Référence : Plants 2022. — PMC9415533 · DOI 10.3390/plants11162114 Type : Article de recherche original (phytochimie · pharmacologie) · Plante : Cataire · Propriété → Antimicrobien Accès : ⭐ libre (CC BY 4.0) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Ce rapport résume l’analyse de la composition chimique des extraits méthanoliques de fleurs, de feuilles et de tiges de Nepeta cataria L. (respectivement FME, LME, SME) ainsi que leurs propriétés hépatoprotectrices et antigénotoxiques in vivo et in silico. Ici, l’intoxication du foie de rats Wistar par le CCl4 a entraîné la génération de radicaux trichlorométhyle et trichlorométhylperoxyle, provoquant la peroxydation lipidique au sein des membranes des hépatocytes (c’est-à-dire l’hépatotoxicité), ainsi que la formation subséquente d’adduits d’ADNr aberrants et la cassure double-brin consécutive (à savoir la génotoxicité). Les FME, LME et SME examinés, administrés par voie orale aux rats Wistar avant l’injection de CCl4, ont exercé les propriétés pharmacologiques les plus notables aux concentrations respectives de 200, 100 et 50 mg/kg de poids corporel. Ainsi, les propriétés hépatoprotectrices des extraits ont été déterminées en surveillant les activités catalytiques des enzymes et les concentrations d’espèces oxydatives réactives, modulant le statut redox du foie. En outre, la nécrose des hépatocytes a été évaluée au moyen des activités catalytiques des marqueurs de toxicité hépatique. Les propriétés antigénotoxiques des extraits ont été quantifiées à l’aide du test des comètes. Des propriétés pharmacologiques distinctes peuvent être attribuées à la quercitrine (8406,31 μg/g), à l’acide chlorogénique (1647,32 μg/g) et à l’acide quinique (536,11 μg/g), trouvés dans le FME, à l’acide rosmarinique (1056,14 μg/g) et à l’acide chlorogénique (648,52 μg/g), présents dans le LME, et à l’acide chlorogénique (1408,43 μg/g), le plus abondant dans le SME. Ainsi, les métabolites secondaires de la plante ont été administrés individuellement, de manière analogue aux extraits, à la suite de quoi leur pharmacologie in vivo a été élucidée in silico au moyen d’études fondées sur la structure au sein de la catalase de rat, en tant que marqueur redox, et de la topoisomérase IIα de rat, une enzyme catalysant la cassure double-brin de l’ADN de rat. En conclusion, les extraits de N. cataria examinés, à des concentrations spécifiées, pourraient être utilisés en thérapie clinique pour la prévention des maladies hépatiques induites par les toxines.
Nepeta représente un grand genre appartenant à la famille des Lamiaceae, sous-famille des Nepetoideae et tribu des Mentheae « [ ] ». Ce genre comprend environ 300 espèces, dont la majorité sont des plantes aromatiques. Plusieurs espèces de ce genre ont été rapportées comme possédant des propriétés médicinales telles que diurétique, sédative, diaphorétique, antispasmodique, antiasthmatique, expectorante, fébrifuge, antitumorale, antibactérienne, antifongique et emménagogue. Des analyses phytochimiques antérieures de Nepeta ont révélé la présence de plusieurs composés phytochimiques bioactifs, tels que des polyphénols (composés phénoliques et flavonoïdes), des terpénoïdes, des iridoïdes et des glycosides iridoïdes. Les polyphénols, c’est-à-dire des produits naturels du métabolisme secondaire des plantes, ont montré un large éventail d’activités biologiques telles qu’analgésique, anti-arthritique, antimicrobienne, antipyrétique, anti-inflammatoire, hépatoprotectrice et antithrombotique. En raison de leurs effets thérapeutiques potentiels sur la santé ainsi que de leur usage dans l’alimentation humaine, ces entités chimiques ont attiré une attention considérable au sein de la communauté scientifique. Plus de vingt dérivés phénoliques et trente-cinq flavonoïdes et leurs dérivés ont été isolés à ce jour de diverses espèces de Nepeta.
Nepeta cataria L. (cataire ou herbe-aux-chats) est utilisée depuis longtemps en médecine traditionnelle en France, en Angleterre et dans certaines régions d’Amérique du Nord, sous forme de tisanes et d’infusions, pour traiter la nervosité, l’anxiété, l’insomnie et les symptômes liés aux troubles gastro-intestinaux, y compris la dyspepsie, les crampes et le météorisme. De plus, elle est associée à un effet diurétique prévenant la rétention d’eau, ainsi qu’à la prise en charge de l’arthrite, de la toux, de l’urticaire, des fièvres et des virus. En raison de ces propriétés, la plante est largement utilisée pour ses effets antispasmodique, expectorant, diurétique, antiseptique et antiasthmatique. Une application intéressante de N. cataria est son usage dans les jouets pour animaux de compagnie, étant donné que la cataire altère le comportement et produit des sensations agréables tant chez les chats sauvages que domestiques, ainsi que chez d’autres mammifères. Une étude a également associé les feuilles séchées à des expériences agréables de la cataire chez l’humain.
Compte tenu du fait que bon nombre des substances toxiques environnementales, médicaments et nutriments ingérés ou inhalés subissent l’effet de premier passage, la fonction hépatique peut être altérée par une exposition aiguë ou chronique à des entités chimiques dangereuses. Les activités biologiques et les applications thérapeutiques des extraits de plantes et des métabolites secondaires purifiés attirent l’attention depuis des décennies ; néanmoins, les études toxicologiques, hépatoprotectrices et de protection de l’ADN doivent encore être approfondies. Il existe un intérêt croissant pour les rôles hépatoprotecteur et antigénotoxique des extraits d’origine végétale ou de leurs substances isolées. En conséquence, dans ce rapport, les effets hépatoprotecteurs et antigénotoxiques des extraits méthanoliques de la plante N. cataria ont été évalués sur des rats Wistar exposés au tétrachlorure de carbone (CCl4). À la connaissance des auteurs, une telle investigation n’a jamais été rapportée. Les extraits méthanoliques de N. cataria ont été entièrement caractérisés et se sont révélés associés à dix-huit métabolites secondaires : acide quinique, acides phénoliques (ou leurs dérivés) et aglycones flavonoïdiques (ou leurs glycosides), qui ont été quantifiés par LC-ESI-MS/MS, et leurs effets ont été étudiés in vivo et interprétés au moyen d’études in silico.
En accord avec la composition qualitative précédemment publiée des parties aériennes de N. cataria, dix-sept composés phénoliques et l’acide quinique (un intermédiaire de la biosynthèse des composés phénoliques de la plante) ont été sélectionnés comme étalons « [ ] » pour l’investigation quantitative des extraits méthanoliques de fleurs (FME), de feuilles (LME) et de tiges (SME) « [ ] » au moyen de l’analyse LC-ESI-MS/MS. Les concentrations des composés, exprimées en μg de composé par g d’extrait, ont été déterminées à partir des courbes d’étalonnage des standards, préparées au moyen d’une méthode de double dilution (de 50,00 à 0,00153 μg/mL). Les résultats des analyses qualitatives et quantitatives ont montré que tous les étalons utilisés ont été retrouvés dans les différents échantillons d’extraits de parties aériennes de la plante, et qu’aucun autre composant inconnu n’a été détecté « [ ] ».
Au sein de la classe des flavonoïdes, le flavonol quercétine, aux côtés de ses trois glycosides — la quercitrine, la quercétine-3-O-glucoside et la quercétine-3-O-rutinoside — a été observé dans des quantités respectives de 88,97, 8406,31, 72,97 et 86,55 mg/g. Notamment, la quercétine-3-O-rutinoside a presque atteint la quantité de son aglycone. Les flavonols isorhamnétine et kaempférol ont été trouvés dans des quantités respectives de 107,53 et 90,03 mg/g, tandis que le kaempférol-3-O-glucoside était présent à des concentrations près de quatre fois plus élevées (409,21 mg/g) par rapport à son aglycone. La flavone lutéoline ainsi que sa 7-O-glucoside étaient les constituants mineurs du FME (respectivement 6,12 et 7,64 mg/g). Parmi les acides phénoliques, l’acide chlorogénique et l’acide rosmarinique ont été identifiés à de fortes concentrations (respectivement 1647,32 et 326,15 mg/g). D’autres acides phénoliques étaient présents dans la gamme de concentration de 15,93 à 138,21 mg/g « [ ] ».
Au sein du LME, le kaempférol-3-O-glucoside et la quercétine-3-O-glucoside ont été observés comme flavonoïdes majeurs (respectivement 374,13 et 354,33 mg/g). Parmi les aglycones flavonoliques quantifiés, l’isorhamnétine, le kaempférol et la quercétine étaient présents à des concentrations notables (respectivement 175,34, 82,87 et 78,33 mg/g), tandis que les flavones lutéoline et lutéoline-7-O-glucoside ont été trouvées en faibles quantités (respectivement 4,13 et 5,43 mg/g). Parmi les acides phénoliques, les acides rosmarinique et chlorogénique ont été identifiés comme les plus abondants (respectivement 1056,14 et 648,52 mg/g), tandis que, parmi les acides phénoliques distincts, les acides p-hydroxybenzoïque et protocatéchique ont été observés en quantités relativement plus faibles (respectivement 363,32 et 261,42 mg/g) « [ ] ».
À l’intérieur du SME, le kaempférol-3-O-glucoside était le flavonol le plus abondant (168,54 mg/g). De plus, la quercétine, l’isorhamnétine, la quercétine-3-O-rutinoside et la quercétine-3-O-glucoside ont été trouvées en quantités significatives (respectivement 94,54, 117,24, 114,01 et 87,97 mg/g), tandis que d’autres flavonoïdes ont été identifiés, allant de 1,02 à 67,25 mg/g. L’acide chlorogénique a été identifié à de fortes concentrations (1408,43 mg/g). D’autres acides phénoliques ont été trouvés dans la gamme de 30,32 à 250,54 mg/g. Les résultats de l’analyse quantitative des composés phénoliques présents dans les tiges ont montré que, hormis le cas de l’accumulation d’acide chlorogénique (en tant que constituant principal), les concentrations des autres composés étudiés sont plus faibles que dans les fleurs et les feuilles « [ ] ».
