Référence : Journal of Pharmacopuncture 2017. — PMID 30087799 · DOI 10.3831/KPI.2017.20.026 Type : etude in vitro · Plante : Feijoa · Propriété → Antiparasitaire Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Objectifs : Les agents actuellement disponibles pour lutter contre la toxoplasmose présentent de sérieuses limitations. Ainsi, le but de la présente étude était d’examiner les activités anti-Toxoplasma gondii (T. gondii) des extraits méthanoliques de Feijoa sellowiana (F. sellowiana) (feuilles et fruits), Quercus castaneifolia (Q. castaneifolia) (fruits) et Allium paradoxum (A. paradoxum) (feuilles) in vitro et in vivo. Méthodes : Des cellules Vero ont été traitées avec différentes concentrations (de 0 à 400 μg/mL) des extraits ci-dessus ou avec de la pyriméthamine à une dose de 50 mg/mL (témoin positif). Ensuite, les viabilités des cellules infectées par T. gondii ont été mesurées à l’aide de tests colorimétriques MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium). De plus, les taux de survie de souris infectées de manière aiguë avec 2 × 10⁴ tachyzoïtes de la souche RH de T. gondii ont été examinés in vivo après injection intrapéritonéale des extraits à des doses de 100 et 200 mg/kg/jour pendant 5 jours. Résultats : Dans le test anti-T. gondii in vitro, les valeurs d’IC₅₀ étaient de 12,77, 180,2, 74,73, 213,2 et 163,8 μg/mL, et les indices de sélectivité étaient de 6,05, 1,31, 0,35, 0,69 et 1,30 pour les extraits de F. sellowiana (feuilles et fruits), Q. castaneifolia et A. paradoxum et la pyriméthamine, respectivement. De plus, les souris traitées avec F. sellowiana (feuilles et fruits) ont obtenu de meilleurs résultats en termes de survie que les autres (P < 0,05). Conclusion : Les résultats de la présente étude indiquent que l’extrait méthanolique de F. sellowiana possède une activité anti-Toxoplasma significative. Une étude plus approfondie devrait être menée pour examiner la bioactivité potentielle de cet extrait par fractionnement guidé par la bioactivité.
Toxoplasma gondii (T. gondii) est un parasite protozoaire intracellulaire ubiquitaire qui provoque la toxoplasmose chez l’humain et d’autres animaux à sang chaud. À l’échelle mondiale, on estime que plus d’un milliard de personnes sont infectées par Toxoplasma. La toxoplasmose aiguë chez les personnes immunocompétentes est généralement subclinique et asymptomatique, mais peut conduire à une infection chronique. Cependant, la toxoplasmose peut entraîner de graves problèmes de santé et une mortalité chez les individus immunodéprimés, tels que les personnes séropositives au virus de l’immunodéficience humaine (VIH), les patients atteints de cancer et les receveurs de greffe d’organe, ainsi que les nouveau-nés infectés de manière congénitale.
Les médicaments recommandés pour le traitement de la toxoplasmose sont la pyriméthamine et la sulfadiazine. De plus, l’azithromycine, la clarithromycine, la spiramycine, la dapsone, l’atovaquone et le cotrimoxazole ont été utilisés pour traiter la toxoplasmose clinique. Malheureusement, ces médicaments atovaquone sont mal tolérés et n’ont aucun effet sur la forme bradyzoïte. De plus, les médicaments recommandés ont des effets secondaires, tels que la neutropénie, des chutes sévères du nombre de plaquettes, la thrombocytopénie, la leucopénie, des anomalies et des réactions d’hypersensibilité. En outre, une résistance aux médicaments anti-T. gondii a été rapportée chez les patients atteints du syndrome d’immunodéficience acquise. En conséquence, de nouveaux médicaments à faible toxicité et tératogénicité, à pénétration et concentration efficaces à travers la barrière hémato-encéphalique et le placenta, à effet parasiticide contre les différents stades de T. gondii, en particulier la forme kystique, sont d’urgence nécessaires.
Ces dernières années, les études sur le potentiel thérapeutique des produits naturels ou à base de plantes se sont multipliées. Les plantes médicinales sont généralement considérées comme sûres et comme ayant une faible toxicité par rapport aux médicaments synthétiques. Selon notre revue de la littérature, les extraits d’Artemisia annua L., Glycyrrhiza glabra L., Eurycoma longifolia, Vernonia colorata, Ginkgo biloba, Allium cepa, Zingiber officinale, Myristica fragrans, Astragalus membranaceus, Scutellaria baicalensis, la myrrhe, Nigella sativa, Sambucus nigra, etc. ont été testés pour le traitement de la toxoplasmose.
