Référence : Evid Based Complement Alternat Med 2010. — PMC2862927 · DOI 10.1093/ecam/nem172 Type : étude in vivo (carcinogenèse, rat) · Plante : Consoude officinale · Propriété → Sécurité & interactions Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
La consoude, ou Symphytum officinale (L.) (Boraginaceae), est une plante très populaire utilisée à des fins thérapeutiques. Depuis les années 1980, ses effets ont été étudiés dans des études de carcinogenèse à long terme, dans lesquelles l’extrait de consoude est administré à fortes doses pendant plusieurs mois et les lésions hépatiques néoplasiques sont évaluées. Cependant, la littérature consacrée à ce sujet est très pauvre en ce qui concerne les études réalisées selon des protocoles de carcinogenèse à court terme, tels que le « modèle de l’hépatocyte résistant » (MHR). Dans ces études, il est possible d’observer facilement les phénomènes liés aux phases précoces du développement tumoral, puisque les lésions prénéoplasiques (LPN) apparaissent après environ 1 à 2 mois d’induction chimique. Dans la présente étude, les effets d’un traitement oral chronique de rats par un extrait éthanolique de consoude à 10 % ont été évalués dans un MHR. Des rats Wistar ont été traités séquentiellement par la N-nitrosodiéthylamine (voie intrapéritonéale) et le 2-acétylaminofluorène (voie orale), puis soumis à une hépatectomie afin d’induire la promotion de la carcinogenèse. Une analyse quantitative macroscopique et microscopique des LPN a été réalisée. Des tests statistiques non paramétriques (Mann–Whitney et χ²) ont été utilisés, et le seuil de significativité a été fixé à P ≤ 0,05. Le traitement par la consoude a réduit le nombre de lésions prénéoplasiques macroscopiques mesurant jusqu’à 1 mm (P ≤ 0,05), le pourcentage de cellules ovales (P = 0,0001) et de figures mitotiques (P = 0,007), ainsi que le nombre de cellules positives à l’antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA) (P = 0,0001) et de nodules prénéoplasiques acidophiles (P = 0,05). En revanche, le pourcentage de cellules présentant une mégalocytose (P = 0,0001) et une dégénérescence vacuolaire (P = 0,0001) était accru. Les scores de fibrose, les réserves de glycogène et le nombre de régions organisatrices du nucléole n’étaient pas modifiés. L’étude a indiqué que le traitement oral de rats par un extrait alcoolique de consoude à 10 % réduisait la prolifération cellulaire dans ce modèle.
L’étude systématique des plantes couramment consommées et capables de modifier le processus de carcinogenèse s’est considérablement développée au cours des dernières années. La consoude, ou Symphytum officinale (L.) (Boraginaceae), est une plante à croissance rapide dont les feuilles et les racines sont utilisées à des fins thérapeutiques depuis le XVIe siècle, notamment pour améliorer la cicatrisation des plaies. Depuis les années 1930, elle a été utilisée dans l’alimentation animale, mais cet usage a été interdit en Australie et en Nouvelle-Zélande.
Les effets toxiques de la consoude ont été décrits au début des années 1980 et, depuis lors, divers alcaloïdes pyrrolizidiniques, tels que la lasiocarpine, la lycopsamine, l’intermédine, la symlandine, la riddelliine et principalement la symphytine, ont été identifiés. Chou et Fu ont récemment établi que des produits métaboliques des alcaloïdes pyrrolizidiniques, tels que les adduits à l’ADN dérivés de la 6,7-dihydro-7-hydroxy-1-hydroxyméthyl-5H-pyrrolizine (DHP), se formaient dans le foie de rates F344 et pouvaient être associés à ses effets toxiques.