De manière générale, on pourrait anticiper que les propriétés physiologiques du FME pourraient être attribuées aux composés les plus abondants : la quercitrine, l’acide chlorogénique et l’acide quinique « [ ] ». De manière analogue, l’acide rosmarinique et l’acide chlorogénique pourraient être les principaux acteurs dans le LME « [ ] ». En ce qui concerne le SME, l’acide chlorogénique était le composé dominant et pourrait par conséquent être supposé comme le composé principalement responsable de son activité biologique « [ ] ».
D’après une revue de la littérature, il a été constaté que les extraits riches en polyphénols ont montré une activité antigénotoxique. Cependant, pour atteindre l’ADN, les ingrédients actifs des plantes médicinales doivent franchir la barrière hépatique, pour laquelle la réponse physiologique initiale d’un organe se produit en termes de potentiel hépatoprotecteur. Ainsi, avant toute activité antigénotoxique, le potentiel hépatoprotecteur d’un extrait donné doit être évalué au moyen des capacités antioxydantes des composés qu’il contient (acides phénoliques et flavonoïdes), soit en contrant les dommages hépatiques, en interférant avec les enzymes de métabolisation et de réparation des médicaments, soit en interagissant avec des molécules de signalisation importantes pour la survie cellulaire. Ficus gnaphalocarpa, doté d’une activité hépatoprotectrice in vitro, a montré un fort effet de la quercitrine dans la réduction de la perturbation induite par le CCl4 des lignées cellulaires d’hépatome humain HEPG2, grâce à sa capacité à prévenir la mort des cellules hépatiques et la fuite de lactate déshydrogénase dans le milieu. L’acide chlorogénique a été observé à forte concentration dans l’extrait de concombre de mer et a réduit significativement les lésions hépatiques induites par le thioacétamide chez le rat, tandis que l’acide rosmarinique, en tant que composé majeur de Perilla frutescens, a diminué les dommages hépatiques oxydatifs induits par l’hydroperoxyde de tert-butyle (t-BHP).
Par conséquent, d’autres expériences ont été orientées vers la création du scénario physiologique de traitement des rats Wistar adultes (Rattus norvegicus, ci-après désigné par le préfixe « r » pour toutes les données rapportées) avec le CCl4, une entité chimique dangereuse utilisée pour induire de graves implications tant sur la membrane que sur le génome « [ ] », et pour révéler les propriétés hépatotoxiques/hépatoprotectrices initiales « [ ] » des extraits et des constituants chimiques trouvés « [ ] », ainsi que les propriétés génotoxiques/antigénotoxiques associées « [ ] ». Dans toutes les expériences, le groupe témoin était composé d’animaux d’expérience traités par voie intrapéritonéale (i.p.) avec de l’huile d’olive vierge (ici disponible dans le commerce, 1 mL/kg de poids corporel), en raison de la capacité d’un tel mélange à diminuer les dommages hépatiques chez le rat causés par le CCl4.
Ainsi, pour déterminer les propriétés hépatotoxiques « [ ] : groupes III–V » et génotoxiques « [ ] : groupes III–V » des extraits définis ci-dessus, ceux-ci ont été administrés par voie orale à des rats Wistar adultes, à raison de 200 mg/kg de poids corporel, par comparaison avec le CCl4 appliqué par voie intrapéritonéale (i.p.) « [ ] : groupes II » ou l’huile d’olive « [ ] : groupes I ». Les métabolites secondaires purs « [ ] » et leurs propriétés ont également été étudiés en parallèle « [ ] ». En outre, pour élucider l’effet hépatoprotecteur « [ ] : groupes VI–XIV » et/ou antigénotoxique « [ ] : groupes VI–XIV », différentes concentrations (50, 100 et 200 mg/kg de poids corporel) des extraits et des métabolites purs ont été administrées 5 jours avant l’application de l’agent dangereux « [ ] : groupes II et I ».
L’intoxication du foie par le CCl4 via le rCYP2E1 (un membre de la famille rCytochrome P-450) conduit à la production de métabolites hépatotoxiques, parmi lesquels on peut principalement citer les radicaux trichlorométhyle (rCCl3●−) et trichlorométhylperoxyle (rCCl3OO●−) « [ ] », qui peuvent ensuite induire la peroxydation des acides gras polyinsaturés de la membrane des hépatocytes « [ ] : groupe II », contribuant vraisemblablement à l’hépatotoxicité. Par conséquent, les extraits de N. cataria ont d’abord été étudiés pour leur impact sur la peroxydation lipidique après administration de CCl4. Ainsi, le comportement de l’extrait de N. cataria dans le scénario de stress oxydatif de la membrane des hépatocytes a été évalué indirectement à travers l’activité catalytique de la superoxyde dismutase (rSOD), la concentration de la substance réactive à l’acide thiobarbiturique (rTBARS), l’activité catalytique de la catalase (rCAT) et la concentration de glutathion réduit (rGSH) « [ ] ». En outre, les dommages induits par les radicaux sur la membrane des hépatocytes ont été estimés à travers les activités catalytiques de l’aspartate transaminase (rAST), de l’alanine transaminase (rALT), de la phosphatase alcaline (rALP) et de la γ-glutamyltransférase (rγ-GT), tandis que les dommages biliaires ont été évalués à travers l’activité catalytique de la rALP et de la rγ-GT « [ ] ».
Dans le foie, les radicaux toxiques tels que rCCl3● sont vraisemblablement oxydés par l’oxygène moléculaire activé par le rCYP2E1 pour produire des radicaux rCCl3OO●, conduisant également à la formation de radicaux superoxyde (rO2●−) « [ ] ». La rSOD catalyse la dismutation du rO2●− en oxygène et peroxyde d’hydrogène « [ ] », représentant le mécanisme de défense redox in vivo, et toute diminution de l’activité catalytique de la rSOD est associée à un stress oxydatif en cours. L’administration de CCl4 « [ ] : groupe II » a provoqué une diminution de 2,19 fois de l’activité catalytique de la rSOD par rapport à l’huile d’olive « [ ] : groupe I », confirmant l’enzyme comme un marqueur sensible des lésions hépatiques induites par le CCl4. En outre, l’administration de FME de N. cataria à 200 mg/kg « [ ] : groupe III » a conduit à l’activation de la rSOD (jusqu’à 75,28 % de l’activité catalytique de la rSOD du témoin « [ ] : groupe I »), un résultat qui ne pouvait pas être attribué à l’hépatotoxicité (puisque le FME n’a pas provoqué de peroxydation lipidique sévère ni d’autres dommages oxydatifs hépatiques ; voir la discussion ultérieure), mais qui pourrait être interprété comme une réponse physiologique hépatique normale. Une confirmation externe de ce dernier postulat a été obtenue lors d’une extraction distincte, qui présente une réponse cellulaire nettement moins prononcée par rapport au CCl4 (c’est-à-dire qu’elle a provoqué une augmentation de 1,65 fois de l’activité catalytique de la rSOD par rapport à « [ ] : groupe I »). En outre, la forte augmentation de l’activité catalytique de la rSOD, en termes d’administration du FME avant le CCl4 à concentration correspondante « [ ] : groupe VIII », a plaidé en faveur du fait que le remède agissait de manière apparemment hépatoprotectrice (60,60 % de l’activité catalytique de la rSOD par rapport à « [ ] : groupe I », et 1,33 fois au-dessus de « [ ] : groupe II »), exerçant un potentiel hépatoprotecteur négligeablement supérieur par rapport aux concentrations plus faibles (voir « [ ] : groupes VI et VII »).
Dans la membrane des hépatocytes du foie, les radicaux rCCl3● et rCCl3OO● induisent la formation de malondialdéhyde (rMDA) « [ ] », un produit majeur de la peroxydation lipidique. Par conséquent, le niveau supplémentaire de capacité hépatoprotectrice de l’extrait de N. cataria a été déterminé en complexant le rMDA avec l’acide thiobarbiturique, entraînant la formation de rTBARS « [ ] », dont la concentration accrue indique des dommages membranaires. Immergé dans la membrane et abaissant la concentration de rTBARS en conditions physiologiques, le FME de N. cataria a exprimé individuellement une hépatoprotection notable « [ ] : groupe III, seulement 57,53 % de la concentration de rTBARS mesurée par rapport à « [ ] : groupe I » », sans comparaison avec l’hépatotoxicité du CCl4 « [ ] : groupe II, concentration de TBARS 4,80 fois plus élevée par rapport à « [ ] : groupe I » ». Une telle hépatoprotection intensive était évidente même face au CCl4 « [ ] : groupe VIII, 69,41 % de la concentration de rTBARS par rapport à « [ ] : groupe I », et concentration de rTBARS 6,91 fois plus faible que dans « [ ] : groupe II » ».
Lorsque l’intoxication à base de CCl4 se termine par du peroxyde d’hydrogène, la rCAT dégrade le produit en eau et oxygène moléculaire « [ ] », et la diminution de l’activité catalytique de la rCAT conduit à un stress oxydatif dans le tissu. Par conséquent, comme on pouvait facilement s’y attendre, le CCl4 a provoqué une baisse modérée de l’activité catalytique de la rCAT par rapport à l’huile d’olive « [ ] : groupe II vs groupe I, 81,04 % de l’activité catalytique ». Il était anticipé que le FME de N. cataria pourrait contrer l’intoxication à base de CCl4 « [ ] : groupe III, 98,20 % de l’activité catalytique de la rCAT par rapport à « [ ] : groupe I » », ce qui a été confirmé en l’administrant directement contre le CCl4 « [ ] : groupe VIII vs groupe II, activité catalytique de la CAT 1,08 fois plus élevée ».
