Référence : BMC Complement Med Ther 2021. — PMC8611982 · DOI 10.1186/s12906-021-03461-5 Type : étude in vitro · Plante : Lavande vraie · Propriété → Anti-inflammatoire Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Pseudomonas aeruginosa est la bactérie à Gram négatif la plus fréquemment associée aux infections respiratoires nosocomiales. L’huile essentielle de lavande est principalement utilisée en aromathérapie, mais elle possède plusieurs propriétés pharmacologiques et thérapeutiques. Elle possède en outre des activités antifongiques et antibactériennes. L’activité anti-inflammatoire des huiles essentielles peut dépendre de la composition et du rapport entre leurs composés. La constitution des huiles essentielles extraites aux différents stades de la période de floraison varie, ce qui rend plausible l’influence du moment de récolte des fleurs sur les effets anti-inflammatoires. Différents types d’huiles essentielles réduisent l’inflammation en agissant de manière similaire, par modulation de l’activité et de l’action de la voie de signalisation NFκB, qui est le principal régulateur de la transcription des cytokines pro-inflammatoires.
Les huiles essentielles de lavande ont été distillées à partir de lavande cultivée en Hongrie, dont les fleurs ont été récoltées au début et à la fin de la période de floraison. Les expériences ont été menées sur la lignée cellulaire humaine de monocytes/macrophages THP-1, utilisée comme modèle de culture cellulaire in vitro pour suivre les effets des huiles essentielles de lavande et de leur principal composé, le linalol, sur l’inflammation stimulée par le LPS de P. aeruginosa. Les taux d’ARNm et de protéines de quatre cytokines pro-inflammatoires, IL-6, IL-1β, IL-8 et TNFα, ont été déterminés par PCR en temps réel et par dosages ELISA. Les effets des huiles essentielles ont été comparés à la réponse à deux inhibiteurs de NFκB, la lutéoline et l’ACHP.
Le linalol et l’huile essentielle de lavande extraite de plantes au début de la période de floraison ont permis de diminuer la production de cytokines pro-inflammatoires après un prétraitement par le LPS. Dans le cas d’IL-8 et d’IL-1β, l’huile de lavande a présenté un effet plus puissant que le linalol, et tous deux ont agi de manière similaire aux inhibiteurs de NFκB. Les prétraitements par le linalol et par l’huile essentielle de lavande du début de la période de floraison ont empêché la production de cytokines pro-inflammatoires par rapport au traitement par le LPS seul. Bien que l’huile essentielle de lavande de la fin de la période de floraison ait diminué l’expression des ARNm d’IL-6, d’IL-1β et d’IL-8 après un prétraitement par le LPS, elle n’a pas été capable de réduire la sécrétion des cytokines.
D’après nos résultats, il a été démontré que l’huile essentielle de lavande extraite au début de la période de floraison est un puissant inhibiteur de la synthèse de quatre cytokines pro-inflammatoires, IL-6, IL-8, IL-β et TNFα, par les cellules THP-1. Cela confirme la pertinence de la récolte des fleurs de lavande au début de la floraison pour la production d’huile essentielle et son utilisation comme traitement anti-inflammatoire.
La version en ligne contient du matériel supplémentaire disponible à l’adresse 10.1186/s12906-021-03461-5.
Pseudomonas aeruginosa est la bactérie à Gram négatif la plus fréquemment associée aux infections respiratoires nosocomiales et elle est souvent associée à la mucoviscidose et aux maladies inflammatoires chroniques des voies respiratoires. Les souches de P. aeruginosa possèdent une résistance intrinsèque et acquise aux antibiotiques en raison de leur capacité à former des biofilms et des cellules tolérantes à de multiples médicaments. Bien que les antibiotiques nébulisés semblent efficaces au stade précoce de l’infection par P. aeruginosa, d’autres stratégies thérapeutiques sont fortement nécessaires.
