-méthyl-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazine-8-carboxamide (Y25130) (tous de Tocris). Pour dissoudre et diluer ces médicaments, les solvants suivants ont été utilisés : éthanol à 96 % pour la capsaïcine, l’indométacine et la prostaglandine F2α, DMSO pour le SB204070 et solution isotonique de NaCl pour le reste des médicaments. Les solutions dans des solvants organiques ont été administrées à un maximum de 1 μl/ml, les solutions aqueuses à 1 ou 3 μl/ml de solution de bain.
Un clarificateur Millipore Direct-Q UV3 (Molsheim, France) a été utilisé pour produire l’eau purifiée pour les mesures HPLC. Le méthanol et l’éthanol (qualité HPLC LiChrosolv®) ont été obtenus chez Merck (Darmstadt, Allemagne). Pour la séparation chromatographique, ont été utilisés : polyamide (ICN Polyamide for Column Chromatography), Sephadex LH-20 (25–100 μm, Pharmacia Fine Chemicals), SiO₂ (gel de silice 60 G, 15 μm, Merck) et plaques de SiO₂ (20 cm × 20 cm, gel de silice 60 F254, Merck).
Pour les expériences pharmacologiques, l’extrait brut de CR a été préparé selon la description de la monographie de l’Agence européenne des médicaments. Dix grammes de matériel végétal ont été extraits avec de l’EtOH à 70 % (3 × 100 ml) au bain à ultrasons, évaporés sous vide et lyophilisés (rendement 3,169 %). Une partie de l’extrait brut de CR a été fractionnée pour obtenir des fractions d’extrait de CR de compositions différentes pour les expériences ultérieures. Une chromatographie liquide sous vide sur polyamide avec élution par MeOH-H₂O (20:80, 40:60, 60:40, 80:20, 100:0) a été utilisée pour obtenir les fractions de l’extrait brut comme suit : F20, F40, F60, F80 et F100.
À partir de l’extrait méthanolique de 200 g de fleurs de CR, quatre composés marqueurs (utilisés comme standards de référence dans les expériences ultérieures) ont été isolés à l’aide de la chromatographie liquide à moyenne pression (SiO₂ comme phase stationnaire), de la chromatographie sur gel (Sephadex LH-20), de l’HPLC préparative (phase inverse) et de la CCM préparative (SiO₂). La pureté et l’identité de ces composés ont été analysées par RMN. Les spectres RMN ont été enregistrés dans le MeOD sur un spectromètre Bruker Avance DRX 500 (Bruker, Fällanden, Suisse) à 500 MHz (¹H) ou 125 MHz (¹³C).
Les expériences HPLC ont été menées sur un chromatographe liquide Shimadzu LC-20AD (détecteur à barrette de diodes SPD-M20A, contrôleur CBM-20A, passeur d’échantillons SIL-20AC HT, dégazeur DGU-20A 5R, four à colonne CTO-20AC) à l’aide d’une colonne Kinetex 5 μm C-18 100A (150 mm × 4,6 mm) avec un gradient d’acide trifluoroacétique à 0,01 % dans l’H₂O (A) et d’acétonitrile (B) comme suit : 0–5 min 25 % B, 14 min 28 % B, 15 min 70 % B, 16 min 70 % B, 16,5 min 25 % B, et 20 min 25 % B. Le débit était de 1,2 ml/min, la température du four à colonne de 55 °C. La détection a été effectuée dans la plage de 190–800 nm. Pour la quantification, les chromatogrammes ont été intégrés à 344 nm. Les standards de référence et les extraits évaporés ont été dissous dans le MeOH, filtrés à travers un filtre-seringue en PTFE et injectés en volumes de 5 ou 10 μl. Des courbes d’étalonnage ont été établies pour les quatre standards de référence.
L’analyse GC a été menée avec un chromatographe en phase gazeuse HP 5890 Series II (FID), à l’aide d’une colonne capillaire en silice fondue HP-5 de 30 m × 0,35 mm × 0,25 μm. Le programme de température allait de 60 °C à 210 °C à 3 °C/min, et de 210 °C à 250 °C (maintien 2 min) à 5 °C/min. La température du détecteur et de l’injecteur était réglée à 250 °C et le gaz vecteur était le N₂, avec introduction d’échantillon en mode split. Les quantités des composants individuels de l’huile essentielle ont été exprimées en pourcentage de l’aire du pic par rapport à l’aire totale des pics de l’analyse GC/FID.
