Référence : Bioscience Reports 2019. — PMC6684950 · DOI 10.1042/BSR20190697 Type : article de recherche original (étude animale, souris) · Plante : Cataire · Propriété → Foie & vésicule Accès : ⭐ libre → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Nepeta cataria L. est utilisée depuis longtemps dans l’alimentation et la médecine populaires pour plusieurs fonctions. Des huiles essentielles (HE) ont été extraites de Nepeta cataria L. par extraction par fluide supercritique. Les résultats des expériences animales ont montré que les HE de Nepeta cataria L. atténuaient significativement les lésions hépatiques induites par l’acétaminophène. Une étude plus poussée a confirmé que les HE étaient capables d’augmenter l’expression de l’ARNm des uridine-diphosphate-glucuronosyltransférases (UGT) et des sulfotransférases (SULT), ainsi que d’inhiber les activités du CYP2E1, et par là de supprimer la formation d’intermédiaires toxiques. L’activation de Nrf-2 pourrait être impliquée dans la régulation à la hausse des enzymes de Phase II induite par les HE. Dans l’ensemble, nos données apportent la preuve que les HE protègent le foie contre les lésions hépatiques induites par l’acétaminophène, principalement en accélérant le métabolisme inoffensif de l’acétaminophène, ce qui implique que les HE peuvent être considérées comme une ressource naturelle potentielle pour développer un agent hépatoprotecteur.
Mots-clés : huile essentielle ; hépatoprotecteur ; Nepeta cataria L.
Nepeta cataria L. est une herbe annuelle odorante, largement distribuée en Asie, en Europe et en Amérique du Nord depuis la dynastie des Han orientaux. Elle a été traditionnellement et populairement utilisée à la fois comme aliment et comme médicament depuis des milliers d’années. Depuis l’Antiquité, la population de Chine a ajouté la feuille de Nepeta cataria L. aux nouilles et à d’autres aliments traditionnels chinois pour ses capacités anti-microbiennes, anti-inflammatoires, antitussives, antioxydantes et anti-cancéreuses. En tant que médicament, certaines thérapies cliniques sont également rapportées dans la littérature. La recherche d’autres composés actifs a conduit à la découverte et à l’isolement de nombreux phytochimiques et huiles essentielles (HE) présentant une activité anti-bactérienne intéressante.
Les lésions hépatiques d’origine médicamenteuse sont devenues un sujet majeur dans le domaine de l’hépatologie et de la gastro-entérologie. Le surdosage en APAP (acétaminophène/paracétamol) est la principale cause d’insuffisance hépatique aiguë d’origine médicamenteuse. Le stress oxydatif est considéré comme l’événement cellulaire primaire dans les lésions hépatiques induites par l’acétaminophène. En cas de prise en surdosage, la majeure partie de l’APAP est métabolisée par les enzymes de conjugaison de Phase II, principalement la sulfotransférase (SULT) et l’UDP-glucuronosyltransférase (UGT), qui le convertissent en composés non toxiques ensuite excrétés dans l’urine. Sur l’APAP restant, environ 5 à 9 % est métabolisé par les enzymes du cytochrome P450 (CYP), principalement le CYP2E1, en un métabolite intermédiaire hautement réactif, la N-acétyl-p-benzoquinone imine (NAPQI). Habituellement, la NAPQI est rapidement détoxifiée par conjugaison avec le glutathion (GSH). Cependant, lorsque les enzymes métabolisantes de Phase II sont saturées après un surdosage en APAP, l’excès de NAPQI épuise le GSH, entraînant la liaison covalente des groupes sulfhydryles des protéines cellulaires ; il en résulte un stress oxydatif hépatique.
Dans la présente étude, nous avons constaté que les HE de Nepeta cataria L. ont une capacité de protection hépatique contre les lésions hépatiques induites par l’acétaminophène.