Les monocytes font partie du système immunitaire inné. Après leur activation, ils peuvent se différencier vers le type M1, doté d’un phénotype pro-inflammatoire et d’une activité phagocytaire, ou vers le type M2, qui favorise la prolifération cellulaire et la réparation tissulaire. Le lipopolysaccharide (LPS) présent dans la paroi cellulaire de diverses souches bactériennes active la polarisation M1 des monocytes, qui commencent à libérer des cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine-6 (IL-6), l’interleukine-1β (IL-1β), l’interleukine-8 (IL-8) et le facteur de nécrose tumorale α (TNFα), ainsi que des prostaglandines. Le LPS se lie au récepteur Toll-like 4 (TLR4) et active des voies de signalisation dépendantes et indépendantes de MyoD88. La première active le facteur de transcription nuclear factor kappa B (NFκB) et la signalisation mitogen-activated protein kinase/activator protein-1 (MAPK/AP-1), tandis que la seconde régule le facteur régulateur de l’interféron 3 (IRF3), mais toutes deux déclenchent la transcription de cytokines pro-inflammatoires.
Selon la littérature, les huiles essentielles telles que celles de thym, de camomille et d’eucalyptus réduisent l’inflammation en modulant l’activité et l’action de la voie de signalisation NFκB, qui est le principal régulateur de la transcription des cytokines pro-inflammatoires.
Plusieurs huiles essentielles, par exemple celles d’arbre à thé, d’eucalyptus et de lavande, possèdent une activité immunomodulatrice capable de modifier les processus inflammatoires, ce qui en fait des traitements alternatifs potentiels de nombreuses maladies infectieuses ou immunitaires. L’immunosuppression produite par les huiles essentielles peut contribuer à leurs activités antitumorales. L’inhalation de certaines huiles essentielles peut atténuer l’inflammation des voies respiratoires.
Les huiles essentielles sont généralement extraites pendant la période de pleine floraison de nombreuses plantes, car ces fleurs fournissent habituellement le rendement en huile essentielle le plus élevé et parce qu’il est supposé que ces huiles essentielles comprennent le mélange le plus efficace des différents composés. À l’inverse, certaines années, en raison d’anomalies météorologiques ou du réchauffement climatique, il serait avantageux de récolter les fleurs au début ainsi qu’à la fin de la période de floraison dans certaines zones de culture. La production d’huile essentielle à ces moments de la période de floraison serait également avantageuse sur le plan économique si ces huiles essentielles présentaient, dans leurs domaines d’utilisation, des activités meilleures ou similaires à celles produites pendant la période de pleine floraison. Selon la monographie de l’ESCOP et l’Agence européenne des médicaments (EMA), l’huile essentielle de lavande (LEO) est obtenue par distillation à la vapeur des fleurs fraîches de Lavandula angustifolia Mill. Les indications thérapeutiques de l’huile de lavande comprennent le soulagement des symptômes légers de stress mental et d’épuisement ainsi que le traitement de l’insomnie. Par conséquent, la LEO et ses produits figurent aujourd’hui parmi les huiles les plus populaires dans le monde. Le linalol est le principal composé naturel de l’huile de lavande. Des études récentes ont décrit ses effets antibactérien et anticancéreux. Toutefois, les données relatives au mécanisme de l’activité anti-inflammatoire du linalol et de l’huile de lavande sur des lignées cellulaires humaines, par exemple THP-1, sont limitées.
Les expériences ont été menées sur la lignée cellulaire humaine de monocytes/macrophages THP-1, largement utilisée comme modèle de culture cellulaire in vitro pour suivre les effets d’extraits végétaux sur l’inflammation stimulée par le LPS.
Notre étude a révélé que les huiles essentielles distillées à partir de fleurs de lavande récoltées au début et à la fin de la période de floraison pouvaient influencer la production de cytokines pro-inflammatoires par les cellules THP-1 activées par le LPS de P. aeruginosa. Les huiles essentielles utilisées dans les expériences ont été distillées à partir de lavande fraîche cultivée en Hongrie, dans le village de Bolho, comitat de Somogy, et les fleurs ont été récoltées au début et à la fin de la période de floraison. En Hongrie, la lavande a été la plante médicinale de l’année 2018. Toutefois, jusqu’à aujourd’hui, personne n’avait évalué scientifiquement la lavande poussant sur ce terrain de culture.