L’analyse GC-MS a été réalisée avec un spectromètre de masse à trappe d’ions de paillasse Finnigan GCQ. Toutes les conditions étaient identiques à ce qui précède, sauf que le gaz vecteur était l’He à une vitesse linéaire de 31,9 cm/s et que la colonne capillaire était une DB-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Le mode d’ionisation électronique en ions positifs a été utilisé, avec une énergie d’ionisation de 70 eV, et une plage de masse de 40–400 uma.
L’identification des composés a été fondée sur des comparaisons avec des données MS publiées et avec une recherche dans une bibliothèque informatique (la base de données était livrée avec l’instrument), et aussi en comparant leurs indices de rétention avec les valeurs de la littérature. Les indices de rétention ont été calculés par rapport aux n-alcanes C8–C32 sur une colonne CB-5 MS. Un mélange d’hydrocarbures aliphatiques a été injecté dans l’hexane (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) en utilisant le même programme de température que celui utilisé pour analyser l’huile essentielle.
Des cobayes (à poil court, colorés, 350–450 g) ou des rats Wistar (220–300 g) des deux sexes ont été tués par un coup à la tête et exsanguination. Des segments de trois centimètres de l’iléon ou du côlon distal ont été placés dans le bain d’organe en position verticale, sous une tension constante de 7 mN. Des préparations en bandelettes longitudinales (environ 2–3 cm de long) de vessie urinaire de cobaye ou de fundus gastrique de rat ont été fixées sous une tension de 5 mN.
Cette étude a été menée conformément aux directives de l’université. Le protocole a été approuvé par le Comité de bien-être animal de l’Université de Pécs (numéro d’enregistrement BA02/2000-1/2012), étant entendu que les études sur organe isolé après étourdissement de l’animal ne peuvent être considérées comme des expériences sur animaux.
Les préparations de muscle lisse ont été utilisées dans un dispositif traditionnel de bain d’organe. Les préparations ont été suspendues dans une solution de Krebs–Henseleit de 5 ou 7 ml, maintenue à 37 °C, et aérée avec un mélange de 95 % d’O₂ et 5 % de CO₂. La solution contenait 119 mM de NaCl, 25 mM de NaHCO₃, 2,5 mM de KCl, 1,5 mM de MgSO₄, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de KH₂PO₄ et 11 mM de glucose (pH = 7,4). Les mouvements des préparations ont été enregistrés avec des transducteurs isotoniques (Hugo Sachs Elektronik-Harvard Apparatus, March, Allemagne) sur des enregistreurs à encre ou stockés en ligne sur un ordinateur personnel.
L’iléon de cobaye est une préparation à faible tonus spontané. Dans une partie des expériences, les effets de l’extrait de CR, de ses fractions, de l’huile essentielle ou des flavonoïdes ont été étudiés au tonus basal. Toutes les expériences ont commencé par la détermination du spasme longitudinal maximal en ajoutant de l’histamine (10 μM) au bain d’organe pendant 2 min. Cette réponse a servi de référence pour déterminer l’amplitude relative de tout effet contractile que les échantillons à tester pourraient avoir.
Dans un autre ensemble d’expériences, l’effet relaxant possible des matériaux a été testé. Pour cette raison, une contraction tonique, approximativement demi-maximale, de l’iléon a été provoquée par une concentration modérée d’histamine (0,5 μM, ajoutée pendant 15 min). Dans les expériences préliminaires, aucun prétraitement n’a été utilisé. Dans la majeure partie des expériences, cependant, l’antagoniste des récepteurs muscariniques atropine, ainsi que la tétrodotoxine, un inhibiteur de la conduction axonale nerveuse (bloqueur des canaux Na⁺ voltage-dépendants), ont été ajoutés avant l’administration d’histamine. Cela a été fait pour éviter l’interférence avec un possible effet contractile du matériel à examiner, c’est-à-dire pour créer une situation méthodologiquement claire.
Toutes les expériences ont commencé après une période d’équilibration de 45 min. Les effets relaxants ont été étudiés sur des préparations pré-contractées (voir ci-dessous). Un spasme maximal du tissu a été évoqué pour servir de base aux comparaisons afin d’évaluer les réponses obtenues par nos matériaux de test. Les matériaux examinés ont été administrés en une concentration unique (c’est-à-dire de manière non cumulative).
Des segments macroscopiquement intacts de jéjunum humain, prélevés lors du traitement chirurgical d’un cancer du pancréas, ont été utilisés. Des bandelettes d’orientation longitudinale ou circulaire ont été préparées (la muqueuse et la sous-muqueuse ont été retirées) et fixées comme décrit ci-dessus, sous une tension de 10 mN. Des extraits lyophilisés de CR, ainsi que l’huile essentielle de la plante, ont été mélangés et davantage dilués avec du DMSO. Les quantités de DMSO administrées aux préparations de jéjunum sont indiquées dans la section « Résultats ».