Feijoa sellowiana (F. sellowiana) (Myrtacées) est un petit arbuste à feuillage persistant originaire des régions méridionales de l’Amérique du Sud, où il est largement distribué. Il est largement cultivé dans de nombreux pays, dont l’Iran. Quercus castaneifolia (Q. castaneifolia) est une plante originaire des forêts du nord, du nord-ouest et de l’ouest de l’Iran. Allium paradoxum (A. paradoxum), Alezi, est une espèce herbacée vivace cultivée dans la région septentrionale de l’Iran, en particulier au Mazandaran. À notre connaissance, nous avons évalué in vitro et in vivo pour la première fois les effets des extraits méthanoliques de F. sellowiana (feuilles et fruits), Q. castaneifolia (fruits) et A. paradoxum (feuilles) sur l’infection à T. gondii.
Cette étude a été réalisée conformément aux directives institutionnelles d’éthique animale du Animal Research Center, Mazandaran University of Medical Sciences (ARCMUMS). Les protocoles animaux utilisés dans cette recherche ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’Université des sciences médicales du Mazandaran (MUMSEC) (numéro de permis 492).
Le milieu RPMI-1640, le sérum de veau fœtal (FBS), la solution de pénicilline-streptomycine et la trypsine-EDTA (Sigma, USA) ont été utilisés pour les cultures cellulaires. Le diméthylsulfoxyde (DMSO, pureté 99 %) et le MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) ont été achetés auprès de Merck Chemical Company, Allemagne. Des souris Balb/c femelles consanguines âgées de six semaines pesant 18-20 g ont été utilisées dans cette étude. Les souris ont été hébergées dans des cages (n = 5) dans des conditions de laboratoire standard avec une température moyenne de 20-25 °C et ont reçu de l’eau de boisson et un régime murin ordinaire.
Trois types de plantes ont été utilisés dans cette étude : les feuilles et fruits de F. sellowiana, les fruits de Q. castaneifolia et les parties aériennes d’A. paradoxum ont été récoltés dans différentes régions du Mazandaran, Iran, à l’automne 2015 et ont été confirmés par le Dr B. Eslami, professeur assistant de systématique et écologie végétales (département de biologie, Université Islamique Azad de Qhaemshahr, Iran). Des spécimens de référence ont été déposés dans l’herbier de la Sari School of Pharmacy (Nos. 194, 195, 991 et A4411). Les parties ont été complètement séchées à l’ombre et ont été triturées dans un moulin mécanique. Les poudres ont été conservées dans des conteneurs protégés hermétiques avant utilisation.
Pour obtenir l’extrait méthanolique, nous avons ajouté 150 g de poudre sèche à 350 mL de méthanol pur et utilisé un agitateur magnétique pour mélanger la solution progressivement pendant 1 heure. Une fois la procédure d’extraction terminée, la solution a été laissée à température ambiante pendant la nuit. Elle a ensuite été agitée à nouveau et filtrée à travers du papier filtre Whatman No. 1, après quoi le solvant a été éliminé à 40 °C à l’aide d’un évaporateur rotatif. Le matériau semi-solide restant a été lyophilisé à −50 °C pendant 24 h. Le filtrat obtenu (14,5 g) a été placé dans un récipient en verre stérile et a été conservé à 4 °C pour une utilisation future. Afin de préparer la solution mère (la solution la plus concentrée), nous avons dissous 0,02 gramme des poudres d’extrait dans une quantité minimale de RPMI avec 10 % de FBS. Une filtration a été effectuée à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Ensuite, l’extrait a été dilué avec un milieu de culture complet jusqu’à un volume de 5 mL. Les autres concentrations (200, 100, 50, 20, 10 et 5 μg/mL) ont été obtenues par dilution de la solution mère. Le solvant était le milieu de culture complet. Tous les processus ont été réalisés dans des conditions stériles. Afin d’augmenter la précision au cours de ce processus, nous avons obtenu les concentrations dans des volumes plus importants que d’habitude.