Afin de démontrer l’efficacité du linalol, principal composé de la LEO, et des LEO préparées au début et à la fin de la période de floraison, ainsi que de déterminer si ces huiles peuvent atténuer l’expression des cytokines pro-inflammatoires par l’intermédiaire de la voie NFκB dans les cellules THP-1, deux inhibiteurs spécifiques de NFκB, la lutéoline et l’ACHP, ont été utilisés. Ces inhibiteurs bloquent la voie NFκB en différents points.
D’après nos résultats, il semble que les différences de composition entre l’huile de lavande extraite au début et celle extraite à la fin de la période de floraison puissent contribuer à leurs effets distincts sur la régulation de l’expression génique et sur la sécrétion des quatre cytokines pro-inflammatoires étudiées dans les cellules THP-1 stimulées par le LPS de P. aeruginosa. Il a été démontré que la LEO distillée à partir de fleurs récoltées au début de la période de floraison est un puissant inhibiteur de la synthèse d’IL-6, d’IL-8, d’IL-β et de TNFα par les cellules THP-1, ce qui en fait une bonne candidate comme traitement anti-inflammatoire alternatif.
Lavandula angustifolia Mill. a été récoltée au cours de deux phénophases de la plante : au début de la période de floraison, le 20 juin 2019, et à la fin de la période de floraison, le 18 juillet 2019. Le lieu de récolte des plantes était le village de Bolho, comitat de Somogy, Hongrie, coordonnées : 46,03904° N, 17,30376° E. En 2019, la LEO a été obtenue à partir de matière végétale fraîche, non séchée, par hydrodistillation conformément à la 8e édition de la Pharmacopée hongroise de 2003. La procédure a duré 3 h. La teneur en LEO a été mesurée par la méthode volumétrique. Trois procédures de distillation ont été réalisées en parallèle. Respectivement, 1 810 μL de LEO ont été obtenus à partir de la matière végétale fraîche récoltée au début de la période de floraison et 1 100 μL à partir de celle récoltée à la fin de cette période. La composition chimique des échantillons de LEO a été déterminée par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse à simple quadripôle (GC-MS) et à un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID).
Les échantillons de LEO, 10 μL, ont été solubilisés dans 990 μL de méthanol (Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Hongrie), dilution 1:100, puis injectés dans les systèmes GC-MS et GC-FID. Un mélange étalon d’alcanes saturés C7-C30 à 1 000 μg/mL dans l’hexane (Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Hongrie) a été utilisé pour calculer l’indice de rétention linéaire (LRI).
La séparation et l’identification des échantillons de LEO ont été réalisées à l’aide d’un appareil GCMS-QP2020 (Shimadzu, Duisbourg, Allemagne) équipé d’un injecteur split-splitless à 280 °C et d’un passeur automatique AOC-20i. La colonne capillaire était une colonne de faible polarité SLB-5 ms de 30 m × 0,25 mm de diamètre intérieur et 0,25 μm d’épaisseur de film (Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Hongrie). Le programme de température était le suivant : de 50 °C à 300 °C à raison de 3,0 °C/min. Le volume d’injection était de 0,5 μL, avec un rapport de division de 1:10. L’hélium a été utilisé comme gaz vecteur, à une pression d’entrée initiale de 26,7 kPa et à une vitesse linéaire moyenne de 30 cm/s. Les paramètres de MS étaient les suivants : plage de masse de 40 à 550 uma, température de la source d’ions de 220 °C et température de l’interface de 250 °C. Le logiciel GCMSsolution, version 4.50 de Shimadzu, a été utilisé pour la collecte et le traitement des données. L’attribution des pics a été effectuée au moyen d’un double filtre : similarité spectrale supérieure à 85 % et fenêtre de tolérance du LRI de ± 5. La bibliothèque de spectres de masse FFNSC, version 3.01, Shimadzu, Europe, Duisbourg, Allemagne, a principalement été utilisée pour l’identification des composés.