L’HE issue de la feuille de Nepeta cataria L. a été extraite par un système d’extraction au CO₂ supercritique. Le réglage des paramètres a été choisi sur la base de la température, de la pression et du temps statique, qui avaient une efficacité cruciale sur l’extraction de l’HE par extraction par fluide supercritique (SFE). Les principaux paramètres d’extraction de l’HE par SFE ont été sélectionnés d’après l’expérience pratique. Le CO₂ supercritique a été utilisé comme agent d’extraction. La procédure d’extraction a été opérée dans les conditions optimisées : pression d’extraction de 35 MPa, température d’extraction de 50 °C, débit de CO₂ de 20 l/h, pression de séparation de 6 MPa, température de séparation de 40 °C et 1,5 h pour les niveaux variables, respectivement. La SFE couplée à la cuve d’extraction de 5000 ml a été utilisée pour l’HE à partir de 5,0 kg de poudre de Nepeta cataria L. dans les conditions sélectionnées. Environ 165 g d’HE ont été recueillis.
Le protocole expérimental a été examiné et approuvé par le Comité d’éthique de la Quatrième Université médicale militaire pour l’utilisation d’animaux de laboratoire. Un total de 50 souris consanguines Kunming (moitié mâles, moitié femelles ; 18–20 g) âgées de 4 semaines a été obtenu auprès du centre animalier de la Quatrième Université médicale militaire (Shanxi, Chine). Les animaux ont été maintenus dans des conditions contrôlées à une température de 22 ± 2 °C, une humidité de 70 ± 4 %, avec un cycle lumière–obscurité de 12 h.
Les souris ont été réparties au hasard en cinq groupes, dix souris par groupe (n = 10, cinq mâles et cinq femelles). Groupe témoin : solution aqueuse de Tween-80 à 1 % (100 ml/kg) ; groupe APAP : 300 mg/kg ; groupe HE-APAP : l’HE a été émulsionnée dans une solution aqueuse de Tween-80 à 1 %, puis 100 ml/kg de Tween-80 à 1 % ont été administrés par voie orale après le traitement par injection intrapéritonéale d’APAP (300 mg/kg) pendant 1 h ; groupe N-acétylcystéine (NAC)-APAP : la NAC (100 mg/kg) émulsionnée dans une solution aqueuse de Tween-80 à 1 %, puis administrée par voie orale après le traitement par injection intrapéritonéale d’APAP pendant 1 h ; groupe HE : l’HE a été émulsionnée dans une solution aqueuse de Tween-80 à 95 % (100 ml/kg). Les souris ont été traitées par voie intragastrique avec les HE après l’acétaminophène pendant 3 jours.
Les activités enzymatiques de l’aspartate aminotransférase (AST) et de l’alanine aminotransférase (ALT) dans le sérum ont été évaluées par spectrophotomètre à l’aide de kits de diagnostic commerciaux (Nanjing Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Chine).
Les tissus hépatiques congelés ont été homogénéisés dans du PBS glacé. Les surnageants ont été recueillis après centrifugation de l’homogénat à 3000 g, 4 °C pendant 10 min. Les taux de superoxyde dismutase (SOD), de catalase (CAT) et de malondialdéhyde (MDA) ont été mesurés par spectrophotomètre à l’aide des kits de dosage disponibles dans le commerce selon les instructions de chaque fabricant (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine). Les taux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ont été dosés par détecteur de fluorescence à l’aide de kits commerciaux (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine). La concentration protéique dans les homogénats tissulaires a été mesurée par dosage protéique de Bradford en utilisant l’albumine sérique bovine comme étalon (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine).