La souche RH de T. gondii a été fournie par le Toxoplasmosis Research Center (TRC) de l’Université des sciences médicales du Mazandaran, Sari, Iran. Les tachyzoïtes de T. gondii ont été récoltés dans la cavité péritonéale de souris Balb/c 3-4 jours après une injection intrapéritonéale de 1 × 10⁵ parasites. Les tachyzoïtes ont été mis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS ; pH = 7,4) contenant 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Le nombre de tachyzoïtes a été déterminé en les comptant dans un hémacytomètre sous microscopie optique. Des cellules Vero (ATCC No. CCL-81) ont été utilisées pour les tests in vitro. Les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 avec l’ajout de 10 % de FBS inactivé, 100 unités/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Les cultures ont été maintenues dans des flacons de culture cellulaire jetables et incubées à 37 °C avec 5 % de CO₂.
L’analyse de cytotoxicité a été réalisée sur des cellules Vero. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité de 1 × 10⁵ cellules/mL en suspension dans du RPMI supplémenté avec 10 % de FBS. Après 24 h, les cellules ont été exposées aux extraits méthanoliques de feuilles de F. sellowiana, de fruits de F. sellowiana, de fruits de Q. castaneifolia, de feuilles d’A. paradoxum et à la pyriméthamine (témoin positif) à des concentrations finales de 5, 10, 20, 50, 100, 200 et 400 μg/mL ; le milieu de culture a été utilisé comme témoin négatif. Le lendemain, les viabilités des cellules Vero ont été évaluées à l’aide d’un test colorimétrique MTT. Ensuite, les concentrations cytotoxiques à 50 % (CC₅₀) ont été calculées à l’aide du logiciel Graph Pad Prism 6.0 (Graph Pad Software, Inc., San Diego, USA).
Des cellules Vero à des concentrations de 1 × 10⁵ cellules Vero/mL, en suspension dans du RPMI supplémenté avec 10 % de FBS, ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits. Après 8 h d’ensemencement, les cellules ont été infectées avec la souche RH de T. gondii (1 × 10⁶ tachyzoïtes/mL) et placées dans un incubateur à 37 °C maintenu à 5 % de CO₂ pendant 24 h. Après cela, les cellules ont été exposées aux extraits et à la pyriméthamine à des concentrations finales de 0 à 400 μg/mL ; le milieu de culture a été utilisé comme témoin négatif. Le lendemain, les viabilités des cellules Vero infectées par T. gondii ont été évaluées à l’aide de tests MTT. Ensuite, les concentrations inhibitrices à 50 % (IC₅₀) ont été calculées à l’aide du logiciel Graph Pad Prism 6.0. De plus, les indices de sélectivité (SI) des médicaments ont été calculés à l’aide de l’IC₅₀ et des profils de cytotoxicité sur les cellules hôtes (SI = CC₅₀/IC₅₀).
Initialement, pour le contrôle des effets secondaires des médicaments, une expérience préliminaire a été réalisée sur des souris Balb/c recevant les mêmes doses de médicaments, et la dose maximale à laquelle aucune mortalité ni toxicité cliniquement significative n’a été observée a été mesurée. Ensuite, 50 souris Balb/c femelles ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec 2 × 10⁴ tachyzoïtes de la souche RH de T. gondii et réparties en 10 groupes de 5 animaux chacun. Le même jour, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale des extraits et des témoins suivants, après quoi les injections ont été effectuées à intervalles réguliers de 24 h pendant 5 jours : extraits de feuilles et fruits de F. sellowiana, de fruits de Q. castaneifolia et de feuilles d’A. paradoxum à des doses de 100 et 200 mg/kg/jour, pyriméthamine à une dose de 50 mg/kg/jour (témoin positif) et PBS (témoin négatif). Les temps de survie ont été enregistrés quotidiennement jusqu’à ce que toutes les souris soient mortes.
Tous les tests de cette étude ont été réalisés en triple exemplaire. Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide des logiciels SPSS-14 et Graph Pad Prism 6.0. De plus, la courbe de Kaplan-Meier a été utilisée pour montrer les temps de survie, et les différences ont été comparées à l’aide du test du log-rank. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives lorsque P < 0,05.