La quantification des analytes a été effectuée à l’aide d’un appareil GC-2010 (Shimadzu, Europe, Duisbourg, Allemagne) équipé d’un injecteur split-splitless, d’un passeur automatique AOC-20i/s et d’un détecteur FID à 280 °C. La colonne de GC, le programme de température et le gaz vecteur étaient identiques à ceux décrits pour le système GC-MS, à l’exception de la pression d’entrée initiale, qui était de 99,5 kPa ; la vitesse linéaire moyenne était de 30 cm/s. La température du FID a été réglée à 300 °C, avec une fréquence d’échantillonnage de 40 ms, tandis que les débits gazeux étaient de 40 mL/min pour H₂, de 30 mL/min pour le gaz d’appoint N₂ et de 400 mL/min pour l’air. Les données ont été recueillies et traitées avec le logiciel LabSolution, version 5.92 de Shimadzu. Chaque échantillon a été analysé au cours de trois passages consécutifs afin d’obtenir une plus grande précision des données.
Les solutions mères de l’étalon de linalol (Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Hongrie) et des LEO ont été préparées en ajoutant 10 % de diméthylsulfoxyde à 100 % (DMSO, Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Hongrie) à 90 % d’huiles essentielles, ce qui signifie que 100 μL de DMSO ont été ajoutés à 900 μL d’huile essentielle pour un volume final de 1 mL. Les émulsions ont été mélangées au vortex, puis diluées 500, 1 000, 2 000 et 3 000 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, Lonza Ltd., Bâle, Suisse). Les solutions mères et les dilutions ont été préparées extemporanément lors de chaque expérience. Pour les expériences témoins, une solution mère contenant 10 % de DMSO a été préparée dans du PBS et diluée de la même manière que les huiles essentielles. Selon les dilutions, la concentration finale de DMSO utilisée dans les expériences était égale ou inférieure à 0,01 %.
La lignée cellulaire humaine de monocytes/macrophages THP-1 a été achetée auprès de l’European Collection of Authenticated Cell Cultures (Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Hongrie). Les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; EuroClone S.p.A., Pero, Italie) et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S ; Lonza Ltd., Bâle, Suisse), dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂ à 37 °C. Les cellules THP-1 ont été placées dans des plaques à 6 puits et cultivées pendant 24 h avant les traitements. L’inflammation a été produite au moyen de traitements par 100 ng/mL de LPS de Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa 10 purifié par extraction au phénol ; Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Hongrie). La concentration du LPS de P. aeruginosa et la durée des expériences ont été déterminées par des expériences de dépendance à la concentration et au temps [ ]. Les concentrations des inhibiteurs de NFκB, la lutéoline (Tocris Bioscience, Bio-Techne R&D Systems Kft., Budapest, Hongrie) et l’ACHP (2-amino-6-[2-(cyclopropylméthoxy)-6-hydroxyphényl]-4-(4-pipéridinyl)-3-pyridinecarbonitrile ; Tocris Bioscience, Bio-Techne R&D Systems Kft., Budapest, Hongrie), utilisés comme témoins de l’inhibition de la production de cytokines, ont été déterminées par des expériences de dépendance à la concentration [ ]. Les cellules ont été traitées par l’étalon de linalol et les LEO dilués 500 fois afin de déterminer leurs effets sur la production de cytokines pro-inflammatoires. L’effet de l’étalon de linalol et des LEO sur l’expression des cytokines pro-inflammatoires a d’abord été déterminé sur les cellules THP-1 sans prétraitement par le LPS. Les effets anti-inflammatoires des huiles essentielles ont été déterminés dans deux expériences différentes : prétraitement par le LPS pendant 24 h, puis traitement par l’huile essentielle pendant 24 h ; prétraitement par l’huile essentielle pendant 24 h, puis traitement par le LPS pendant 24 h. Les cellules traitées par le DMSO ont servi de témoins. La concentration finale de DMSO dans les expériences était de 0,01 %, conformément à la dilution. Chaque expérience a été répétée trois fois.