Cette étude a été menée conformément à la Déclaration d’Helsinki et aux directives établies par le Comité d’éthique de la recherche, Conseil scientifique du ministère de la Santé, Hongrie. Ce Comité a accepté l’usage de tissu humain mis au rebut pour le travail expérimental. Le protocole a été approuvé par l’ETT-TUKEB [n° 17861-0/2010-1018EKU (749/PI/10)]. Tous les sujets ont donné leur consentement éclairé écrit conformément à la Déclaration d’Helsinki.
Les résultats des expériences pharmacologiques sont donnés en moyenne ± ESM (erreur standard de la moyenne), N désignant le nombre de préparations utilisées pour tester l’efficacité. Au plus 2 préparations du même animal ont été utilisées pour chaque type d’expérience. Les résultats sont fournis en valeurs relatives, où 100 % de contraction signifie le spasme maximal des préparations depuis le tonus basal et, dans les préparations pré-contractées, 100 % de relaxation signifie la relaxation de la préparation au niveau précédant l’ajout de l’agent pré-contractant. Le test U de Mann–Whitney a été utilisé pour les comparaisons de deux groupes indépendants, plus de deux échantillons indépendants ont été comparés par le test de Kruskal–Wallis, et deux échantillons dépendants ont été comparés par le test de Wilcoxon. Le programme statistique GraphPad Prism 5 a été utilisé partout. Une probabilité de P < 0,05 ou moins indiquait une significativité statistique.
Dans la plage de temps de rétention HPLC de 4–9 min, quatre pics caractéristiques ont été détectés dans l’extrait brut de CR et ses fractions F40–F100. Les composants correspondants ont été isolés du matériel végétal et identifiés comme les flavonoïdes apigénine, eupafoline, hispiduline et lutéoline par des expériences RMN ¹H et ¹³C. Ces composés ont ensuite été utilisés comme standards de référence pour caractériser les extraits de CR. L’identification des composés de référence dans les différents extraits a été fondée sur la correspondance des temps de rétention et des spectres UV. Les temps de rétention de la lutéoline, de l’eupafoline, de l’apigénine et de l’hispiduline étaient respectivement de 4,5, 5,0, 7,5 et 8,5 min. La séparation à la ligne de base de ces composés a permis leur quantification fiable dans les différents extraits.
Chromatogramme HPLC de l’extrait brut de CR avec les pics de la lutéoline (1), de l’eupafoline (2), de l’apigénine (3) et de l’hispiduline (4) (344 nm).
L’extrait brut de CR contenait l’eupafoline comme flavonoïde principal, suivie de la lutéoline, de l’hispiduline et de l’apigénine. Le fractionnement sur polyamide a donné des sous-fractions F20–F100 de compositions différentes, comme le démontrent les différences dans leur teneur en flavonoïdes. Dans F20, les quantités de flavonoïdes étaient en dessous du niveau de quantification. La teneur en flavonoïdes des fractions augmentait avec l’augmentation de la teneur en MeOH du solvant d’élution. Les niveaux de flavonoïdes les plus élevés ont été mesurés dans F80, sauf pour la lutéoline et l’apigénine, qui étaient principalement concentrées dans F100.
Teneur en flavonoïdes de l’extrait brut de CR et de ses fractions, déterminée par HPLC.
Sur la base de leurs temps de rétention et de leurs données spectrométriques de masse, l’angélate de méthallyle, l’angélate de 3-méthylpentyle et l’isobutyrate de 3-méthylamyle ont été identifiés comme les constituants majeurs de l’huile essentielle de CR (respectivement 19,0, 18,2 et 10,4 %). Les composants identifiés comprenaient 97 % de l’huile essentielle. Des articles antérieurs ont rapporté l’angélate d’isobutyle comme constituant majeur de l’huile essentielle de CR (21,6–38,5 %), suivi de l’angélate de 2-méthylbutyle (11,6–20,3 %), et du tiglate de propyle (10,8–13,1 %) ou de l’isobutyrate d’isobutyle (3,3 %) ou de l’angélate de 2-buténylé (7,9–8,4 %) ou de l’angélate de 2-méthyl-2-propénylé (9,1 %). Cependant, plusieurs échantillons commerciaux ont des compositions similaires à l’échantillon que nous avons analysé, avec l’angélate de méthallyle et l’angélate de 3-méthylpentyle comme composants majeurs.