L’ARNm total a été isolé des tissus hépatiques congelés à l’aide d’un kit d’ARN total (Tiangen, Pékin, Chine). Une PCR quantitative en temps réel (qPCR) a été réalisée pour l’amplification de l’ADNc en utilisant le 2×SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, Chine). La procédure de PCR consistait en 95 °C pendant 30 s, suivies de 35 cycles de 95 °C pendant 15 s, 58 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s. Les amorces de PCR utilisées sont indiquées dans le Tableau 1. L’analyse de la courbe de fusion a été réalisée sur les produits de PCR pour vérifier la spécificité des amorces et la pureté du produit. Une courbe de dissociation a été réalisée pour chaque plaque afin de confirmer la production d’un produit unique. L’abondance relative de chaque ARNm a été calculée avec la formule 2^−(ΔΔCₜ), où ΔΔCₜ = (Cₜ Cible − Cₜ GAPDH) traitement − (Cₜ Cible − Cₜ GAPDH) témoin.
Tableau 1. Amorces utilisées pour la qPCR
| Gène cible | Sens 5′–3′ | Antisens 5′–3′ |
|---|---|---|
| Nrf2 | GCTGATGGAGTACCCTGAGGCTAT | ATGTCCGCAATGGAGGAGAAGTCT |
| HO-1 | TGCCAGTGCCACCAAGTTCAAG | TGTTGAGCAGGAACGCAGTCTTG |
| NQO1 | GGAGACAGCCTCTTACTTGCCAAG | CCAGCCGTCAGCTATTGTGGATAC |
| GCLC | TGAGATTTAAGC CCCCTCCT | TTGGGATCAGTCCAGGAAAC |
| GSTA2 | TCAGTAACCTGCCCACAGTGAAG | GCATGTTCTTGACCTCTATGGCTGG |
| UGT1A1 | CACGCTGGGAGGCTGTTAGT | CACAGTGGGCACAGTCAGGTA |
| UGT1A6 | CACGTGCTACCTAGAGGCACAG | GACCACCAGCAGCTTGTCAC |
| UGT1A9 | GAAGAACATGCATTTTGCTCCT | CTGGGCTAAAGAGGTCTGTCATAGTC |
| SULT1A1 | CCCGTCTATGCCCGGATAC | GGGCTGGTGTCTCTTTCAGAGT |
| SULT2A1 | TAGGGAAAAATTTAGGGCCAGAT | TTGTTTTCTTTCATGGCTTGGA |
| CYP2E1 | CACCGTTGCCTTGCTTGTCTG | CTCATGAGCTCCAGACACTTC |
| GAPDH | ACATGGCCTCCAAGGAGTAAGA | GATCGAGT TGGGGCTGTGACT |
Abréviations : GCLC, sous-unité catalytique de la glutamate-cystéine ligase ; GSTA2, glutathion S-transférase A 2 ; HO-1, hème oxygénase-1 ; Nrf2, facteur nucléaire érythroïde 2-lié 2 ; NQO1, NAD(P)H:quinone oxydoréductase 1.
Un petit morceau de tissu hépatique a été prélevé et fixé dans du paraformaldéhyde à 10 %. Après lavage à l’eau distillée, il est soumis à une série d’opérations telles que déshydratation, transparisation, inclusion en paraffine et coupe. Les coupes ont été contre-colorées à l’hématoxyline après coloration à la diaminobenzidine. Les photomicrographies ont été prises avec un appareil photo numérique.
Pour l’analyse de l’expression du facteur nucléaire érythroïde 2-lié 2 (Nrf2), l’extraction et l’isolement des protéines cytoplasmiques et nucléaires ont été réalisés à l’aide d’un kit d’extraction de protéines cytoplasmiques et nucléaires (Beyotime, Nanjing, Chine) selon les instructions du fabricant. Pour l’analyse de l’expression du CYP2E1, l’extraction et l’isolement des protéines microsomales ont été effectués comme décrit précédemment. La concentration protéique a été déterminée par kit de dosage BCA (Beyotime, Nanjing, Chine). Des quantités égales d’extraits protéiques ont été soumises à une électrophorèse sur gel de SDS/polyacrylamide dans des conditions réductrices, sur gel de concentration à 5 % (pH = 6,8) et gel de séparation à 12 % (pH = 8,8). Les protéines séparées ont été transférées sur des membranes PVDF par transfert en cuve pendant 2 h à 200 mA dans un tampon Tris-glycine avec 15 % de méthanol. Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % pendant 3 h et incubées pendant 12 h avec l’anti-CYP2E1 (1:1500, BOSTER, Wuhan, Chine), l’anti-Nrf-2 (1:500, Bioss, Pékin, Chine), l’anti-GAPDH (1:1000, BOSTER, Wuhan, Chine) et l’anti-Lamine B (1:500, Bioss, Pékin, Chine) pendant 2 h à 37 °C. Les anticorps secondaires (IgG/HRP) ont été incubés pendant 2 h à 37 °C. Les images des blots ont été visualisées par ECL (Genshare, Xi’an, Chine).