Les traitements des cellules Vero avec différentes concentrations des extraits et de la pyriméthamine n’étaient pas toxiques par rapport au témoin négatif. [ ] Cependant, le traitement avec l’extrait de fruit de F. sellowiana et la pyriméthamine à une concentration de 400 μg/mL a réduit la viabilité des cellules Vero par rapport au témoin, tandis que les traitements à des concentrations de 5 à 200 μg/mL n’ont pas affecté la viabilité cellulaire. Il en a été de même pour les traitements avec les extraits de feuille de F. sellowiana et de Q. castaneifolia à des doses de 5 à 400 μg/mL. De plus, les cellules traitées avec l’extrait d’A. paradoxum à des concentrations de 200 et 400 μg/mL ont montré des viabilités cellulaires réduites par rapport au témoin, tandis que celles traitées à des concentrations de 5 à 100 μg/mL n’ont montré aucun effet sur la viabilité cellulaire.
Dans cette étude, les inhibitions de la croissance de T. gondii dans les cellules infectées ont été mesurées à différentes concentrations des extraits de F. sellowiana, Q. castaneifolia et A. paradoxum et de la pyriméthamine. Les feuilles de F. sellowiana ont montré une activité anti-T. gondii avec une IC₅₀ de 12,77 et un SI de 6,05. De plus, l’activité de la pyriméthamine a été caractérisée par une IC₅₀ de 163,8 et un SI de 1,33. [ ]
Cliniquement, le nombre de souris dans les groupes infectés non traités (témoin négatif) a commencé à diminuer au septième jour de l’étude, et toutes les souris étaient mortes à la fin du huitième jour. Les souris des autres groupes de traitement ont commencé à mourir au huitième jour, et toutes les souris étaient mortes à la fin du onzième jour. Le traitement avec les feuilles de F. sellowiana a obtenu de meilleurs résultats de survie chez les souris que les traitements avec les fruits de F. sellowiana, Q. castaneifolia et A. paradoxum. [ ] Les souris des groupes traités avec les fruits de F. sellowiana à une dose de 100 mg/kg/jour et avec les feuilles de F. sellowiana et A. paradoxum à des doses de 100 et 200 mg/kg ont montré des taux de survie statistiquement significativement plus élevés que les souris du groupe témoin infecté non traité (P < 0,05). Des différences statistiquement significatives ont été observées entre le groupe traité avec le fruit de F. sellowiana à une dose de 100 mg/kg/jour, les groupes traités avec les feuilles de F. sellowiana, Q. castaneifolia et A. paradoxum à une dose de 200 mg/kg/jour, et le témoin positif (P < 0,05).
La chimiothérapie standard anti-T. gondii est encore limitée car elle n’est pas bien tolérée par les patients immunodéprimés et ne peut pas éradiquer complètement les kystes tissulaires produits par le parasite. Ainsi, de nouveaux composés moins toxiques à utiliser contre Toxoplasma sont d’une nécessité critique. Les composés naturels et la médecine traditionnelle à base de plantes ont une haute disponibilité et des effets secondaires moindres par rapport aux médicaments chimiques actuels. Cette étude a donc été réalisée pour évaluer in vitro et in vivo les activités des extraits méthanoliques de F. sellowiana, Q. castaneifolia et A. paradoxum contre T. gondii. À notre connaissance, une telle étude n’a pas été rapportée précédemment dans la littérature.
Dans nos résultats in vitro, l’activité anti-T. gondii des agents a été calculée sous forme d’indice de sélectivité. L’indice de sélectivité a été indirectement appliqué à la viabilité cellulaire des cellules Vero pour représenter le ratio d’infection du parasite. Selon les résultats, les SI des différents composés ont été obtenus dans l’ordre suivant : feuilles de F. sellowiana > fruits de F. sellowiana > pyriméthamine > feuilles d’A. paradoxum > fruits de Q. castaneifolia. Ainsi, F. sellowiana, en particulier les feuilles de F. sellowiana, a montré une activité anti-T. gondii contre les cellules Vero infectées par T. gondii supérieure à celle du traitement standard.
F. sellowiana a des effets multi-pharmacologiques, notamment des activités antimicrobienne, antifongique, antioxydante, antidépressive et anticancéreuse, ce qui a été confirmé par plusieurs chercheurs. Les feuilles et les fruits de F. sellowiana contiennent de nombreux composants de base, tels que des flavonoïdes, des tanins, des terpènes et des saponines stéroïdiennes. De même, Zhang et al ont montré que les activités et les SI de l’oxymatrine et de la matrine, les principaux alcaloïdes des plantes légumineuses du genre Sophora, étaient plus élevés que ceux de la spiramycine contre la souche RH de cellules HeLa infectées par T. gondii.