Composition chimique de l’huile essentielle de CR.
L’extrait brut de CR a induit une contraction longitudinale transitoire sur les préparations d’iléon de cobaye. Les amplitudes des contractions étaient liées au spasme longitudinal maximal évoqué avec 10 μM d’histamine au début des expériences. La concentration seuil pour cet effet était égale ou inférieure à 20 μg/ml d’extrait (qui était la plus basse concentration testée) et atteignait un plateau avec 60 et 200 μg/ml. Les résultats quantitatifs étaient les suivants (exprimés en % du spasme maximal) : 18,8 ± 3,1 % à 20 μg/ml (N = 6), 40,1 ± 3,3 % à 60 μg/ml (N = 11), et 36,3 ± 4,9 % à 200 μg/ml (N = 7). Une seconde administration de la même concentration après une période de rinçage de 40 min avait généralement un effet qualitativement similaire. Cependant, en raison d’une reproductibilité variable, nous avons examiné les effets sur des préparations séparées avec une seule administration de l’extrait. Le solvant de l’extrait (DMSO ; 0,3 ou 1 μl/ml) n’a causé aucune ou une contraction minimale (en moyenne, 0 et 2 %, respectivement ; N = 12).
Effet contractile de l’extrait de CR (60 μg/ml, ajouté au symbole carré) sur l’iléon de cobaye. Calibrations, verticale : 50 % du spasme longitudinal maximal évoqué par l’histamine (10 μM), horizontale : 1 min.
La concentration de 60 μg/ml de l’extrait a été utilisée pour l’analyse pharmacologique. L’atropine (0,5 μM), antagoniste de l’acétylcholine aux récepteurs muscariniques, et la tétrodotoxine (0,5 μM), inhibiteur des canaux Na⁺ voltage-dépendants (donc de la conduction axonale neuronale), ont toutes deux inhibé l’effet contractile de l’extrait brut de CR. En revanche, l’antagoniste des purinorécepteurs PPADS (50 μM) ou une combinaison d’antagonistes des récepteurs de la sérotonine (5-HT) méthysergide (0,3 μM), SB204070 (1 μM) et Y25130 (1 μM) n’ont pas influencé l’effet contractile de l’extrait. Cette combinaison d’antagonistes de la 5-HT est adaptée pour bloquer l’effet contractile de la 5-HT.
Effets des médicaments sur la réponse contractile à l’extrait brut de CR (60 μg/ml) sur l’intestin grêle de cobaye (moyenne ± ESM).
Le blocage fonctionnel des neurones sensibles à la capsaïcine n’a pas inhibé l’effet contractile de l’extrait de CR par rapport aux témoins traités au solvant et appariés dans le temps. L’inhibiteur de la cyclooxygénase indométacine (3 μM) a inhibé modérément mais significativement la contraction en réponse à l’extrait de CR.
Les fractions de l’extrait de CR ont aussi été testées pour l’activité contractante. La fraction F20 a induit une contraction modérée (environ 20 % du maximum). Des résultats similaires ont été obtenus avec F40, F60, F80 et F100, bien que l’ampleur de la contraction ait tendance à diminuer avec F60, F80 et F100.
Effets contractiles des fractions d’extrait de CR sur l’iléon de cobaye (préparations orientées longitudinalement, moyenne ± ESM).
Nos expériences ont révélé l’activité relaxante sur le muscle lisse de l’extrait de CR, des fractions et de l’huile essentielle dans ce dispositif expérimental. Sur les préparations pré-contractées à l’histamine (traitées avec 0,5 μM d’histamine pendant 15 min, en présence d’atropine et de tétrodotoxine, toutes deux 0,5 μM), une relaxation concentration-dépendante a été observée en réponse au traitement par l’extrait brut de CR (60–200 μg/ml). La concentration la plus élevée testée a induit une relaxation complète. La relaxation détectée avec l’échantillon test à 20 μg/ml n’a pas dépassé les changements évoqués par le solvant lui-même (1 μl/ml de DMSO ; voir ci-dessous). Dans plusieurs cas, la relaxation était précédée d’une petite contraction. La relaxation induite par l’extrait à 60 μg/ml n’a pas été significativement altérée par l’antagoniste des récepteurs β-adrénergiques propranolol (1 μM ; 51,3 ± 7,8 % de relaxation, N = 6) ni par l’inhibiteur de la NO synthase N^G-nitro-L-arginine (100 μM ; 47,4 ± 7,4 % de relaxation, N = 10). Le solvant DMSO (0,3 ou 1 μl/ml) a eu un léger effet relaxant dans ce dispositif expérimental (iléon pré-contracté à l’histamine, prétraité à l’atropine et à la tétrodotoxine) ; il s’élevait à 3,0 ± 1,6 % à 0,3 μl/ml et 7,9 ± 1,4 % à 1 μl/ml ; N = 11 et 17, respectivement.