Une preuve supplémentaire que le FME de N. cataria était doté d’une activité hépatoprotectrice a été obtenue en surveillant le rGSH, un antioxydant à double mode contre les espèces réactives de l’oxygène émergeant du CCl4. La production de radicaux rCCl3OO● et leur interaction avec les lipides membranaires peuvent provoquer la formation de radicaux lipidiques et la production de rCCl3OOH, qui est réduit en rCCl3OH par le rGSH « [ ] ». En outre, l’excès de peroxyde d’hydrogène peut être neutralisé par le rGSH « [ ] », soutenant les propriétés antioxydantes de la rCAT. Comparé au CCl4 « [ ] : groupe II, concentration de rGSH 2,51 fois plus faible par rapport à « [ ] : groupe I » », le FME de N. cataria n’a pas exercé d’hépatotoxicité « [ ] : groupe IV, 82,42 % de la concentration de rGSH mesurée dans « [ ] : groupe I » ». De même, tout en surveillant le rTBARS, l’administration de FME de N. cataria à la concentration de 200 mg/kg de poids corporel avant le CCl4 « [ ] : groupes VI, VII et VIII » a été corrélée à des effets hépatoprotecteurs (74,88 % de la concentration de rGSH par rapport à « [ ] : groupe I » et concentration de rGSH 1,88 fois plus élevée que dans « [ ] : groupe II » ont été détectées). Les métabolites secondaires les plus abondants du FME de N. cataria « [ ] » — quercitrine, acide chlorogénique et acide quinique — se sont révélés avoir un rôle important dans l’activité hépatoprotectrice contre le CCl4 administré « [ ] », soutenant la découverte précédente selon laquelle l’hépatotoxicité des plantes médicinales devrait être associée à d’autres composés, tels que les alcaloïdes pyrrolizidiniques.
La quercitrine à 200 mg/kg de poids corporel a augmenté l’activité catalytique de la rSOD, diminué la concentration de rTBARS, augmenté l’activité catalytique de la rCAT et augmenté la concentration de rGSH à des valeurs respectivement 1,47 fois plus élevée, 6,57 fois plus faible, 1,09 fois plus élevée et 2,07 fois plus élevée que dans le groupe témoin, correspondant au profil hépatoprotecteur de l’extrait lui-même. Par rapport à la quercitrine, l’acide chlorogénique et l’acide quinique à la concentration la plus élevée ont exercé une protection légèrement moindre contre le CCl4 en termes d’activités catalytiques de la rSOD (respectivement 1,25 fois plus faible et 1,28 fois plus faible) et de la rCAT (respectivement 1,04 fois plus faible et 1,06 fois plus faible), ainsi qu’en termes de concentration de rGSH (respectivement 1,08 fois plus faible et 1,45 fois plus faible), tout en permettant en même temps la formation d’une concentration plus élevée de rTBARS (respectivement 1,37 fois plus élevée et 1,21 fois plus élevée). Par rapport à l’huile d’olive, tous les métabolites secondaires trouvés ont diminué l’activité catalytique de la rCAT à mesure que la concentration appliquée augmentait « [ ] » ; cela a conduit à supposer que de nouvelles quantités de rH2O2 auraient pu être produites in situ d’une manière ou d’une autre.
Ce résultat attendu pourrait se produire lors de la décomposition initiale du rH2O2, catalysée par la rCAT lors de la réaction « catalatique » « [ ] », et de la formation d’espèces oxyferryle avec un cation radicalaire porphyrine, appelée composé I de la catalase de rat (rCATCmpd I), qui peut exister soit dans un état de radical π-cation porphyrine oxoferryle (l’état Por·+-FeIV = O, « [ ] », étape 3), soit dans un état Por-FeIV-OH « [ ] », étape 4). Ici, les métabolites secondaires notés (FlaOHs) étaient vraisemblablement les précurseurs de l’induction d’une plus grande quantité de peroxyde d’hydrogène : tout en interagissant avec la rCAT, ils ont stabilisé le rCATCmpd I et renforcé la formation du rCATCmpd II, se transformant en même temps en la forme radicalaire semiquinone correspondante, rFlaO•− « [ ] », étape 12), qui a initié une chaîne de réactions « [ ] », étapes 13–15) pour former de nouvelles quantités de rH2O2.
Rappelant le comportement pro-rH2O2 des FlaOHs, pour obtenir des indications sur la formation de nouvelles quantités de rH2O2 au niveau moléculaire, mesurée par la diminution de l’activité catalytique de la rCAT « [ ] », les métabolites secondaires de N. cataria « [ ] » ont été soumis à une investigation fondée sur la structure (SB) au sein du rCATCmpd I « [ ] » pour élucider l’origine du rCATCmpd II. Ainsi, la quercitrine dans sa conformation bioactive putative « [ ] » a contribué au moyen du groupe C5-OH de son cycle A, observé comme étant orthogonalement lié au radical π-cation porphyrine oxoferryle du rCATCmpd I « [ ] », en position d’établir une forte liaison hydrogène (HB) (dHB = 2,825 Å) et de donner un proton et de stabiliser le rCATCmpd I. Le radical quercitrinyle formé pourrait conduire à la conversion de l’oxygène moléculaire en rH2O2 « [ ] », étapes 13–15). Cet alignement moléculaire particulier pourrait être la conséquence d’une attraction électrostatique entre la portion C7-OH du cycle A et la rLys169, le cycle A lui-même étant stabilisé par des interactions de van der Waals avec la rLeu165. En outre, tant le groupe carbonyle C4 du cycle C que le groupe C2′-OH orienté axialement du L-rhamnose ont établi des interactions électrostatiques avec la rHis75, constituant ainsi la barrière de premier niveau empêchant le rH2O2 d’entrer dans le site actif et d’initier une autre réaction « catalatique » « [ ] », étape 1). Le site actif était « complètement verrouillé » pour le rH2O2 lors des interactions électrostatiques du groupe C3′-OH équatorial du L-rhamnose avec la rHis75 ou la rAsn148, tandis que la portion C4′-OH équatoriale du L-rhamnose scellait en outre la cavité en interagissant de manière correspondante avec la rAsn148. L’alignement du L-rhamnose était soutenu par les interactions stériques favorables du C5′-CH3 avec la rPhe153. Le mode de liaison global de la quercitrine était significativement conditionné par les interactions négatives des groupes C3′-OH et C4′-OH du cycle B avec respectivement la rAsp128 et la rGln128.
Enfin, l’acide quinique seul « [ ] » a adopté une conformation de liaison à proximité du rCATCmpd I, assurant sa stabilisation au moyen d’une faible liaison hydrogène (dHB = 3,313 Å) via le C4-OH. La portion C5-OH non substituée a interagi électrostatiquement avec la rHis75, tandis que le C4-OH a interagi de manière similaire avec la rAsn128. Quant à l’acide chlorogénique, le groupe carboxyle C1 a établi des interactions électrostatiques avec la rAsp128, ainsi que des interactions supplémentaires avec la rGln128. La portion C1-OH a provoqué des interactions dipôle induit avec la rVal128.
Les activités catalytiques de la rAST, rALT, rALP et rγ-GT peuvent être considérées comme des indicateurs sensibles de lésions hépatiques aiguës, tandis que les activités catalytiques de la rALP et de la rγ-GT seules sont considérées comme des marqueurs de lésions des voies biliaires « [ ] ». Ici, comme prévu, la formation de rMDA induite par le CCl4 « [ ] : groupe II » a entraîné une augmentation significative des activités catalytiques de la rAST et de la rALT « [ ] : groupe II vs groupe I, augmentation respective de 22,51 fois et 3,06 fois », impliquant la perturbation de la membrane des hépatocytes et vraisemblablement l’hépatotoxicité. En outre, le FME de N. cataria en application autonome a réduit l’activité catalytique de la rAST par rapport au niveau du groupe témoin « [ ] : groupe III vs groupe I », confirmant que l’extrait n’a induit aucune hépatotoxicité « [ ] ». Cependant, l’activité catalytique légèrement accrue de la rALT « [ ] : groupe III vs groupe I, augmentation de 1,82 fois » pourrait être un marqueur d’une hépatotoxicité légère. Les activités catalytiques 22,16 fois et 1,66 fois plus élevées de la rAST et de la rALT associées aux échantillons traités au CCl4 soutiennent également l’absence d’hépatotoxicité du FME de N. cataria « [ ] : groupe II vs groupe III ».
De plus, tout en contrant les effets du CCl4, l’extrait a diminué les activités catalytiques de la rAST et de la rALT de manière dose-dépendante « [ ] : groupes VI–VIII », l’application la plus concentrée (200 mg/kg de poids corporel) rétablissant presque la pleine activité catalytique de la rAST « [ ] : groupe VIII vs groupe I », réparant les dommages causés par le CCl4 « [ ] : groupe VIII vs groupe II, activité catalytique 18,81 fois plus faible ». Comme prévu, l’activité catalytique de la rALT était 1,90 fois plus élevée dans l’échantillon non traité « [ ] : groupe VIII vs groupe I » et 1,61 fois plus faible en présence du composé dangereux « [ ] : groupe II vs groupe VIII ».
Les activités catalytiques de la rALP et de la rγ-GT ont également été régulées à la baisse de manière concentration-dépendante. Ainsi, étant augmentée aux côtés de la rAST, l’activité catalytique de la rALP « [ ] : groupe II vs groupe I, augmentation de 1,35 fois » impliquait que l’administration autonome de CCl4 pourrait même causer une hépatotoxicité, comme validé par l’activité catalytique accrue de la rγ-GT « [ ] : groupe II vs groupe I, 4,12 fois, voir la discussion ultérieure ». Le FME de N. cataria, cependant, s’est révélé exercer des effets hépatoprotecteurs « [ ] : groupe III », aucune hépatotoxicité n’étant associée aux performances opposées de la rAST et de la rALP « [ ] : groupe III », en accord avec les changements de l’activité catalytique de la rγ-GT « [ ] : groupe III ». À la concentration la plus élevée du FME (200 mg/kg de poids corporel), l’effet toxique du CCl4 a été antagonisé « [ ] : groupe VIII vs groupe II, baisse de 1,32 fois de l’activité catalytique de la rALP », et l’inflammation s’est apaisée grâce au rétablissement de l’activité biliaire (noter l’activité catalytique 3,36 fois plus faible de la rγ-GT dans « [ ] : groupe VIII » par rapport à « [ ] : groupe II »).