Dans des protocoles à long terme, il a été démontré que ces principes actifs étaient hépatotoxiques, mutagènes et carcinogènes. Mei et ses collègues ont observé que l’administration alimentaire de consoude entraînait des modifications marquées de l’expression génique hépatique, du poids corporel et de la fréquence des mutations. Hirono et ses collègues ont démontré que les alcaloïdes pyrrolizidiniques induisaient des adénomes hépatocellulaires et des hémangiosarcomes avec métastases pulmonaires. Une grave maladie veino-occlusive était également présente dans le foie, caractérisée par un gonflement des hépatocytes, la formation de bourgeonnements membranaires, une prolifération endothéliale et une nécrose hémorragique périveinulaire avec dépôt de réticuline. Une maladie hépatique a également été constatée dans des cas d’intoxication chronique chez l’être humain, bien que certains aspects de la toxicité de la consoude chez l’être humain aient récemment été réexaminés.
Parmi les diverses démonstrations des effets carcinogènes de la consoude, peu d’études ont rapporté ses effets antinéoplasiques. Néanmoins, les informations actuelles concernant son action aux stades initiaux du processus carcinogène — qui pourraient être facilement mis en évidence dans des protocoles à court terme — sont très limitées. En outre, la plupart des études de carcinogenèse hépatique à court terme ont été réalisées à l’aide de principes actifs isolés.
Les modèles expérimentaux de carcinogenèse hépatique constituent une méthode simple et fréquemment utilisée pour étudier la genèse et l’évolution des néoplasmes, en raison de la taille de cet organe et de sa susceptibilité au cancer. De même, ces modèles à court terme — hépatectomie associée au traitement des animaux par des substances carcinogènes — sont rapides à mettre en œuvre et permettent un contrôle rigoureux des conditions expérimentales, sans perdre les particularités in vivo de la carcinogenèse. Le modèle utilisé dans le présent travail, le modèle de l’hépatocyte résistant (MHR), a été décrit pour la première fois par Solf et Faber. Ainsi, une dose unique de N-nitrosodiéthylamine (DEN) et de faibles doses répétées de 2-acétylaminofluorène (AAF), tous deux agents initiateurs, sont administrées conjointement à une hépatectomie, laquelle agit comme stimulus de promotion. Dans ce modèle, les lésions prénéoplasiques (LPN) peuvent être observées dans le foie dès 5 à 10 jours après l’hépatectomie. À l’inverse, dans les modèles à long terme, le traitement prolongé par des carcinogènes sans intervention chirurgicale exige beaucoup plus de temps pour obtenir les mêmes lésions.
Dans la présente étude, ce modèle a été utilisé pour étudier les effets de l’extrait de consoude sur le développement des LPN hépatiques précoces.
Des rats Wistar mâles adultes pesant de 200 à 250 g ont été utilisés. Ils étaient maintenus dans des cages conventionnelles en plastique, à raison de cinq rats au maximum par cage, dans une pièce exclusivement réservée à cet usage, et étaient exposés à un cycle lumineux contrôlé — éclairage de 6 h 30 à 18 h 30 — ainsi qu’à une température fixée à 22 ± 2 °C. La nourriture et la boisson étaient fournies à volonté. Toutes les procédures de soins et d’entretien des animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices des BPL brésiliennes.
Les procédures éthiques reposaient sur la loi brésilienne 6638 du 8 mai 1979, « Normes relatives à la pratique didactique et scientifique de la vivisection animale », conforme à la « Convention européenne sur la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres fins scientifiques » du 18 mars 1986, à Strasbourg. Pour des raisons humanitaires, les rats moribonds ont été sacrifiés sous anesthésie profonde.
Un kilogramme de feuilles de consoude récoltées à la FCAV, campus de Jaboticabal (São Paulo, Brésil), pendant l’hiver — au mois de juillet au Brésil — a été mis à macérer dans 1 l d’éthanol à 93 % et laissé au repos pendant 10 jours à température ambiante, soit 25 ± 3 °C. Après cette période, le mélange a été filtré sur du papier-filtre conventionnel, puis soumis à des procédés d’évaporation afin d’obtenir l’extrait éthanolique.