Effet relaxant durable de l’extrait de CR (60 μg/ml, ajouté au symbole carré) sur l’iléon de cobaye pré-contracté, en présence de tétrodotoxine et d’atropine (0,5 μM chacune). Calibrations, verticale : 100 % de relaxation depuis la ligne de base pré-contractée, horizontale : 1 min.
Effet relaxant de l’extrait brut de CR et de l’huile essentielle sur l’iléon pré-contracté.
Sur l’iléon pré-contracté à l’histamine et traité à l’atropine et à la tétrodotoxine, différentes fractions de l’extrait de CR ont montré des effets relaxants distincts. F20 et F40 (60 ou 200 μg/ml) n’ont pratiquement produit aucune relaxation (N = 5 pour les deux concentrations). Cette observation renvoie au rôle potentiel des flavonoïdes dans l’effet relaxant, et les expériences avec quatre flavonoïdes isolés du matériel végétal ont conforté cette hypothèse. Tous les flavonoïdes ont exercé un double effet sur l’iléon de cobaye, c’est-à-dire une contraction de courte durée au tonus basal et une relaxation durable sur les préparations pré-contractées à l’histamine et prétraitées à l’atropine et à la tétrodotoxine. À une concentration de 1 μM, les flavonoïdes n’ont pas exercé d’activités contractiles ; cependant, à 10 μM, un léger effet (34,6 ± 7,4 % pour l’hispiduline, 32,0 ± 3,1 % pour la lutéoline, 27,1 ± 4,2 % pour l’eupafoline et 20,5 ± 5,1 % pour l’apigénine, N = 5 chacun) a été observé. Les activités relaxantes à 2 μM allaient de 18,2 ± 5,4 % à 24,2 ± 3,7 %, tandis qu’à 20 μM entre 64,5 ± 4,1 % et 81,9 ± 5,3 %.
Effets relaxants des fractions d’extrait de CR sur l’iléon de cobaye pré-contracté (moyenne ± ESM).
Effets relaxants des flavonoïdes sur l’iléon de cobaye pré-contracté (moyenne ± ESM).
L’huile essentielle de CR (0,1, 1, 10 ou 30 μg/ml) n’a montré aucun effet contractile sur l’iléon (N = 6–8). L’huile de CR (1 ou 10 μg/ml) a induit une relaxation considérable sur les préparations pré-contractées à l’histamine et prétraitées à l’atropine et à la tétrodotoxine. Des résultats similaires ont été obtenus sur des préparations sans prétraitement à l’atropine et à la tétrodotoxine (N = 6–8, données non montrées).
La papavérine a été utilisée comme témoin positif. Comme dans les autres expériences pour étudier la relaxation, le médicament a été administré aux préparations d’iléon pré-contractées à l’histamine et traitées à l’atropine et à la tétrodotoxine, de manière non cumulative. Les réponses relaxantes obtenues étaient les suivantes : 0,3 μM : 19,7 ± 4,7 % (N = 6) ; 1 μM : 29,1 ± 3,5 % (N = 6) ; 3 μM : 30,1 ± 4,8 % (N = 7) ; 10 μM : 92,9 ± 4,2 % (N = 6), où, comme ailleurs dans cet article, la relaxation jusqu’à la ligne de base pré-histamine a été prise comme 100 %.
Les effets de l’extrait de CR et de l’huile essentielle ont aussi été testés sur des bandelettes de vessie urinaire de cobaye. L’extrait brut de CR a évoqué une contraction concentration-dépendante à 20 et 200 μg/ml. Le solvant de l’extrait n’a eu aucun effet contractile sur la vessie (N = 4). L’effet de l’extrait à 200 μg/ml a été diminué (approximativement de moitié) par un prétraitement à la capsaïcine in vitro. Les réponses contractiles ont été comparées au spasme maximal évoqué par 100 mM de KCl à la fin de l’expérience.
Effet contractile de l’extrait de CR sur une bandelette de vessie urinaire de cobaye, sans prétraitement et après traitement à la capsaïcine ou à son solvant (moyenne ± ESM).