De manière cohérente, les métabolites purs du FME de N. cataria « [ ] » ont protégé sans ambiguïté la membrane des hépatocytes et la bile « [ ] ». Ainsi, à la dose la plus élevée, la quercitrine a complètement supprimé l’activité catalytique de la rAST induite par le CCl4 « [ ] : activité catalytique 16,99 fois plus faible » et a apaisé la rALT, la rALP et la rγ-GT. L’acide chlorogénique était légèrement moins efficace pour protéger le foie du CCl4, conduisant à des activités catalytiques de la rAST, rALT, ALP et rγ-GT respectivement 1,04 fois plus élevée, 1,04 fois plus faible, 1,02 fois plus élevée et 1,55 fois plus élevée que la quercitrine. En outre, en accord avec les résultats des marqueurs redox, l’acide quinique s’est révélé être le plus faible hépatoprotecteur, affichant la moindre réduction des activités catalytiques de la rAST, rALT, rALP et rγ-GT, étant respectivement 1,21 fois plus élevée, 1,14 fois plus élevée, 1,02 fois plus élevée et 1,91 fois plus élevée que celle de la quercitrine.
Le LME de N. cataria a fait en sorte que l’activité catalytique de la rSOD, l’activité catalytique de la rCAT et la concentration de rGSH soient respectivement à 79,9 %, 97,14 % et 83,04 % des niveaux de base « [ ] : groupe IV vs groupe I », tandis que la concentration de rTBARS était 1,09 fois plus élevée, pas assez pour être considérée comme un marqueur d’hépatotoxicité si on la compare au CCl4 (respectivement valeur 1,26 fois plus élevée, valeur 4,40 fois plus faible, valeur 1,20 fois plus élevée et valeur 2,12 fois plus élevée ; voir « [ ] : groupe IV vs groupe II »). Néanmoins, de manière hépatoprotectrice, le LME de N. cataria a exercé des propriétés plausibles à la concentration de 100 mg/kg de poids corporel (l’activité catalytique de la rSOD, la concentration de rTBARS, l’activité catalytique de la rCAT et la concentration de rGSH étaient respectivement à 67,84 %, 83,10 %, 96,25 % et 82,67 % des valeurs du groupe témoin, voir « [ ] : groupe X vs groupe I », et respectivement 1,49 fois plus élevée, 5,77 fois plus faible, 1,19 fois plus élevée et 2,07 fois au-dessus de la valeur témoin ; voir « [ ] : groupe X vs groupe II »). Tandis qu’en comparant le LME de N. cataria à 100 mg/kg de poids corporel avec le FME de N. cataria à 200 mg/kg de poids corporel, l’extrait de feuilles a montré une efficacité moindre pour maîtriser l’activité catalytique de la rSOD et la concentration de rTBARS, mais a montré un meilleur profil en termes d’activité catalytique de la rCAT et de concentration de rGSH « [ ] : comparer groupe X vs groupe VIII ».
Les effets hépatoprotecteurs du LME de N. cataria pourraient être principalement attribués aux acides chlorogénique et rosmarinique « [ ] », qui à 100 mg/kg de poids corporel ont augmenté l’activité catalytique de la rSOD par rapport au CCl4 (augmentation de 1,60 fois), neutralisant partiellement les dommages par comparaison à l’huile d’olive comme témoin positif (50,95 % de l’activité catalytique basale de la rSOD restaurée). En ce qui concerne le rTBARS, l’acide rosmarinique a presque entièrement empêché leur formation (seule une concentration 1,04 fois plus élevée a été mesurée par rapport à l’huile d’olive lors de l’administration du composé contre l’entité chimique dangereuse). Cependant, l’acide rosmarinique seul a été confirmé comme non hépatoprotecteur en analysant l’activité catalytique de la rCAT et la concentration de rGSH ; le composé a légèrement augmenté les marqueurs redox (respectivement 1,03 fois et 1,83 fois), en dessous des niveaux des valeurs basales (respectivement 82,23 % et 68,01 %), impliquant que d’autres études sont nécessaires pour déterminer si les composés pourraient agir de manière synergique, antagoniste et/ou additive.
L’acide rosmarinique, étant un analogue de l’acide caféique, s’est révélé adopter un mode de liaison similaire à celui de l’acide chlorogénique « [ ] » dans lequel le C4-OH a établi une forte liaison hydrogène (dHB = 2,820 Å) avec le rCATCmpd I, tandis que les portions OH para et méta de l’acide dihydroxyphényl-lactique ont établi des interactions électrostatiques avec respectivement la rLys177 et la rAsp128.
Outre l’impact favorable sur le statut redox « [ ] », l’application thérapeutique potentielle du LME de N. cataria a été remise en question et est restée pour le moins insaisissable. Ainsi, administré seul, parmi les trois types d’extraits de N. cataria, le LME a provoqué l’activité catalytique de la rAST la plus élevée (3,31 fois plus élevée que le FME ; comparer les groupes IV et III au sein de « [ ] » ; et 1,08 fois plus élevée que le SME ; comparer les groupes IV et V au sein de « [ ] »).
En outre, en analysant l’activité catalytique de la rALT, il semble que le foie ait mieux toléré le LME comme xénobiotique que le FME (valeur 1,03 fois plus faible, comparer les groupes IV et III au sein de « [ ] ») mais a montré une réaction plus prononcée que lors de l’administration du SME (valeur 1,19 fois plus élevée, comparer les groupes IV et V au sein de « [ ] »). Néanmoins, les activités catalytiques des deux enzymes ont été augmentées lors de l’administration du LME de N. cataria, indiquant possiblement une hépatotoxicité. Cependant, le LME a induit l’activité catalytique de la rALP la plus faible (1,34 fois plus faible que celle causée par le FME, comparer les groupes IV et III au sein de « [ ] », et 1,61 fois plus faible que celle causée par le SME ; comparer les groupes IV et V au sein de « [ ] »), pour laquelle l’hépatotoxicité a été exclue. La conclusion opposée a été tirée en analysant l’activité catalytique de la rγ-GT (valeurs respectivement 1,76 fois plus élevée et 1,14 fois plus faible que le FME et le SME), indiquant une légère atteinte biliaire.
En ce qui concerne la prévention de la toxicité, à 100 mg/kg de poids corporel, le LME a semblé neutraliser les effets indésirables du CCl4 associés à travers les activités catalytiques rétablies de la rAST, rALP et rγ-GT (respectivement 1,24 fois plus élevée, 1,22 fois plus élevée et 3,48 fois plus élevée que les valeurs du groupe témoin ; comparer « [ ] : groupe X vs groupe I », et respectivement 18,14 fois plus faible, 1,11 fois plus faible et 1,18 fois plus faible que les valeurs du groupe traité au CCl4 ; « [ ] : comparer groupe X vs groupe II »). Cependant, la même formulation n’a pas réussi à rétablir l’activité catalytique de la rALT (valeur 1,25 fois plus élevée après traitement au CCl4 ; « [ ] : comparer groupe X vs groupe II »), révélant l’hépatotoxicité induite par le CCl4. Une confirmation supplémentaire que le LME de N. cataria pourrait ne pas être une préparation phytothérapeutique optimale a été obtenue avec l’absence de cohérence entre la concentration administrée et l’impact sur les marqueurs de toxicité sérique « [ ] vs [ ] ». Ainsi, la concentration de 50 mg/kg de poids corporel a semblé plus efficace pour restaurer les activités catalytiques basales de la rAST et de la rγ-GT, tandis que la concentration de 200 mg/kg de poids corporel était plus bénéfique pour abaisser les activités catalytiques de la rALT et de la rALP. Par conséquent, des études supplémentaires sont vraisemblablement nécessaires avant de proclamer le LME de N. cataria aussi sûr que des suppléments hépatoprotecteurs.
À cet égard, une question a été soulevée quant à la contribution de l’acide rosmarinique « [ ] » dans la protection de la membrane des hépatocytes également. Le composé a semblé protecteur contre le CCl4 en termes d’activités catalytiques de la rAST, rALP et rγ-GT (respectivement 1,08 fois plus élevée, 1,03 fois plus élevée et 2,00 fois plus élevée qu’après traitement à l’huile d’olive ; « [ ] : comparer groupe X vs groupe I » ; et respectivement 15,76 fois plus faible, 1,32 fois plus faible et 2,81 fois plus faible que les valeurs du groupe témoin ; « [ ] : comparer groupe X vs groupe I »), mais seulement modérément protecteur vu à travers l’activité catalytique de la rALT (respectivement 1,64 fois plus élevée et 1,84 fois plus faible qu’après traitement à l’huile d’olive ou au CCl4 ; comparer « [ ] : groupe X vs groupe I », et « [ ] : groupe X vs groupe II »), se fondant dans le schéma exprimé par l’extrait lui-même.
L’administration du SME de N. cataria à la concentration la plus élevée a porté l’activité catalytique de la rSOD au niveau le plus élevé comparé aux extraits correspondants d’autres organes de la plante « [ ] : groupe V, activité catalytique de la rSOD 1,25 fois plus faible par rapport au groupe de référence, c’est-à-dire « [ ] : groupe I » », ne causant vraisemblablement aucune lésion des hépatocytes en comparaison des effets du CCl4 « [ ] : groupe V, activité catalytique de la rSOD 1,76 fois plus élevée par rapport à « [ ] : groupe II » ». Aucun dommage significatif pour le foie n’a également été confirmé lors de l’analyse de la concentration de rTBARS (concentration de rTBARS respectivement 7,90 fois plus faible et 1,65 fois plus faible par rapport à l’huile d’olive ou au CCl4 ; voir « [ ] : groupe V vs groupe I » et « [ ] : groupe V vs groupe II »), de l’activité catalytique de la rCAT (respectivement 1,17 fois plus élevée et 1,05 fois plus faible par rapport à l’huile d’olive ou au CCl4 ; voir « [ ] : groupe V vs groupe I » et « [ ] : groupe V vs groupe II ») et de la concentration de rGSH (respectivement 1,08 fois plus faible et 2,31 fois plus élevée par rapport à l’huile d’olive ou au CCl4 ; voir « [ ] : groupe V vs groupe I » et « [ ] : groupe V vs groupe II »).