Dans notre étude, les effets de F. sellowiana, Q. castaneifolia et A. paradoxum ont été analysés dans des infections aiguës par la souche RH de T. gondii chez des souris Balb/c in vivo. Étant donné qu’une concentration de 400 μg/mL s’est révélée toxique dans les études in vitro sur certains extraits, nous avons sélectionné des concentrations de 100 et 200 mg/kg/jour pour notre étude in vivo. Le traitement de souris expérimentales avec F. sellowiana et la pyriméthamine pendant 5 jours après l’infection avec 2 × 10⁴ tachyzoïtes de la souche RH de T. gondii a statistiquement augmenté leurs taux de survie par rapport aux souris du témoin infecté non traité. Bien que les souris traitées avec l’extrait méthanolique de feuilles de F. sellowiana (200 mg/kg/jour) aient présenté une meilleure survie que les souris traitées avec les autres extraits méthanoliques, les différences de survie entre ces souris et les souris des groupes témoins positif ou négatif n’étaient pas statistiquement significatives, indiquant que l’activité de F. sellowiana est probablement due à ses fortes propriétés antioxydantes et à sa teneur élevée en composés phénoliques et flavonoïdes. Keles et al ont démontré que les extraits de F. sellowiana affichaient une activité antioxydante remarquable et diminuaient la peroxydation lipidique chez le rat.
De plus, Q. castaneifolia a augmenté le taux de survie des souris par rapport à celui des souris du témoin infecté non traité, et les différences par rapport aux feuilles de F. sellowiana (200 mg/kg/jour) et à la pyriméthamine étaient statistiquement significatives. L’extrait de fruit de Q. castaneifolia contient de nombreux composants de base et a des effets antimicrobiens sur E. coli, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae et Yersinia enterocolitica. De plus, une différence significative existait entre A. paradoxum et le groupe non traité (témoin négatif) et le groupe traité avec les fruits de F. sellowiana (200 mg/kg/jour). Fait intéressant, Raeisi et Rahimi Esboei ont montré qu’A. paradoxum n’était pas significativement efficace lors du traitement du kyste hydatique à des concentrations de 1, 10, 50 et 100 mg/mL.
Il a été rapporté qu’A. paradoxum est une plante native iranienne qui présente des effets antimicrobien, antifongique et antiviral. De plus, il a été rapporté que les extraits aériens d’A. paradoxum présentent une activité antioxydante. Le β-pinène, le limonène, le Z-nérolidol, le spathulénol, l’alpha-bisabolol, le phytol, le n-docosane et le n-tricosane sont les composants chimiques les plus importants rapportés d’A. paradoxum. Dans une étude in vivo, Hezarjaribi et al ont constaté qu’un extrait éthanolique d’A. paradoxum à une concentration de 100 mg/mL était plus efficace pour traiter les kystes de Giardia que l’extrait chloroformique. De plus, Elmi a montré que l’extrait éthanolique d’A. paradoxum était significativement plus efficace que l’extrait chloroformique dans le traitement de souris infectées par des parasites Giardia. Notre présente étude a montré que l’extrait méthanolique d’A. paradoxum ne présentait aucune activité anti-Toxoplasma significative in vitro et in vivo. Sur la base de ces résultats, nous émettons l’hypothèse que les extraits éthanolique, liquide et chloroformique d’A. paradoxum pourraient être plus actifs contre l’infection à toxoplasme que l’extrait méthanolique.
En conclusion, il s’agit du premier rapport sur les activités anti-Toxoplasma des extraits méthanoliques de F. sellowiana, Q. castaneifolia et A. paradoxum. Étant donné que l’extrait de Q. castaneifolia à la concentration utilisée dans cette étude n’avait aucune toxicité dans l’étude in vitro, des concentrations plus élevées devraient être utilisées dans les études futures pour évaluer son potentiel thérapeutique in vitro et in vivo. Les résultats de la présente étude indiquent que F. sellowiana promeut une activité significative contre T. gondii. Une étude plus approfondie devrait être conçue pour examiner la bioactivité potentielle de cet extrait par fractionnement guidé par la bioactivité et pour identifier les mécanismes supplémentaires impliqués dans ses effets.