Contraction, en réponse à 200 μg/ml d’extrait de CR (ajouté au symbole carré), sur la bandelette de détrusor de vessie urinaire de cobaye. Calibrations, verticale : 50 % du spasme maximal en réponse à 100 mM de KCl, horizontale : 1 min.
Pour étudier l’effet relaxant de l’extrait brut, les bandelettes de vessie ont été pré-contractées de manière sous-maximale avec de l’histamine (1–3 μM). L’atropine et la tétrodotoxine étaient présentes dans le liquide de bain. Puisque des mécanismes purinergiques excitateurs sont présents dans la vessie, une désensibilisation à l’α,β-méthylène ATP (10 + 10 μM pendant 10 min chacune) a aussi été réalisée. L’extrait brut de CR n’a eu aucun effet à une concentration de 20 μg/ml, tandis qu’une concentration de 200 μg/ml a induit 58,3 ± 4,6 % de relaxation (N = 7 et 8, respectivement). Le solvant lui-même (1 μl/ml de DMSO) n’a exercé aucun effet.
L’huile essentielle de camomille romaine n’a causé aucune contraction à une concentration de 10 μg/ml. De manière similaire à l’extrait, l’huile de CR a exercé un effet relaxant modéré sur la vessie pré-contractée : 17,9 ± 6,1 % et 34,1 ± 5,8 % de relaxation ont été évoqués avec 1 et 10 μg/ml, N = 7 et 6, respectivement.
L’effet relaxant de l’huile essentielle de CR a été confirmé sur des préparations orientées longitudinalement du tractus gastro-intestinal de rat. Les préparations d’iléon entier et de côlon distal de rat sont caractérisées par un tonus intrinsèque élevé, aucune pré-contraction n’était donc nécessaire. L’huile de CR (10 μg/ml) a induit une relaxation (41,4 ± 7,4 % et 21,8 ± 3,7 %, N = 7 et 10, respectivement, sur ces préparations, où 100 % signifie la réponse relaxante à 3 μM d’isoprénaline, donnée à la fin de l’expérience). Une concentration de 1 μg/ml était à peine efficace. Aucun effet contractile n’a été observé. Les bandelettes de fundus gastrique de rat ont été pré-contractées avec 0,1–0,3 μM d’acétylcholine. L’huile de CR a produit une relaxation (en moyenne 44 et 70,3 % de relaxation en réponse à des concentrations de 1 et 10 μl/ml, N = 4 chacun, où 100 % signifie la relaxation jusqu’au niveau pré-acétylcholine).
Dans les préparations jéjunales humaines non traitées orientées longitudinalement, l’extrait brut de CR a induit une contraction transitoire s’élevant à 12,4 ± 3,5 % et 30,5 ± 0,6 % aux concentrations de 20 et 200 μg/ml, respectivement (N = 8). Les préparations prétraitées à l’atropine et à la tétrodotoxine ont été pré-contractées avec de la PGF2α (1 ou 2 μM). L’extrait de CR a montré un effet relaxant concentration-dépendant (25,8 ± 4,3 % à 20 μg/ml, N = 8 ; 68,5 ± 8,5 % à 60 μg/ml, N = 7 ; 50,8 ± 3,7 % à 200 μg/ml, N = 9). L’huile essentielle de CR n’a produit aucune contraction. Un effet relaxant durable a été détecté sur les préparations pré-contractées (en présence d’atropine et de tétrodotoxine). L’effet relaxant a atteint 26,9 ± 5,2 % à 1 μg/ml et 81,4 ± 8,2 % à 10 μg/ml (N = 8 et 7, respectivement).
Dans les préparations jéjunales humaines non traitées orientées circulairement, l’extrait brut de CR a évoqué une contraction transitoire (43,4 ± 10 % à 200 μg/ml, N = 5), tandis que l’échantillon à la concentration de 20 μg/ml a eu un effet négligeable (2,8 % de contraction sur 5 préparations). L’extrait de CR a induit une relaxation dans les préparations pré-contractées à la PGF2α (en présence d’atropine et de tétrodotoxine). Cet effet a atteint 45 % avec la concentration de 60 μg/ml (N = 4), tandis qu’une concentration de 200 μg/ml a produit une relaxation complète (N = 6), où une relaxation jusqu’au niveau pré-prostaglandine a été prise comme 100 %.
Le solvant lui-même (1 μl/ml de DMSO) n’a évoqué ni contraction ni relaxation sur cette préparation (N = 4–6).