La viabilité des cellules THP-1 a été mesurée après les traitements à l’aide du test de viabilité cellulaire Cell Counting Kit-8 (CCK-8 ; Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Hongrie). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à raison de 5 × 10³ cellules/puits. Elles ont été traitées soit par le linalol, soit par les LEO à des dilutions de 500, 1 000, 2 000 ou 3 000 fois pendant 6 h et 24 h. Les dilutions ont été préparées extemporanément à partir des solutions mères décrites précédemment dans la section Méthodes. Les cellules traitées par le DMSO ont servi de témoins des cellules traitées par les huiles essentielles. Selon les dilutions, les concentrations finales de DMSO utilisées dans les expériences étaient égales ou inférieures à 0,01 %. Pour le test, conformément au protocole, 10 μL de réactif WST-8 ont été ajoutés à chaque puits contenant les cellules traitées, puis les plaques ont été incubées pendant 1 h à 37 °C sous 5 % de CO₂. Après incubation, la réaction a été arrêtée au moyen de 10 μL de dodécylsulfate de sodium à 1 % (SDS, Molar Chemicals Kft., Halásztelek, Hongrie). L’absorbance des échantillons a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un spectrophotomètre pour microplaques MultiSkan GO (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts). La viabilité des cellules traitées a été exprimée en pourcentage du nombre total de cellules du témoin DMSO correspondant.
Les cellules THP-1 ont été traitées par du linalol ou des LEO dilués 500 fois dans des boîtes de culture à 6 puits, à raison de 4 × 10⁵ cellules/puits, comme décrit précédemment. Après les traitements, les cellules THP-1 ont été recueillies par centrifugation et les surnageants ont été transférés dans de nouveaux tubes pour les dosages ELISA. Les culots cellulaires ont été lavés deux fois avec du PBS, puis l’ARN total de chaque échantillon a été isolé au moyen du kit Quick RNA Mini (Zymo Research, Irvine, Californie). L’ADNc a été synthétisé à partir de 200 ng d’ARN total avec le kit High Capacity cDNA Reverse Transcription dans un volume réactionnel total de 20 μL (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts), conformément au protocole du fabricant. La détermination de l’expression génique a été effectuée dans un système CFX96 Real-time (Bio-Rad Inc., Hercules, Californie) avec l’iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad Inc., Hercules, Californie). Chaque réaction contenait 2 μL, soit 20 ng, d’ADNc, 10 μL de mélange maître 2X, 10 μM d’amorces sens et antisens et 7,2 μL d’eau ultrapure. Afin de démontrer la spécificité des réactions de PCR, des courbes de fusion ont été générées après chaque passage. La quantification relative a été calculée par la méthode de Livak, 2^-∆∆Ct, avec le logiciel Bio-Rad CFX Maestro 1.1 (Bio-Rad Inc., Hercules, Californie), le taux d’ARNm du gène constitutif de la β-actine étant utilisé pour la normalisation. L’expression relative des témoins, cellules traitées par le DMSO, a été considérée comme égale à 1. L’expression des ARNm des cellules traitées a été comparée à celle des témoins et exprimée sous forme de variation en multiples. Les séquences des amorces utilisées dans cette étude sont décrites dans le tableau [ ].
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Après chaque traitement, les cellules ont été culottées et leurs surnageants placés dans de nouveaux tubes. Les échantillons de milieu de culture ont été conservés à −80 °C jusqu’aux dosages ELISA. Les concentrations d’IL-6, d’IL-1β, d’IL-8 et de TNFα ont été déterminées en triple dans chaque expérience indépendante, à l’aide de kits ELISA spécifiques de l’IL-6, de l’IL-1β, de l’IL-8 et du TNFα humains (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts), conformément aux instructions du fabricant.