Les résultats ont été présentés comme la moyenne d’au moins cinq mesures, dupliquées pour chaque série, ayant un coefficient de variation inférieur à 5 %. ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Duncan (P < 0,05) avec SPSS 20.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, États-Unis).
L’APAP peut induire des lésions hépatiques par le stress oxydatif et l’inflammation. L’ALT et l’AST étaient des marqueurs importants de lésion hépatique. Les taux d’ALT et d’AST étaient significativement augmentés de 2,67 fois et 2,06 fois respectivement dans le groupe APAP, comparativement au groupe témoin (Figure 1F), suggérant que le traitement par APAP induisait une lésion hépatique. Les taux d’ALT et d’AST ne présentaient pas de différence significative dans les groupes de traitement HE-APAP et NAC-APAP, suggérant que les HE peuvent prévenir la lésion hépatique induite par l’APAP.
Les résultats des coupes pathologiques ont montré que les souris témoins avaient une architecture hépatique normale, tandis que les souris traitées par APAP présentaient une atteinte hépatocellulaire. Plus de la moitié des hépatocytes centrolobulaires étaient tuméfiés avec une vacuolisation cytoplasmique marquée et des noyaux condensés. Le traitement par les HE de Nepeta cataria L. atténuait nettement les lésions nécrotiques induites par l’APAP (Figure 1A–E). En combinant les résultats de la Figure 1, les HE de Nepeta cataria L. ont une capacité protectrice pour prévenir la lésion hépatique induite par l’APAP.
Pour étudier l’effet des HE sur les caractéristiques antioxydantes hépatiques, les taux de marqueurs du stress oxydatif ont été examinés dans le modèle de souris induites par l’APAP. Comme le montre la Figure 2, le traitement par APAP augmentait significativement la teneur en MDA et en ROS de 2,38 fois et 1,92 fois respectivement. Et l’administration d’APAP entraînait une diminution significative de l’activité de la SOD et de la CAT de 0,72 fois et 0,44 fois. L’APAP en surdosage était métabolisé par les enzymes CYP2E1 en NAPQI, qui subit une conjugaison chimique et enzymatique au GSH dans la toxicité de l’APAP. Cela pouvait conduire à une peroxydation lipidique, les activités des enzymes antioxydantes pouvaient être réduites et les taux de ROS augmentés. Ici, l’APAP augmentait les taux de MDA et de ROS et diminuait les activités de la SOD et de la CAT, suggérant que le dysfonctionnement hépatique induit par l’APAP est causé par le stress oxydatif.
L’administration d’HE-APAP prévenait la diminution de la SOD et de la CAT de 1,32 fois et 2,2 fois, et réduisait les taux de ROS et de MDA de 0,53 fois et 0,57 fois respectivement. Le traitement par les HE n’augmentait pas significativement les activités de la SOD et de la CAT mais diminuait significativement les taux de ROS comparativement au groupe témoin (P < 0,05), suggérant que les HE ont la capacité d’éliminer les ROS.