En outre, il convient de souligner que le SME à une concentration de 50 mg/kg de poids corporel a provoqué la plus faible diminution de l’activité catalytique de la rSOD et donc la meilleure hépatoprotection contre l’agent générateur de radicaux « [ ], groupe XII vs groupe II : l’activité catalytique de la rSOD était 1,35 fois plus élevée par rapport à la valeur causée par le CCl4 ». Une tendance similaire a été observée pour le rTBARS « [ ], groupe XII vs groupe II : la concentration de rTBARS était 2,44 fois plus faible par rapport à la valeur causée par le CCl4 » et les concentrations de rGSH « [ ], groupe XII vs groupe II : la concentration de rGSH était 2,00 fois plus faible par rapport à la valeur causée par le CCl4 », mais pas en considérant l’activité catalytique de la rCAT (où l’extrait à la concentration de 200 mg/kg de poids corporel a été le plus performant pour protéger le foie de l’intoxication à base de CCl4), révélant la limite de la formulation distincte.
La protection des hépatocytes du SME de N. cataria contre le CCl4 est vraisemblablement due à l’acide chlorogénique « [ ] », car il peut influencer les marqueurs redox « [ ] ». À la concentration de 50 mg/kg de poids corporel, l’acide chlorogénique a augmenté les activités catalytiques de la rSOD et de la rCAT (valeur 1,14 fois plus élevée et valeur 1,02 fois plus élevée), augmenté la concentration de rGSH (1,58 fois plus élevée) et diminué en même temps la concentration de rTBARS (valeur 4,44 fois plus faible).
Malgré l’absence d’hépatotoxicité du SME de N. cataria à la concentration la plus élevée, l’extrait a causé quelques dommages notables à la membrane hépatique et à la bile, comme l’indiquent les activités catalytiques de la rAST, rALT, rALP et rγ-GT « [ ] : groupe V vs groupe I, valeurs respectivement 3,10 fois, 1,50 fois, 1,34 fois et 2,06 fois plus élevées que dans le groupe témoin » ; quant à l’activité catalytique de la rALP, les dommages étaient même similaires à ceux consécutifs au traitement au CCl4 (comparer groupe V et groupe II dans « [ ] », 1,01 fois en faveur du CCl4), indiquant, aux côtés de l’activité catalytique de la rAST, une apparition d’hépatotoxicité légère (les activités catalytiques de la rAST, rALT, rγ-GT étaient respectivement 7,25 fois, 2,04 fois et 2 fois plus faibles dans le groupe V de « [ ] » que dans le groupe II).
Au contraire, le SME de N. cataria appliqué de manière antagoniste au CCl4 à une concentration de 50 mg/kg « [ ] : groupe XII » a provoqué la plus forte hépatoprotection en accord avec l’analyse du statut redox « [ ] ». L’activité catalytique de la rAST était inférieure à la valeur du groupe témoin (72,47 % de la valeur dans « [ ] : groupe I ») et était significativement plus faible que dans l’échantillon saturé de CCl4 (31,06 fois plus faible que dans « [ ] : groupe I »), tandis que l’activité catalytique de la rALT était comparable à la valeur du groupe témoin (comparer groupe XII et groupe I de « [ ] ») mais 2,72 fois plus faible que celle causée par le CCl4 « [ ] : groupe XII vs groupe II » : aucune hépatotoxicité n’a été observée. Le SME était moins efficace pour restaurer les activités catalytiques de la rALP et de la rγ-GT, tout en les abaissant à des niveaux respectivement 1,09 fois et 1,81 fois inférieurs à ceux causés par le CCl4 (voir « [ ] : groupe XII vs groupe II »), mais aucune hépatotoxicité n’a été observée non plus. Par conséquent, une concentration de SME formulée ad hoc pourrait être sûre pour une administration thérapeutique.
L’acide chlorogénique « [ ] » a neutralisé sans ambiguïté la nocivité du CCl4 pour les hépatocytes « [ ] », car il ne faisait pas partie des composés hépatotoxiques, faisant en sorte que les activités catalytiques de la rAST, rALT, rALP et rγ-GT soient respectivement 1,04 fois plus élevée, 1,04 fois plus faible, 1,02 fois plus élevée et 1,55 fois plus élevée que le CCl4.
Une fois produits, les radicaux rCCl3• à rCCl3OO• pourraient atteindre l’ADN et influencer le rO2•− qui pourrait attaquer les bases nucléiques de l’ADNr ou les résidus désoxyribose « [ ] », produisant des bases endommagées ou une rupture des brins, événements cellulaires qui peuvent être quantifiés par le test des comètes. Néanmoins, un scénario probable est que le radical rCCl3OO• induit la formation de rMDA « [ ] » qui pourrait interagir avec l’ADN pour former des adduits tels que rM1G, rM1A et rM1C « [ ] ». Certains des adduits pourraient induire des transversions et des transitions de bases et l’ouverture consécutive du cycle pour former des adduits rN2-oxopropényl-dG, rN2-oxopropényl-dA ou rN2-oxopropényl-dC qui pourraient conduire à une réticulation inter-brins ADNr–ADNr ou à des réticulations inter-brins ADNr–protéine, événements cellulaires qui peuvent être évalués par le test des comètes. De plus, comme l’interaction des métabolites secondaires avec la rCAT « [ ] » a induit la formation d’une nouvelle quantité de peroxyde d’hydrogène, la dégradation du produit en radical hydroxyle peut permettre de cibler le ribose au sein du brin d’ADNr avec des espèces réactives de l’oxygène distinctes, pour lesquelles des quantités supplémentaires de rMDA pourraient émerger. Par conséquent, sur la base des produits induits par le rMDA de l’ADNr, l’efficacité du FME, du LME et du SME à endommager ou à protéger l’ADNr après traitement au CCl4 peut être évaluée, aspect discuté ici.
L’administration de CCl4 a provoqué de graves lésions hépatocellulaires associées aux événements cellulaires décrits ci-dessus, c’est-à-dire qu’elle a augmenté significativement (p < 0,05) le niveau de dommages à l’ADNr « [ ] : groupe II » par rapport au groupe témoin « [ ] : groupe I » : valeur du moment de la queue (tail moment) 11,47 fois plus élevée, augmentation de 3,51 fois du % d’ADNr dans la queue et augmentation de 9,48 fois de la longueur de la queue (tail length). Par comparaison aux dommages induits par le CCl4, l’administration de FME de N. cataria à la concentration de 200 mg/kg de poids corporel n’a causé aucune génotoxicité, conduisant à une diminution de 10,07 fois de la valeur du moment de la queue, à une diminution de 2,90 fois du % d’ADNr dans la queue et à une réduction de 8,50 fois de la longueur de la queue « [ ] : groupe II vs groupe III ». Cependant, par rapport au groupe témoin, une certaine augmentation du moment de la queue (valeur 1,14 fois plus élevée), du % d’ADNr dans la queue (valeur 1,21 fois plus élevée) et de la longueur de la queue (valeur 1,12 fois plus élevée) a également été observée « [ ] : groupe III vs groupe I », bien que sans différences significatives (p > 0,05), ce qui pourrait être attribué au rH2O2 généré in situ « [ ] » et à la formation consécutive de lésions médiées par le rMDA.
Cependant, l’intoxication physiologique par le rH2O2 a semblé sans rapport avec les propriétés antigénotoxiques du FME « [ ] ». Ainsi, alors qu’une augmentation du score total a été détectée chez les rats exposés uniquement au CCl4 (augmentation de 4,93 fois, « [ ] : groupe II vs groupe I »), les niveaux de dommages à l’ADNr hépatique analysés à partir des groupes traités avec différentes concentrations de FME de N. cataria étaient significativement réduits « [ ], groupes VI–XIV ». L’extrait à la concentration la plus élevée « [ ] : groupe VIII » a réduit les dommages à l’ADNr les plus élevés causés par le CCl4 (score total 2,24 fois plus faible que l’agent dangereux, « [ ] : groupe II vs groupe VIII », mais 1,83 fois plus élevé que dans le groupe témoin, « [ ] : groupe VII vs groupe I »), avec un niveau de réduction en pourcentage de 73,13 % et l’absence des classes de comètes 3 et 4. La constatation que le FME de N. cataria à la concentration la plus élevée était un supplément hépatoprotecteur efficace ne causant aucune génotoxicité a soulevé une question intéressante : « les extraits hépatoprotecteurs sont-ils aussi des agents antigénotoxiques ? »
De manière similaire à l’extrait, les métabolites secondaires listés dans « [ ] » ont également été étudiés pour l’évaluation de leurs propriétés antigénotoxiques afin de les corréler avec les effets correspondants des extraits « [ ] ». La quercitrine, l’acide chlorogénique et l’acide quinique, en tant que représentants du FME, se sont révélés exercer une activité antigénotoxique, associée à l’absence des classes de comètes 3 et 4. Comparée au CCl4, la quercitrine à la concentration de 200 mg/kg de poids corporel a fortement réduit les dommages à l’ADNr causés par le CCl4 (provoquant un score total 2,35 fois plus faible que l’agent dangereux, mais 1,89 fois plus élevé que dans le groupe témoin), avec une réduction en pourcentage de 74,08 %. En outre, à la même concentration, l’acide chlorogénique a réduit le score total dans l’échantillon endommagé de 1,73 fois, le maintenant toujours à un niveau 2,56 fois plus élevé que dans l’échantillon non endommagé, et il était associé à une réduction en pourcentage de 54,68 %. Enfin, l’acide quinique était efficace pour protéger le foie du CCl4, avec un pourcentage de réduction égal à 69,98, un score total 2,18 fois plus faible que dans l’échantillon enrichi en CCl4 et 2,03 fois plus élevé que dans l’échantillon non traité.