L’extrait de consoude à 10 % a été administré à tous les groupes trois fois par semaine, à raison d’un volume de 0,02 ml/kg⁻¹ de poids corporel, pendant toute la période expérimentale. Cette concentration d’extrait a été choisie afin de reproduire la méthode populaire de préparation des feuilles pour laquelle des effets toxiques ont été décrits. Chaque groupe — N = 20 au début de l’étude — a reçu le traitement par gavage ; le groupe témoin a reçu de l’eau distillée et le groupe expérimental l’extrait dilué dans de l’eau distillée.
Les décès sont fréquents dans le MHR et les rats morts pendant l’étude n’ont pas été analysés. À la fin de l’étude, huit rats avaient survécu dans le groupe témoin et neuf dans le groupe expérimental. Le protocole de carcinogenèse était celui présenté dans le schéma suivant :
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DEN : N-nitrosodiéthylamine (SIGMA, Saint-Louis, États-Unis), diluée dans du NaCl à 0,9 % ; 2AAF : 2-acétylaminofluorène (SIGMA, Saint-Louis, États-Unis), dilué dans de l’huile de maïs.
Ce modèle, y compris la technique d’hépatectomie, a été adapté de Dagli et de ses collègues. Toutes les substances carcinogènes ont été manipulées dans une enceinte à évacuation d’air contrôlée. Tous les membres du personnel concernés portaient des masques appropriés munis de filtres contre les poudres et les substances volatiles, des lunettes de sécurité et deux paires de gants. Tout le matériel utilisé pour les injections ou le gavage a été éliminé dans des conteneurs appropriés destinés aux déchets dangereux.
Après le sacrifice, le nombre de LPN présentes à la surface du foie a été dénombré et classé en fonction de leur diamètre : (1) < 1 mm, (2) environ 1 mm et (3) > 1 mm.
Une tranche centrale de 5 mm d’épaisseur a été prélevée dans le lobe latéral gauche du foie et fixée pendant 4 h dans une solution de Carnoy — chloroforme, acide acétique glacial et alcool absolu dans un rapport de 3:1:6. Ce matériel a été traité selon les méthodes histologiques habituelles et coloré à l’hématoxyline-éosine, pour les régions organisatrices du nucléole à l’argent (AgNOR), au trichrome de Masson et par la réaction à l’acide périodique-Schiff (PAS). Les procédures immunohistochimiques ont également été réalisées à partir du même matériel inclus en paraffine.
Pour réaliser l’histométrie des types cellulaires et des figures mitotiques, des photomicrographies de cinq champs prédéterminés — partie supérieure, partie inférieure, côtés et centre du fragment — de chaque coupe hépatique ont été obtenues à l’aide d’un objectif ×200. Une grille comportant 200 points, imprimée sur un film transparent, a été superposée aux photographies et le nombre de points d’intersection correspondant à chaque structure a été enregistré. Les structures dénombrées étaient les suivantes : cellules ovales — cellules souches hépatiques —, hépatocytes non mégalocytiques et mégalocytiques — y compris les hépatocytes multinucléés —, cellules dégénérées ou vacuolisées et figures mitotiques — y compris les mitoses typiques et atypiques.
Les LPN ont été classées selon des profils « acidophile », « mixte » et « clair », et le nombre total de LPN de chaque type par coupe a été directement dénombré au microscope (Alphaphot, Nikon, Japon). La fibrose a été évaluée comme suit, sur la base de la coloration au trichrome de Masson :
SCORE 0 : aucun signe de fibrose
SCORE 1 : fibrose périportale discrète
SCORE 2 : fibrose périportale et internodulaire
SCORE 3 : fibrose périportale et internodulaire et épaississement de la capsule
La même méthode de cotation a été utilisée pour quantifier la teneur en glycogène des cellules hépatiques par coloration PAS, comme suit :
SCORE 0 : absence de granules
SCORE 1 : granulation faible et diffuse
SCORE 2 : granulation forte et multifocale
SCORE 3 : granulation forte et diffuse
Des lames complémentaires ont été préparées pour identifier les protéines AgNOR par une méthode de coloration argentique et pour le marquage du PCNA par immunohistochimie. Les NOR ont été dénombrées selon la méthode décrite par Zaczek et ses collègues. Le nombre de NOR présentes dans les préparations histologiques reflète la quantité de gènes ribosomiques actifs et, par conséquent, l’état prolifératif des tissus. Cette méthode est adaptée à la détection des stades précoces de la prolifération cellulaire, notamment l’interphase du cycle cellulaire, avant la formation des figures mitotiques.