Nrf2 est une sorte de facteur de transcription qui module les antioxydants endogènes et les enzymes antioxydantes. Les ROS stimulent l’activation de Nrf2, qui se lie à l’élément de réponse antioxydante et active davantage la transcription des gènes codant pour les antioxydants et les détoxifiants comme l’hème oxygénase-1 (HO-1), la NAD(P)H:quinone oxydoréductase 1 (NQO1) et les enzymes de synthèse du glutathion, comme la sous-unité catalytique de la glutamate-cystéine ligase (GCLC). Pour étudier l’effet des HE sur l’expression des gènes Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC et glutathion S-transférase A 2 (GSTA2), leur ARNm a été dosé par qPCR. Comme le montre la Figure 3, les traitements par APAP diminuaient significativement les taux de GCLC et de GSTA, le traitement par HE-APAP atténuait la diminution des taux de GCLC et de GSTA induite par l’APAP. Les HE augmentaient significativement les taux de Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC et GSTA2, suggérant que les HE peuvent médier des activités biologiques antioxydantes.
L’APAP et ses principaux conjugués dans le plasma ont été analysés. Comme le montre la Figure 4A, comparativement au groupe traité par APAP, la concentration d’APAP était diminuée, tandis que l’APAP-gluc et l’APAP-sulf étaient augmentés dans le traitement APAP-HE. Les résultats montrent que les HE peuvent augmenter le métabolisme de l’APAP en APAP-gluc et APAP-sulf.
L’APAP a deux voies métaboliques dans le foie : l’une est une voie non toxique, l’APAP était métabolisé en APAP-gluc et APAP-sulf par la famille UGT et la famille SULT et excrété dans le sang et la bile. L’UGT1A6 et l’UGT1A1 sont les principales enzymes impliquées dans la glucuronidation de l’APAP. L’augmentation des taux d’UGT1A6 et d’UGT1A1 renforçait la résistance à la toxicité de l’APAP. Dans la présente étude, les taux d’UGT1A1, UGT1A6, UGT1A9, SULT1A1, SULT2A1 étaient significativement augmentés après les traitements par HE, suggérant que les HE peuvent renforcer le métabolisme de l’APAP par la voie non toxique. La famille UGT et la famille SULT sont essentielles pour l’induction de l’expression génique par Nrf2 avec la séquence consensus TGAG/CNNNGC (N représente n’importe quelle base). Comme le montre le résultat, les HE augmentaient significativement l’expression de l’ARNm de Nrf2 (Figure 3C). Le Nrf2 activé était transféré du cytoplasme vers le noyau, l’expression relative nucléaire/cytosolique était significativement augmentée dans le groupe traité par HE, suggérant que les HE ont induit le transfert de Nrf2 du cytoplasme vers le noyau, ce qui conduit ensuite à l’activation transcriptionnelle des enzymes antioxydantes, telles que HO-1, SOD, CAT (Figures 2 et 3) et de l’enzyme métabolique de Phase II, telle que UGT, SULT (Figure 4).
La seconde voie métabolique de l’APAP était toxique. L’APAP en surdosage était métabolisé en NAPQI par le CYP2E1. Dans la présente étude, l’expression du CYP2E1 était significativement augmentée par le traitement par APAP et diminuée par le traitement par HE (Figure 4). Les souris déficientes en CYP2E1 étaient résistantes à la lésion hépatique induite par l’APAP, tandis que les souris transgéniques exprimant le CYP2E1 humain étaient sensibles à la conversion de l’APAP en NAPQI. Nos résultats montrent que les HE inhibent l’expression du CYP2E1 pour lutter contre la lésion hépatique.
Ensemble, les HE induisaient l’activité de Nrf2, le Nrf2 activé assurant l’activation transcriptionnelle de l’UGT et de la SULT. Les HE accéléraient le métabolisme non toxique de l’APAP en APAP-gluc et APAP-sulf en renforçant les taux d’UGT et de SULT, ainsi que l’inhibition du CYP2E1, ce qui diminuait la formation de NAPQI.