L’activité des agents antigénotoxiques a été étudiée plus avant à travers des études fondées sur la structure utilisant la Topoisomérase IIα de R. norvegicus (rTopIIα), une enzyme qui catalyse in vivo la décaténation de l’ADNr endommagé, un processus quantifié par l’apparition de comètes « [ ] ». Ainsi, les conformations bioactives des métabolites secondaires de N. cataria au sein du domaine de liaison et de clivage de l’ADNr de la rTopIIα ont été comparées au rMDA, la pose de liaison étant calculée à proximité de quatre nucléotides ciblables positionnés au sein du brin sens : deux résidus guanine consécutifs (rG41 et rG42) suivis d’une thymine (rT43) et d’une adénine (rA44), ainsi qu’à proximité de deux résidus cytosine (rC11 et rC12) et d’une rG13 appartenant au brin antisens complémentaire « [ ] », créant un environnement favorable à la génération de rdG, rdA et rdC et au déclenchement des événements cellulaires associés.
L’acide chlorogénique a de même protégé tous les nucléotides « [ ] », où la portion m-OH de l’acide caféique a formé une HB avec le groupe carbonyle C6 de la rG13 (dHB = 3,124 Å), tandis que le groupe p-OH a établi des interactions électrostatiques avec le groupe carbonyle C6 de la rG13 correspondante et avec l’amine/imine primaire C4 de la seconde des rC11 et rC12. Le chemin aliphatique était orienté vers la rC11 pour établir des interactions dipôle induit avec la portion amine/imine primaire C4 correspondante. En outre, la portion acide (−)-quinique de l’acide chlorogénique faisait face au brin sens où le C1-OH a formé la HB avec la portion carbonyle C4 de la rT43 (dHB = 2,803 Å), tandis que la portion C3-OH a interféré électrostatiquement avec la portion carbonyle C4 de la rT43 et la portion C5-NH2 de la rA44. L’acide (−)-quinique a adopté une conformation de liaison « [ ] » dans laquelle le groupe p-OH a établi une HB avec la portion carbonyle C6 (dHB = 2,932 Å) de la rG41, tandis que l’un des deux groupes hydroxyle méta (soit C3-OH soit C5-OH) a établi une HB avec la position N7 de la rG41 (dHB = 3,221 Å). Enfin, le C1-OH a formé une HB (dHB = 2,546 Å) avec une portion carbonyle C4 de la rT43 au sein du brin sens.
Le LME, administré à la concentration de 200 mg/kg de poids corporel, n’a exercé aucune propriété génotoxique par rapport au CCl4 (l’agent dangereux a provoqué une valeur du moment de la queue 5,52 fois plus élevée, une augmentation de 2,56 fois du % d’ADNr dans la queue et une augmentation de 7,78 fois de la longueur de la queue ; « [ ] : groupe II vs groupe IV »), et a de même augmenté les valeurs des marqueurs correspondants par rapport au groupe témoin (« [ ] : groupe IV vs groupe I », valeurs respectivement 2,08 fois, 1,37 fois et 1,22 fois plus élevées, mais sans différences significatives (p > 0,05)) ; comparé au FME de N. cataria, son administration a tout de même provoqué une augmentation de 1,82 fois du moment de la queue, ainsi que des augmentations de 1,13 fois et 1,09 fois du % d’ADNr dans la queue et de la longueur de la queue, respectivement « [ ], groupe IV vs III ».
Néanmoins, l’administration du LME de N. cataria à la concentration de 100 mg/kg de poids corporel « [ ] : groupe X » a efficacement prévenu les dommages à l’ADNr induits par le CCl4 (provoquant un score total 1,95 fois plus faible que l’agent dangereux ; « [ ] : groupe II vs groupe X » ; mais 2,08 fois plus élevé que dans le groupe témoin ; « [ ] : groupe X vs groupe I »), mais avec la valeur inférieure de pourcentage de réduction de 64,80 % et permettant encore une fréquence légèrement plus élevée de la classe de comète 2 par rapport au FME « [ ] : groupe X vs groupe III ».
De manière similaire, l’acide rosmarinique pourrait en partie expliquer l’activité du LME, étant donné qu’il n’a de même permis aucune comète de la classe 2 à la classe 4. L’acide rosmarinique à la concentration de 100 mg/kg de poids corporel a protégé l’ADNr des dommages causés par le CCl4, comme le prouve le score total 2,09 fois plus faible que l’agent dangereux, mais 2,12 fois plus élevé que dans le groupe témoin, ainsi qu’avec le pourcentage de réduction de 67,25 % « [ ] ». L’acide rosmarinique a adopté une conformation de liaison plutôt inhabituelle, en sandwich, dans laquelle les fractions aromatiques des portions acide caféique et acide dihydrophényllactique étaient orthogonalement liées l’une à l’autre. En ce sens, le groupe hydroxyle para de l’acide caféique a établi une HB avec la portion amine/imine C4 de la rC12 (dHB = 3,308 Å), tandis que le m-OH était fortement lié par HB à la portion carbonyle C6 (dHB = 2,247 Å) de la rG41. La portion aliphatique de l’acide rosmarinique s’étendait sur le double brin d’ADNr dans l’arrangement en sandwich décrit ci-dessus, où le groupe carboxylique libre faisait partiellement face au groupe C6-NH2 de la rG41. Enfin, le groupe hydroxyle méta de l’acide dihydrophényllactique a électrostatiquement attiré la portion carboxyle C6 et la position N7 de la rG42, tandis que la portion p-OH a attiré de manière similaire la portion carboxyle C6 et l’azote N7 de la rG41.
L’étendue des dommages à l’ADNr hépatique était significativement plus faible (p > 0,05) chez les animaux traités avec le SME de N. cataria à la concentration de 200 mg/kg de poids corporel comparés à ceux traités avec l’agent dangereux (qui a provoqué une valeur du moment de la queue 3,50 fois plus élevée, une augmentation de 1,42 fois du % d’ADNr dans la queue et une augmentation de 4,40 fois de la longueur de la queue ; « [ ] : groupe I vs groupe V »). En outre, l’extrait pourrait être nocif pour l’ADNr hépatique comparé au groupe de référence (valeur du moment de la queue 3,28 fois plus élevée, augmentation de 2,47 fois du % d’ADNr dans la queue et augmentation de 2,15 fois de la longueur de la queue ; « [ ], groupe V vs groupe I »).
En ce qui concerne l’antigénotoxicité, la concentration plus faible de 50 mg/kg de poids corporel, comparée au CCl4, a montré la valeur de %R la plus élevée de 77,05 (score total 2,39 fois plus faible que l’agent dangereux ; « [ ] : groupe II vs groupe XII », mais 1,71 fois plus élevé que dans le groupe témoin ; « [ ] : groupe XII vs groupe I »), faisant du SME un candidat pour de futures applications potentielles. En ce qui concerne la valeur de %R, le SME à la concentration la plus faible « [ ], groupe XII » a été aussi performant que le FME à la concentration la plus élevée « [ ], groupe VIII ». Malheureusement, le SME a montré un niveau élevé de dommages à l’ADNr « [ ] : groupe XII, classe de comète 3 ». En conclusion, l’acide chlorogénique, en tant que composé le plus abondant du SME, représente celui le plus lié à l’activité de l’extrait.
Le méthanol de qualité gradient LC et l’acide formique ont été achetés auprès de J. T. Baker (Deventer, Pays-Bas). Le méthanol, le tétrachlorure de carbone et le diméthylsulfoxyde ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne). Les étalons de référence des composés phénoliques ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne) et d’Extrasynthese (Genay, France). La solution saline équilibrée de Hank (HBSS), l’agarose à bas point de fusion, l’agarose à point de fusion normal, l’albumine sérique bovine, la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), le tampon de lyse, l’hydroxyde de sodium (NaOH), l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l’alcool absolu, le bromure d’éthidium et le 1,1,3,3-tétraéthoxypropane ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne).
Les fleurs, feuilles et tiges de N. cataria ont été récoltées à la fin de la saison de floraison (juin 2014) dans des populations naturelles en Serbie, village de Miljevici (altitude 920 m, 43°22′07′′ N, 19°35′25′′ E). L’échantillon de référence a été identifié, classé et déposé à l’Herbier du Département de Biologie et Écologie, Faculté des Sciences, Université de Kragujevac (n° MB03/14).
Les parties aériennes séchées à l’air (dans l’obscurité, à température ambiante) des fleurs, feuilles et tiges de N. cataria ont été extraites séparément au méthanol, à l’aide d’un appareil de Soxhlet, à 60 °C pendant 12 h. Les extraits filtrés ont été évaporés à sec sous vide à 40 °C à l’aide d’un évaporateur rotatif et conservés dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à utilisation.
L’analyse quantitative a été réalisée sur un HPLC Agilent Technologies 1200 couplé à un spectromètre de masse en tandem à triple quadripôle Agilent Technologies 6420 (Santa Clara, CA, USA) avec une source ESI fonctionnant en mode d’ionisation négative. Le logiciel MassHunter version B.03.01 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) a été utilisé pour le contrôle des instruments, l’acquisition des données et le traitement des données. Les extraits de fleurs, feuilles et tiges de N. cataria ont été préparés sous forme de solutions méthanoliques (concentrations 0,2 mg/mL). Pour construire les courbes d’étalonnage, des solutions étalons méthanoliques de dix-huit composés phénoliques ont été préparées dans la gamme de concentration de 0,00153 à 50,00 μg/mL. La séparation chromatographique ainsi que les conditions de fonctionnement du spectromètre de masse étaient les mêmes que celles décrites précédemment. En bref, des volumes injectés de 5 μL de toutes les solutions (échantillons analysés ou mélanges de composés étalons) ont été séparés sur une colonne Zorbax Eclipse XDB-C18 RR 4,6 mm × 50 mm × 1,8 μm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) (température 45 °C, débit 1 mL/min). La phase mobile était l’acide formique aqueux (99,95–0,05 %) (A) et le méthanol (B). Programme d’élution : 0–6 min (30–70 % B), 6–9 min (70–100 % B) et 9–11 min (100 % B).