Le dénombrement des cellules positives au PCNA a été réalisé en soumettant les lames à une pression élevée à chaud, suivie d’une incubation nocturne avec un anticorps anti-PCNA dilué au 1:100 — anticorps de souris dirigé contre le PCNA humain, clone PC-10, DAKO. Le système d’amplification LSAB a également été utilisé. Les lames ont été contre-colorées à l’hématoxyline. Cinq champs microscopiques ont été sélectionnés au hasard et 500 cellules ont été dénombrées sur chaque lame. La méthode PCNA révèle les cellules positives en « phase S du cycle », c’est-à-dire les cellules aux stades précoces de la duplication. Les cellules positives présentaient une forte réactivité nucléaire. Le nombre de cellules positives et négatives a été enregistré.
Toutes les procédures de quantification ont été réalisées en aveugle.
Un test F de comparaison des variances a d’abord été réalisé afin de vérifier la distribution gaussienne des variables. À la suite de cette analyse, des tests non paramétriques de Mann–Whitney — pour le dénombrement des LPN et des NOR ainsi que pour l’évaluation de la fibrose et des granules de glycogène — et un test χ² — pour le dénombrement cellulaire — ont été utilisés. Les valeurs de P ont été fixées à P ≤ 0,05.
Le dénombrement des LPN à la surface du foie est présenté dans la figure 1. Le nombre de nodules mesurant 1 mm de diamètre ou moins était significativement réduit chez les rats traités par la consoude par rapport aux témoins.
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Les pourcentages des différents types cellulaires sont présentés dans le tableau 1. Par rapport au groupe témoin, le groupe expérimental présentait une augmentation significative du pourcentage de cellules mégalocytiques et vacuolisées, ainsi qu’une diminution des cellules ovales, des cellules positives au PCNA et des mitoses.
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Le nombre de NOR par champ ainsi que les scores de fibrose et de granulation glycogénique sur les coupes hépatiques, respectivement colorées au trichrome de Masson et par la méthode PAS, ne différaient pas entre les groupes. Le tableau 2 présente le nombre de LPN selon la classification des nodules. Le groupe expérimental présentait une réduction significative des nodules acidophiles par rapport au groupe témoin.
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Ce comportement cellulaire suit la séquence nodules clairs, mixtes, acidophiles puis basophiles, selon leur agressivité.
En résumé, les résultats ont montré un effet protecteur net de l’extrait de consoude aux stades précoces de la carcinogenèse hépatique induite.
Dans ce travail, les effets présumés de l’extrait de consoude sur les stades initiaux du développement néoplasique ont été étudiés. Des critères macroscopiques et microscopiques ont été pris en compte pour évaluer sa capacité à modifier les paramètres de prolifération.
Macroscopiquement, le nombre de LPN était réduit par le traitement à l’extrait de consoude, principalement pour les lésions mesurant 1 mm ou moins. Ce résultat particulier suggère que l’extrait de consoude était capable de moduler les stades précoces du développement des LPN. Ces constatations macroscopiques étaient étayées par les observations microscopiques. L’augmentation du pourcentage de cellules hépatiques mégalocytiques et vacuolisées, associée à la diminution du pourcentage de cellules ovales, de cellules positives au PCNA, de figures mitotiques et du nombre de nodules acidophiles, converge vers l’hypothèse d’un effet antiprolifératif. En fonction du phénotype cellulaire, les nodules prénéoplasiques sont classés selon les indicateurs d’agressivité suivants : cellules claires — vacuolisées ou dégénérées —, cellules mixtes — cellules acidophiles et vacuolisées au sein du même nodule —, cellules acidophiles — synthèse protéique intense — et cellules basophiles — activité proliférative intense.