Les expériences présentées ici ont été menées avec la CR, qui a été utilisée traditionnellement pour le traitement symptomatique des troubles gastro-intestinaux légers, spasmodiques et autres ; cependant, l’effet présumé relaxant sur le muscle lisse n’avait pas été confirmé expérimentalement. Le but de notre étude était d’étudier l’effet d’un extrait de la plante traditionnellement utilisé, de ses fractions et de l’huile essentielle de la plante, ainsi que de quatre de ses composants flavonoïdes.
L’analyse phytochimique de l’extrait a révélé la présence de flavonoïdes dans la plante, dont quatre (apigénine, lutéoline, eupafoline et hispiduline) ont été isolés et identifiés. L’extrait hydroéthanolique a été fractionné sur polyamide pour obtenir des fractions à teneur en flavonoïdes différente afin d’examiner le rôle de ces composés dans l’effet sur les muscles lisses. La teneur en flavonoïdes de l’extrait et des fractions a été analysée par HPLC. La teneur en flavonoïdes de l’extrait a été fractionnée avec succès, les fractions F80, F100 (et dans une certaine mesure F60) contenant des quantités plus élevées de flavonoïdes que les extraits bruts. Le profil flavonoïdique des fractions différait aussi. L’huile essentielle que nous avons analysée appartient au chémotype caractérisé par la prédominance de l’angélate de méthallyle.
Des expériences pharmacologiques ont été menées avec l’extrait hydroéthanolique, ses fractions (F20, F40, F60, F80 et F100), quatre flavonoïdes (apigénine, eupafoline, hispiduline et lutéoline) et l’huile essentielle de la plante sur différents muscles lisses in vitro. L’extrait hydroéthanolique de CR a des effets à la fois stimulateur et relaxant sur l’iléon de cobaye. L’activité stimulatrice modérée et transitoire résulte de l’activation des neurones cholinergiques, comme confirmé par son inhibition par la tétrodotoxine (inhibiteur des canaux Na⁺ neuronaux voltage-dépendants) et l’atropine (antagoniste des récepteurs muscariniques de l’acétylcholine). Bien que la capsaïcine, stimulant d’une certaine classe de récepteurs sensoriels (par lesquels elle évoque une réponse « efférente locale »), montre un effet cholinergique neurogène similaire dans les préparations d’intestin grêle de cobaye, un blocage fonctionnel des terminaisons nerveuses sensibles à la capsaïcine par prétraitement à la capsaïcine n’a pas inhibé l’action contractile de l’extrait de CR. L’action contractile de l’extrait de CR a été modérément, mais significativement réduite par l’inhibiteur de la cyclooxygénase indométacine, ce qui peut indiquer un rôle modulateur des prostanoïdes endogènes. Les autres inhibiteurs pharmacologiques testés n’ont eu aucun effet réducteur de la contraction ; il est donc proposé que ni la sérotonine endogène, ni les mécanismes purinergiques sensibles au PPADS ne jouent de rôle dans l’action excitatrice de l’extrait de CR. Il convient de noter que la sérotonine et l’ATP ou l’agoniste des récepteurs P2X α,β-méthylène ATP sont tous capables d’évoquer des contractions cholinergiques dans l’iléon de cobaye.
Après l’effet stimulant transitoire et léger à modéré, l’extrait brut de CR a présenté un effet relaxant soutenu sur l’iléon de cobaye en présence de tétrodotoxine et d’atropine, et les expériences préliminaires ont indiqué un effet relaxant similaire aussi en l’absence d’atropine et de tétrodotoxine. Cependant, l’atropine et la tétrodotoxine ont été incluses dans ces expériences pour créer une situation méthodologiquement claire, où une action excitatrice initiale, à médiation neuronale, n’interférerait guère avec l’action relaxante. Les concentrations de l’extrait causant la relaxation étaient à peu près les mêmes que celles causant la contraction. Sur la base de ces données, nous proposons que le site d’action de l’effet relaxant de la CR se situe sur le muscle lisse lui-même. Ni l’antagoniste des récepteurs β-adrénergiques propranolol ni l’inhibiteur de la NO synthase N^G-nitro-L-arginine n’ont réduit significativement l’effet relaxant de l’extrait de CR ; aucune preuve n’a donc été trouvée de l’implication de ces mécanismes dans la réponse relaxante. En fait, un effet relaxant direct de l’extrait a été démontré sur toutes les préparations gastro-intestinales testées, y compris les préparations gastro-intestinales humaines et de rat, ainsi que sur la vessie de cobaye. Dans les préparations à tonus intrinsèque élevé (iléon et côlon de rat), l’activité relaxante était pratiquement la seule réponse observée.