Les conditions de fonctionnement de la source ESI étaient : température du gaz de séchage (N2) 350 °C avec un débit de 9 L/min, gaz de nébulisation (N2) 40 psi et tension capillaire 4 kV. L’acquisition des données selon des paramètres décrits précédemment (tensions de fragmenteur spécifiques-Vf ; tensions de cellule de collision-Vc, précurseur sélectionné et ions produits) a été réalisée en mode de surveillance dynamique de réactions multiples. Après la construction des courbes d’étalonnage (aires des pics vs différentes concentrations des composés étalons), les concentrations des composés phénoliques ont été dérivées des équations de régression linéaire. Les résultats ont été donnés sous forme de moyennes ± écart-type de trois mesures.
Tous les métabolites secondaires de N. cataria obtenus ont été achetés auprès de la base de données PlantMetaChem (http://www.plantmetachem.com ; consultée le 15 mars 2020) et utilisés sans purification.
Soixante-dix rats Wistar albinos mâles pesant 220 ± 20 g utilisés dans cette étude ont été obtenus de l’Animalerie de l’Académie médicale militaire, Belgrade, Serbie, et acclimatés pendant trois jours avant l’expérience. L’entretien s’est fait selon un cycle lumière–obscurité de 12 h, avec nourriture et eau disponibles ad libitum. Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Faculté des Sciences, Université de Kragujevac, Numéro d’approbation éthique 2-06/2022, qui agit conformément aux directives serbes pertinentes, y compris les Lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et la Loi sur le bien-être animal (« Journal officiel de la République de Serbie », n° 810 41/09) et la Directive européenne pour le bien-être des animaux de laboratoire, Directive 2010/63/UE.
Les rats albinos mâles ont été répartis à parts égales en quatorze groupes de cinq animaux chacun et traités par voie orale pendant cinq jours, comme suit : le groupe I (témoin normal) a reçu quotidiennement de l’eau distillée (500 mL par animal) puis a été injecté par voie intrapéritonéale (i.p.) avec 1 mL/kg de poids corporel d’huile d’olive commerciale (Monini Olio Extra Vergine di Oliva). Le groupe II, témoin positif, a reçu par voie orale de l’eau distillée pendant cinq jours, puis a été injecté i.p. avec une dose unique de 1 mL/kg de poids corporel de CCl4 (mélange 1:1 dans l’huile d’olive). Pour les études d’hépatotoxicité et de génotoxicité, les animaux des groupes III–V ont reçu séparément par voie orale une dose unique de 200 mg/kg de poids corporel de FME, LME et SME, chacun dissous dans l’huile d’olive commerciale, pendant cinq jours. Pour les études hépatoprotectrices et antigénotoxiques, les animaux des groupes VI–VIII ont reçu du FME de N. cataria à 50, 100 et 200 mg/kg de poids corporel, dissous dans l’huile d’olive commerciale ; les animaux des groupes IX–XI ont été traités avec du LME de N. cataria à 50, 100 et 200 mg/kg de poids corporel, dissous dans l’huile d’olive commerciale, respectivement, tandis que les animaux des groupes XII–XIV ont été traités avec du LME de N. cataria à 50, 100 et 200 mg/kg de poids corporel, dissous dans l’huile d’olive commerciale. Le dernier jour du traitement, les animaux des groupes II–XI ont reçu i.p. une dose unique de 1 mL/kg de poids corporel de CCl4 (mélange 1:1 dans l’huile d’olive). Vingt-quatre heures après l’injection de CCl4, tous les animaux ont été anesthésiés à l’éther éthylique puis sacrifiés, et leurs foies et leur sang (de la veine abdominale) ont été prélevés immédiatement dans des tubes non héparinés.
Les expériences supplémentaires ont été menées en utilisant les métabolites quantifiés de N. cataria selon un dispositif expérimental similaire à celui des études hépatoprotectrices et antigénotoxiques : chaque nouveau groupe d’animaux d’expérience (cinq animaux par groupe) a été traité per os avec une dose unique du composé étudié, soit 50, 100 ou 200 mg/kg de poids corporel, avant l’administration i.p. de CCl4 (1 mL/kg de poids corporel).
Le sérum pour la détermination des paramètres biochimiques, l’aspartate transaminase (AST), l’alanine transaminase (ALT), la phosphatase alcaline (ALP) et la γ-glutamyltransférase (γ-GT), a été préparé par la méthode de Quick, immédiatement immergé dans l’azote liquide et conservé à −80 °C jusqu’à utilisation. Les activités catalytiques de l’AST et de l’ALT à 340 nm, ainsi que celles de l’ALP et de la γ-GT à 405 nm, ont été déterminées par des méthodes cinétiques UV–VIS selon les recommandations du Panel d’experts de l’IFCC (Fédération internationale de chimie clinique). Les concentrations de protéines totales ont été déterminées selon la méthode de Lowry en utilisant l’albumine sérique bovine comme étalon. Toutes les mesures cinétiques et colorimétriques ont été réalisées à l’aide d’un spectrophotomètre UV-VIS Dynamica HALO DB-20.
Les échantillons de foie de rat ont été homogénéisés dans un tampon phosphate (5 mM, pH 7,4) pour donner un homogénat à 10 % (p/v) puis centrifugés à 4000 tr/min pendant 15 min à 4 °C. Les surnageants ont été utilisés pour estimer l’activité catalytique de la superoxyde dismutase (SOD), le niveau de TBARS, l’activité catalytique de la catalase (CAT) et la concentration de glutathion réduit (GSH) par la méthode colorimétrique. Les concentrations de protéines totales ont été déterminées selon la méthode de Lowry. Toutes les mesures colorimétriques ont été réalisées à l’aide d’un spectrophotomètre UV-VIS Dynamica HALO DB-20.
Le test d’électrophorèse sur gel de cellules isolées en conditions alcalines a été réalisé comme décrit dans la littérature. Les échantillons de foie ont été prélevés, et de petits fragments de foie ont été transférés sur glace. Les fragments ont été lavés, hachés et suspendus dans 1 mL de solution saline équilibrée de Hank glacée (HBSS ; 0,14 g/L CaCl2, 0,4 g/L KCl, 0,06 g/L KH2PO4, 0,1 g/L MgCl2 × 6H2O, 0,1 g/L MgSO4 × 7H2O, 8,0 g/L NaCl, 0,35 g/L NaHCO3, 0,09 g/L Na2HPO4 × 7H2O, 1,0 g/L D-glucose, 20 mM EDTA et 10 % DMSO). Une solution de hachage fraîche a été ajoutée, et les échantillons de foie ont été hachés à nouveau en morceaux plus fins. À partir de la suspension de cellules hépatiques, 10 μL ont été mélangés avec 75 μL d’agarose à bas point de fusion à 1 % (dans du PBS sans Ca+2 et Mg+2, pH 7,4). À partir de la suspension cellule–agarose finale, 85 μL ont été étalés sur la lame de microscope préalablement recouverte d’agarose à point de fusion normal à 1,5 % dans du tampon PBS et recouverts d’une lamelle. Le gel a été laissé prendre à 4 °C, et les cellules ont été lysées pendant une période d’au moins 2 h dans du tampon de lyse froid (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1 % Triton X-100, 10 % DMSO, pH 10,0). Après lyse, les lames ont ensuite été soumises à un déroulement alcalin, puis l’électrophorèse a été réalisée en utilisant le tampon d’électrophorèse (300 mM NaOH et 1 mM EDTA, pH > 13) à 4 °C pendant 30 min à 25 V avec le courant ajusté à 300 mA. Après électrophorèse, les lames ont ensuite été neutralisées avec un tampon de neutralisation (0,4 M Tris-HCl, pH 7,4), trois fois pendant 5 min, et fixées pendant 5 min dans de l’alcool absolu, séchées à l’air et conservées à température ambiante. Immédiatement avant l’analyse, les lames ont été colorées avec 75 μL de bromure d’éthidium (20 μg/mL) et recouvertes d’une lamelle.
Les comètes ont été visualisées et capturées avec l’objectif 400× d’un microscope à fluorescence Nikon (Ti-Eclipse) attaché à une caméra CCD. Cent images de comètes par lame ont été capturées et analysées de manière aléatoire. Les comètes sans têtes et avec presque tout l’ADN dans la queue ou avec une queue large ont été exclues de l’analyse puisqu’elles pourraient représenter des cellules mortes. Les cellules qui ne se chevauchaient pas et présentaient une marge nette les entourant ont été notées.
Trois paramètres ont été sélectionnés comme indicateurs de dommages à l’ADN : le moment de la queue (tail moment), la longueur de la queue (tail length) et le % d’ADN dans la queue de la comète. Selon Collins, les comètes ont été classées en cinq catégories définies comme types 0, 1, 2, 3 et 4 (pas de dommage ou dommage faible, migration de l’ADN faible, moyenne et longue, et niveau de dégradation le plus élevé, respectivement). Le score total des comètes et le pourcentage de réduction (%R) du score total des comètes ont été calculés à l’aide de la Formule (1) : où A est la moyenne du score total dans le témoin positif, B la moyenne du score total lors du prétraitement avec les extraits avant le CCl4, et C est la moyenne du score total dans le témoin négatif.
Les données ont été analysées à l’aide du logiciel statistique SPSS (version 13.0). Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test T3 de Dunnett ou du test de Bonferroni pour la comparaison post hoc entre les témoins et les groupes traités a été utilisée. Les résultats ont été considérés comme statistiquement significatifs à p < 0,05.
Les structures des composés naturels ont été collectées à partir de la base de données PlantMetaChem. Chacun des composés a été récupéré au format Structure Data File (SDF), auquel ont été ajoutés des hydrogènes et des charges (modèle de Gasteiger) au pH physiologique, au moyen de la boîte à outils OpenBabel, et minimisé en énergie grâce au module obconformer d’OpenBabel : le conformère de plus basse énergie a été sélectionné parmi 100 conformations après 100 étapes d’optimisation géométrique à l’aide d’une recherche de Monte-Carlo. Les composés optimisés ont été stockés au format mol2 pour manipulation ultérieure.