Les tests de viabilité cellulaire, les analyses par PCR en temps réel et les dosages ELISA ont été réalisés en triple dans chaque expérience indépendante. Dans chaque figure, n correspond au nombre d’expériences indépendantes. L’analyse statistique a été effectuée avec le logiciel SPSS (IBM Corporation, Armonk, New York, États-Unis). La signification statistique a été déterminée au moyen du test ANOVA non paramétrique unidirectionnel de Kruskal-Wallis, avec des comparaisons par paires. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (ET). Le seuil de signification statistique a été fixé à p < 0,05.
Afin d’étudier les effets anti-inflammatoires de l’étalon de linalol et des LEO sur les cellules THP-1 exposées au LPS, les effets cytotoxiques des huiles essentielles ont été déterminés. La cytotoxicité a été définie par la mesure de la viabilité des cellules après des traitements de 6 h et de 24 h avec des dilutions en série des solutions mères préparées à partir du linalol et des LEO [ ]. Le DMSO ayant été utilisé pour l’émulsification, les cellules traitées par le DMSO ont servi de témoins. Après 6 h de traitement, aucune diminution significative de la viabilité cellulaire n’a été mesurée [ ]. Les traitements plus longs n’ont affecté la viabilité cellulaire qu’aux dilutions les plus élevées, par comparaison avec le même degré de dilution du DMSO, ce qui pourrait être dû à l’effet activateur du DMSO sur la prolifération [ ]. D’après ces résultats, le degré de dilution le plus faible, 500 fois, du linalol et des LEO, qui n’affectait pas significativement la viabilité cellulaire, a été choisi pour les expériences ultérieures. La viabilité cellulaire peut dépendre de la composition des huiles essentielles et de la concentration des composés [ ].
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Pourcentage (%) et concentrations relatives (ng/mL) des composés des LEO préparées au début et à la fin de la période de floraison.
a LRI exp : indice de rétention linéaire expérimental sur une colonne SLB-5MS.
Les composés volatils sont exprimés en pourcentages, correspondant à la moyenne de trois injections répétées.
b Les concentrations relatives ont été choisies en se fondant sur le calcul selon lequel les cellules auraient été traitées avec 200 μL d’huile essentielle.
* indique une coélution sur la colonne SLB-5 ms.
Les effets du linalol et des LEO ont d’abord été déterminés sur les taux d’ARNm des cytokines pro-inflammatoires IL-6, IL-8, IL-1β et TNFα dans les cellules THP-1. Le linalol n’a pas modifié significativement l’expression des ARNm des cytokines, à l’exception de celle d’IL-6, qui a augmenté après un traitement de 24 h [ ]. La LEO préparée au début de la période de floraison a significativement augmenté l’expression des ARNm d’IL-8 et de TNFα [ ], tandis que la LEO préparée à la fin de la période de floraison a augmenté l’expression des ARNm de toutes les cytokines pro-inflammatoires étudiées, à l’exception d’IL-1β [ ]. Ces résultats suggèrent que la composition des LEO peut influencer la transcription des différentes cytokines pro-inflammatoires.
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Les taux de cytokines sécrétées ont également été mesurés afin de déterminer si les différentes huiles exerçaient des actions différentes sur la synthèse protéique des cytokines pro-inflammatoires. D’une manière générale, les quantités de protéines sécrétées ont suivi les niveaux d’expression des ARNm des cytokines. Le taux d’IL-6 était élevé après le traitement par le linalol et par la LEO de la fin de la période de floraison [ ], tandis que les deux huiles essentielles et le linalol diminuaient les taux d’IL-8 [ ]. Les huiles essentielles étudiées n’ont modifié ni la sécrétion d’IL-1β ni la production de TNFα [ ]. Ces résultats montrent que la LEO distillée au début de la floraison convient au traitement des cellules THP-1, puisqu’elle n’a pas augmenté l’expression ni la production des cytokines pro-inflammatoires étudiées, ce qui suggère qu’elle n’a pas agi comme un activateur des monocytes. Elle a en outre été capable de diminuer la synthèse d’IL-8 par les cellules.