Différentes fractions de l’extrait de CR ont évoqué à la fois contraction et relaxation sur l’iléon de cobaye. Alors qu’il y avait une nette corrélation de tendance entre la teneur en flavonoïdes et l’effet relaxant, dans le cas de l’action contractile une telle corrélation n’a pas été observée (au contraire, les fractions à plus faible teneur en flavonoïdes exerçaient des activités contractiles légèrement plus élevées). Les fractions à haute teneur en flavonoïdes (F60, F80 et F100) avaient des effets relaxants remarquables, tandis que les fractions sans (F20) ou à faible (F40) teneur en flavonoïdes n’exerçaient pas une telle activité. Les flavonoïdes purs de l’extrait ont montré des effets doubles sur l’iléon de cobaye, très similairement à l’extrait brut. De plus, il n’y avait pas de différence substantielle entre les puissances des flavonoïdes. Cela signifie que n’importe lequel de ces flavonoïdes peut contribuer à l’effet relaxant soutenu et à l’effet contractile transitoire de l’extrait. L’huile essentielle de CR n’a causé aucune contraction sur les préparations de test ; néanmoins, un effet relaxant constant a été détecté. Cela semble indiquer que (i) les composants chimiques responsables de l’effet stimulant peuvent être absents de l’huile essentielle ; (ii) il se peut que plusieurs types de composés présents dans l’extrait soient responsables de l’action relaxante sur le muscle lisse. Ce point doit être clarifié dans des expériences ultérieures.
La contraction de la vessie de cobaye en réponse à l’extrait de CR s’est avérée particulière, en ce qu’elle a été réduite de moitié après un prétraitement à la capsaïcine in vitro. Cela indique que les nerfs sensoriels sensibles à la capsaïcine de la paroi vésicale sont d’une certaine manière impliqués dans l’effet excitateur de l’extrait de CR. Néanmoins, l’extrait et l’huile de CR ont aussi induit une relaxation de la vessie dans les préparations pré-contractées.
L’extrait de camomille romaine a aussi été efficace sur les préparations jéjunales humaines. Un effet à la fois excitateur et un effet relaxant résistant à la tétrodotoxine et à l’atropine ont été démontrés, là encore l’effet relaxant sur le muscle lisse étant plus soutenu que l’effet excitateur. Des expériences préliminaires ont montré que cette contraction précoce est réduite par l’atropine. En raison d’un accès limité au tissu humain, aucune analyse plus poussée de ces réponses n’a pu être réalisée.
En termes d’usages médicaux possibles, on peut noter qu’une combinaison d’un effet excitateur léger à modéré à médiation nerveuse et d’une action relaxante sur le muscle lisse peut même être avantageuse pour certains problèmes gastro-intestinaux, par ex. une activité péristaltique diminuée, tandis que pour les spasmes de l’estomac ou du gros intestin, c’est évidemment l’activité relaxante sur le muscle lisse qui offre des bénéfices.
Nos résultats soutiennent l’effet relaxant global sur le muscle lisse d’un extrait hydroéthanolique de CR et de l’huile essentielle de CR. L’effet prédominant de l’extrait, de ses fractions et des flavonoïdes est la relaxation, plus soutenue que la contraction transitoire observée dans certains cas. Cette activité est en corrélation avec la teneur en flavonoïdes de l’extrait. Puisque les composants de l’huile essentielle sont en partie extraits avec les alcools, les constituants de l’huile contribuent aussi à l’effet global de l’extrait hydroéthanolique de CR. L’extrait utilisé dans nos expériences a été préparé conformément à la monographie de l’Agence européenne des médicaments pour cette plante ; notre étude contribue donc au corpus de preuves relatives à l’usage traditionnel de cette plante.
Ce que l’étude établit : validation expérimentale (1re du genre) de l’effet relaxant sur le muscle lisse de la camomille romaine → fonde son usage traditionnel dans les troubles digestifs spasmodiques (crampes, ballonnements, flatulences). Effet relaxant direct sur le muscle (pas via β-adrénergique ni NO), corrélé aux flavonoïdes (apigénine, lutéoline, hispiduline, eupafoline) ; l’HE (angélates) relaxe aussi. Un effet contractile bref et modéré (via neurones cholinergiques) précède parfois la relaxation. Confirmé sur iléon/vessie de cobaye, tube digestif de rat, et jéjunum humain. Niveau de preuve : préclinique in vitro (organe isolé), incluant du tissu humain ; pas d’essai clinique oral. ↩ Retour : Camomille romaine · Digestion · Index : _INDEX études camomille romaine (accès libre)