L’APAP est métabolisé par sulfatation, glucuronidation et oxydation par le CYP. Les voies de sulfatation et de glucuronidation sont considérées comme des voies de détoxification, tandis que la voie d’oxydation par le CYP génère la NAPQI, une espèce réactive et toxique. En cas de toxicité de l’acétaminophène, les enzymes de conjugaison de Phase II sont saturées, et une fraction plus importante est convertie en NAPQI, ce qui conduit à un stress oxydatif du foie. Les ROS sont l’un des facteurs majeurs de la progression du stress oxydatif. Nrf2 est probablement activé par les changements de statut redox induits par la NAPQI. Sur le plan mécanistique, le Nrf2 activé se transfère du cytoplasme vers le noyau, puis conduit à l’activation transcriptionnelle des enzymes antioxydantes, telles que la NADPH:quinone oxydoréductase 1 (NQO1), HO-1, la glutamate cystéine ligase (GCL) et la GSTA, ce qui augmentait l’expression de la SOD et de la CAT. En outre, l’APAP causait de graves lésions hépatiques caractérisées par une augmentation significative des taux sériques d’AST et d’ALT, des ROS et du MDA hépatique, ainsi que par une déplétion de la SOD et de la CAT hépatiques.
La NAC peut être utilisée pour détoxifier l’empoisonnement à l’acétaminophène. Elle possède les fonctions d’anti-oxydation, de piégeage des radicaux libres oxygénés, de prévention des dommages à l’ADN, de régulation de l’activité métabolique cellulaire, de régulation de l’expression génique et de la transduction du signal, et d’inhibition de la production de médiateurs inflammatoires dans l’organisme. La NAC dispose de l’approbation de la FDA pour le traitement des doses potentiellement hépatotoxiques d’APAP. C’est pourquoi nous avons utilisé la NAC comme médicament de contrôle positif.
Le premier écrit sur Nepeta cataria L. a été documenté dans l’ancien livre d’herboristerie chinois Ben-Cao-Gang-Mu (dynastie Ming, par Shizhen Li). Le livre indiquait que les feuilles cuites et les tiges tendres de Nepeta cataria L. pouvaient servir d’aliment et de thé. L’HE était extraite par différentes méthodes. La méthode SFE a été choisie dans les industries alimentaires, et a été largement utilisée pour éliminer les ions métalliques de diverses matrices solides et liquides d’échantillons environnementaux. Différentes régions cultivant Nepeta cataria L. ont une variété d’ingrédients différents, et des usages pour différentes fonctions. Cependant, la fonction de Nepeta cataria L. n’était pas claire.
Dans nos études, nous avons constaté que les HE de Nepeta cataria L. régulaient à la hausse l’expression et les activités de Nrf2 et des enzymes de détoxification incluant les UGT et les SULT, ainsi qu’inhibaient l’activité du CYP2E1, ce qui diminuait la concentration plasmatique d’APAP et accélérait le métabolisme inoffensif de l’APAP. Nos données ont également montré que l’efficacité des HE était aussi bonne que celle de la NAC.
En résumé, les HE de Nepeta cataria L. sont efficaces dans les lésions hépatiques induites par l’APAP. Elles peuvent être considérées comme une ressource naturelle potentielle pour développer un agent hépatoprotecteur et un additif alimentaire en remplacement des antibiotiques. Les résultats de la présente étude pourraient fournir un aliment fonctionnel utile et améliorer la compréhension des caractéristiques antioxydantes des HE de l’herbe traditionnelle Nepeta cataria L.
Ce travail a été soutenu par la fondation de la Natural Science Foundation of Shaanxi Province [numéro de subvention SXZRKXJJ-17775]. Ce travail a également été soutenu par des subventions du Youth Innovation Fund of The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University [numéro de subvention YNQN 2017053].
Les auteurs déclarent qu’il n’existe aucun conflit d’intérêts associé au manuscrit.
F.Q. a fourni l’idée de cet article. J.T. et le Pr F.Q. ont contribué à parts égales aux données et à la rédaction de cet article.
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