Le MDA a été dessiné et modélisé à l’aide du module msketch de Chemaxon au moyen de l’optimisation par mécanique moléculaire, à la suite de quoi la protonation correcte à pH 7,4 a été attribuée.
Le composé I de la catalase de R. norvegicus a été préparé à partir de la structure tridimensionnelle de la catalase érythrocytaire de rat récupérée de la base de données AlphaFold (ID : P04762 (CATA_RAT)) (https://alphafold.ebi.ac.uk ; consultée le 15 mars 2020). La structure a été chargée dans UCSF Chimera et inspectée visuellement. La protéine a été améliorée en ajoutant des atomes d’hydrogène à l’aide du module leap intégré de la suite Amber 12, à la suite de quoi les atomes d’hydrogène corrects, appropriés pour pH 7,4, ont été attribués à chaque résidu d’acide aminé. La protéine a ensuite été minimisée en énergie comme suit : via le module leap, elle a été solvatée avec des molécules d’eau (modèle TIP3P, commande SOLVATEOCT de Chimera) dans une boîte s’étendant sur 10 Å dans toutes les directions, neutralisée avec des ions Na+ ou Cl−, et affinée par une minimisation à point unique à l’aide du module Sander de la suite Amber avec un maximum de 1000 étapes de minimisation d’énergie par descente de gradient et un maximum de 4000 étapes de minimisation d’énergie par gradient conjugué, avec un seuil de non-liaison de 5 Å. À partir du complexe correctement préparé, le composé I de la catalase humaine a été créé au moyen des Chimera Tools, en invoquant le module Build Structure et les fonctions Modify Structure, en changeant l’hybridation appropriée du fer et de l’oxygène au sein de l’état de radical π-cation porphyrine oxoferryle. La structure nouvellement formée a ensuite été minimisée en énergie en suivant exactement la procédure décrite ci-dessus, puis utilisée pour l’amarrage moléculaire.
L’enzyme modélisée a ensuite été manipulée en retirant les atomes d’hydrogène apolaires, tandis que les charges de Gasteiger et les paramètres de solvant ont été ajoutés. Ensuite, les métabolites secondaires de N. cataria obtenus ont été amarrés en utilisant le dispositif expérimental suivant. La racine rigide et les liaisons rotatives ont été définies à l’aide d’AutoDockTools. L’amarrage a été réalisé avec AutoDock 4.2. Avant l’amarrage réel, l’espacement de la grille avait été déterminé au moyen du cycle hème modifié au sein du composé I de la catalase de rat : les coordonnées XYZ (en Ångströms) de la boîte de grille cuboïde utilisée pour le calcul étaient Xmin/Xmax = 3,329/29,969, Ymin/Ymax = 28,466/52,199, Zmin/Zmax = 44,984/67,222 pour englober l’espace couvrant 10 Å dans les trois dimensions. L’algorithme génétique lamarckien a été utilisé pour générer les conformations bioactives au sein du site actif. L’optimisation globale a commencé avec une population de 200 individus positionnés aléatoirement, un maximum de 1,0 × 10⁶ évaluations d’énergie et un maximum de 27 000 générations. Au total, 100 exécutions ont été réalisées avec une tolérance de cluster RMS de 0,5 Å.
Les considérations d’études mécanistiques génotoxiques et antigénotoxiques nécessitent une connaissance approfondie de la structure de la TopIIα de R. norvegicus. Comme mentionné précédemment, la rTopIIα est un homodimère composé de trois sous-régions indépendantes mais fusionnées dans l’action, appelées domaines rN-terminal, de liaison et de clivage de l’ADNr, et rC-terminal. La structure de chaque rN-terminal porte le domaine rATPase ayant pour fonction d’accepter et d’hydrolyser une molécule de rATP avant et lors de la ligation et de la religation de l’ADNr, respectivement. L’interaction de la rATPase avec le rATP induit la dimérisation ou la séparation des domaines, entraînant la fermeture et l’ouverture de la rN-porte, respectivement. La région de liaison et de clivage de l’ADNr est formée par le domaine rTOPRIM (TOpoisomérase/PRImase), qui contient le rMg2+ impliqué dans le mécanisme de clivage de l’ADNr, et la zone rWHD (domaine winged-helix), portant la tyrosine du site actif. Enfin, le rC-terminus lui-même agit comme C-porte.
Par conséquent, les études fondées sur la structure au sein de la région de liaison et de clivage de l’ADN de la rTopIIα ont été réalisées sur une enzyme modélisée par homologie, en utilisant le dispositif expérimental identique à celui décrit ailleurs, au moyen d’AutoDock Vina. L’enzyme a été préparée et chargée dans le logiciel UCSF Chimera et améliorée en ajoutant des atomes d’hydrogène à l’aide du module leap de la suite Amber 12, à la suite de quoi la protonation correcte à pH = 7,4 a été attribuée à chaque résidu d’acide aminé et d’acide nucléique au moyen du module Antechamber de la suite Amber 12. Le complexe a ensuite été solvaté (commande SOLVATEOCT) dans une boîte entrant à 10 Å avec des molécules d’eau (modèle TIP3), neutralisé avec des ions Na+ et Cl−, et affiné par une minimisation à point unique à l’aide du module Sander de la suite AMBER en 1000 étapes de minimisation d’énergie par descente de gradient suivies de 4000 étapes de minimisation d’énergie par gradient conjugué, avec un seuil de non-liaison de 5 Å.
Pour Vina, les coordonnées XYZ (en Ångströms) de la boîte de grille cuboïde utilisée pour le calcul étaient Xmin/Xmax = 4,543/26,767, Ymin/Ymax = 31,324/57,443, Zmin/Zmax = 41,324/75,656 pour englober l’espace couvrant 10 Å dans les trois dimensions. Les simulations d’amarrage ont été menées avec une plage d’énergie de 10 kcal/mol et une exhaustivité de 100 avec une tolérance de cluster RMS de 0,5 Å. La sortie comprenait 20 conformations différentes pour chaque récepteur considéré.
Le rapport ci-joint présente pour la première fois l’analyse LC-ESI-MS/MS des composés phénoliques, ainsi que les activités hépatoprotectrices et antigénotoxiques des extraits méthanoliques de divers organes de la plante N. cataria. Le FME était caractérisé par de fortes concentrations de quercitrine, d’acides chlorogéniques et d’acide quinique, tandis que les composés les plus abondants dans le LME et le SME étaient respectivement l’acide rosmarinique et l’acide chlorogénique.
Les extraits ont été testés in vivo sur des rats Wistar pour étudier l’intoxication hépatique par le CCl4, qui, par activation métabolique, a généré des métabolites hépatotoxiques, à savoir les radicaux trichlorométhyle (rCCl3•) et trichlorométhylperoxyle (rCCl3OO•). En entrant dans les hépatocytes, les radicaux ont induit la peroxydation à base de malondialdéhyde (rMDA) des acides gras polyinsaturés de la membrane de l’hépatocyte. Les extraits examinés ont protégé la membrane de l’hépatocyte de la perturbation, comme évalué par le statut des marqueurs antioxydants hépatiques (rSOD, rTBARS, rCAT et rGSH) et de toxicité (rAST, rALT, rALP et rγ-GT), où les FME, LME et SME de N. cataria aux concentrations respectives de 200, 100 et 50 mg/kg de poids corporel pourraient être considérés comme des candidats potentiels comme suppléments d’hépatoprotection. Une attention particulière a également été accordée aux métabolites secondaires présents dans les extraits, qui ont été étudiés de manière similaire aux extraits. Tous les composés purs testés ont exercé un profil lié à celui des extraits, conduisant à évaluer les composés les plus abondants comme porteurs des propriétés de l’extrait, bien qu’avec certaines synergies restant à étudier. Une procédure informatique a soutenu les données expérimentales et a indiqué que tous les métabolites secondaires peuvent diminuer l’activité catalytique de la rCAT de R. norvegicus, sur la base d’une investigation SB en termes de leur interaction avec le cation radicalaire porphyrine de l’enzyme, appelé composé I de la catalase de R. norvegicus (rCATCmpd I), résultant en l’apparition du rCATCmpd II, se transformant en même temps en radicaux semiquinones correspondants forçant la formation de nouvelles quantités de rH2O2.
Au niveau de l’ADNr, les radicaux rCCl3˙ et rCCl3OO˙ peuvent participer à la génération de rMDA qui pourrait interférer avec l’ADNr hépatique et former des adduits rdG, rdA et rdC, ensuite oxydés en rM1G, rM1A et rM1C avec pour destin de devenir des adduits rN2-oxopropényl-dG, rN2-oxopropényl-dA et rN2-oxopropényl-dC provoquant les réticulations inter-brins ADNr-ADN ou les réticulations inter-brins ADNr-protéine catalysées par la TopIIα de R. norvegicus. En ce sens, les résultats de l’activité antigénotoxique au moyen du test des comètes ont fourni la preuve que tous les extraits testés provoquent une diminution du niveau de dommages à l’ADNr induits par le CCl4, abaissant le score total et le pourcentage de réduction de l’ADNr et empêchant l’apparition des classes de comètes associées aux dommages sévères. Au sein des extraits, les métabolites secondaires trouvés ont exercé une antigénotoxicité en occupant le domaine de liaison et de clivage de l’ADNr de la TopIIα de R. norvegicus, pour lequel ils ont empêché le rMDA de former les adduits aberrants.
Compte tenu du fait que N. cataria est largement utilisée dans les jouets pour animaux de compagnie, ainsi que de son rôle significatif en médecine traditionnelle, les résultats mentionnés ci-dessus confirment pour la première fois l’innocuité de la plante du point de vue de l’absence d’hépatotoxicité et de génotoxicité, et son usage possible comme agent hépatoprotecteur et antigénotoxique.
Encart — synthèse par organe, activités et niveau de preuve
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