Il est important de noter que les cellules ovales et les nodules acidophiles sont des manifestations typiques de l’établissement tumoral précoce. Leur réduction indique donc également une propriété antinéoplasique qualitative.
Outre les constatations décrites précédemment, l’augmentation du pourcentage de mégalocytose ainsi que la diminution des cellules positives au PCNA et des cellules présentant un phénotype mitotique suggèrent également des effets antimitotiques. Certains auteurs considèrent la mégalocytose comme une « mitose avortée », au cours de laquelle la cellule se prépare à se diviser, mais où la télophase ne se produit pas. Ce phénotype a été décrit par d’autres auteurs dans des modèles hépatiques, notamment ceux associés aux effets des alcaloïdes pyrrolizidiniques, également présents dans les extraits de consoude. Il est établi que l’ingestion chronique d’alcaloïdes pyrrolizidiniques par les bovins entraîne une fibrose périportale et une prolifération des canaux biliaires, phénomènes liés à la prolifération des cellules ovales. Dans la présente étude, la réduction du pourcentage de ces cellules renforce les éléments en faveur d’effets antimitotiques.
Cette convergence des résultats concorde avec les études antérieures dans lesquelles les effets antimitotiques des alcaloïdes pyrrolizidiniques prédominaient sur leurs effets carcinogènes au cours de procédures expérimentales à court terme.
Le résultat négatif du dénombrement des AgNOR pourrait être lié à la faible sensibilité de ce test.
Bien que les scores des réserves cellulaires en glycogène n’aient pas été modifiés, les hépatocytes vacuolisés étaient plus nombreux chez les rats traités, ce qui pourrait être associé à certains effets toxiques oxydatifs de la consoude. De fait, des lésions hépatocytaires dégénératives induites par cette plante ont déjà été décrites. L’étude de la consoude et d’autres plantes largement utilisées en médecine complémentaire mérite des recherches plus spécifiques, puisque les extraits végétaux présentent une grande diversité chimique et peuvent être capables de moduler simultanément plusieurs étapes du métabolisme. Actuellement, certaines études d’expression génique sont au centre de l’intérêt scientifique afin de mieux comprendre leurs mécanismes moléculaires.
Afin de formuler une hypothèse générale concernant le mécanisme d’action présumé de l’extrait de consoude dans ce modèle, un schéma récapitulatif est présenté dans la figure 2, montrant comment le processus mitotique pourrait être inhibé simultanément à plusieurs étapes.
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En conclusion, les présentes constatations peuvent contribuer à la compréhension d’une activité pharmacologique très particulière et peu étudiée de la consoude, puisque le traitement des rats par son extrait semble les protéger contre le développement précoce de lésions hépatiques prénéoplasiques, en inhibant la prolifération cellulaire et en modulant le phénotype atypique.
Étude in vivo à court terme menée chez des rats Wistar mâles adultes de 200 à 250 g, avec huit survivants dans le groupe témoin et neuf dans le groupe expérimental. Un extrait éthanolique à 10 % préparé à partir des feuilles de Symphytum officinale a été administré par gavage trois fois par semaine, à raison de 0,02 ml/kg⁻¹, dans un modèle de carcinogenèse hépatique induite par 300 mg/kg de DEN par voie intrapéritonéale, 20 mg/kg de 2AAF par gavage et une hépatectomie de 30 %. L’extrait a réduit les lésions prénéoplasiques macroscopiques mesurant jusqu’à 1 mm, les cellules ovales, les cellules positives au PCNA, les figures mitotiques et les nodules acidophiles, mais a accru la mégalocytose et la dégénérescence vacuolaire. La fibrose, les réserves de glycogène et les NOR n’étaient pas modifiées. Niveau de preuve : données expérimentales in vivo chez le rat uniquement ; cette étude à court terme montre à la fois une réduction de paramètres de prolifération et une augmentation de lésions cellulaires compatibles avec des effets toxiques, sans établir la sécurité ni l’efficacité chez l’être humain.
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