Nous avons ensuite étudié les effets atténuateurs du linalol et des LEO sur la production de cytokines pro-inflammatoires après activation des cellules THP-1 pendant 24 h par le LPS de P. aeruginosa. Afin d’évaluer l’efficacité des huiles essentielles, la lutéoline et l’ACHP, deux inhibiteurs de NFκB dotés de mécanismes d’action différents, ont été utilisés comme témoins positifs de la régulation négative de l’expression des cytokines.
Les deux huiles essentielles étudiées ont permis de diminuer le taux d’ARNm d’IL-6 par rapport au traitement par le LPS [ ]. Elles ont en outre produit un meilleur effet que la lutéoline et ont été presque aussi efficaces que l’ACHP, ce qui suggère qu’elles agissent sur la voie NFκB d’une manière similaire à l’ACHP. Au niveau protéique, le linalol et la LEO du début de la floraison se sont révélés plus favorables pour diminuer la sécrétion d’IL-6 que les traitements des cellules THP-1 par la lutéoline et par l’ACHP [ ]. Cette huile essentielle et le linalol ont également été capables de réduire le taux protéique d’IL-6 en dessous du taux témoin [ ].
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Dans le cas de la chimiokine IL-8, les deux huiles essentielles étudiées ont réussi à réguler négativement le taux d’ARNm, tandis que les inhibiteurs de NFκB n’ont pas significativement modifié le taux d’ARNm d’IL-8 par rapport au traitement par le LPS [ ]. Ces résultats laissent supposer que le linalol et les LEO peuvent agir selon un autre mode et/ou pas uniquement par l’intermédiaire de la voie NFκB. Fait intéressant, au niveau protéique, seule la LEO du début de la période de floraison a diminué la sécrétion d’IL-8, mais celle-ci demeurait significativement plus élevée que chez le témoin [ ].
Une fois encore, parmi les trois huiles essentielles et par comparaison avec les traitements par la lutéoline et l’ACHP, la LEO du début de la période de floraison a été capable de diminuer le plus fortement le taux d’ARNm d’IL-1β [ ]. Toutefois, le linalol et la LEO de la fin de la période de floraison ont également réduit significativement le taux d’ARNm d’IL-1β par rapport au traitement par le LPS [ ]. Concernant la sécrétion protéique d’IL-1β, une diminution significative a été observée avec la LEO du début de la période de floraison ainsi que dans les cellules THP-1 traitées par la lutéoline et l’ACHP, mais pas avec les deux autres huiles essentielles étudiées [ ]. Cette divergence entre les taux d’ARNm et de protéines pourrait être due au processus de maturation post-traductionnelle d’IL-1β.
Enfin, l’étude de la synthèse de l’ARNm du TNFα a révélé que seul le linalol pouvait inhiber son expression, cet effet étant similaire à celui des inhibiteurs de NFκB [ ]. De manière surprenante, au niveau protéique, non seulement le linalol, mais aussi la LEO du début de la période de floraison ont été efficaces pour réduire la sécrétion de TNFα, de même que les traitements par la lutéoline et l’ACHP [ ].
L’effet protecteur du linalol et des LEO sur l’inflammation a également été étudié. Des prétraitements de 24 h par les huiles essentielles ont été suivis d’un traitement de 24 h par le LPS. L’efficacité des huiles essentielles et du linalol a été comparée à celle des traitements par la lutéoline et l’ACHP.
Dans le cas d’IL-6, le prétraitement par le linalol a été le plus efficace pour diminuer l’expression de l’ARNm, mais il a également été montré que les deux LEO étaient capables de diminuer significativement le taux d’ARNm d’IL-6 par comparaison avec le traitement par le LPS ainsi qu’avec les inhibiteurs de NFκB [ ]. Au niveau protéique, le linalol et la LEO du début de la période de floraison ont réussi à réduire la sécrétion de la cytokine IL-6, ces taux étant très similaires au taux témoin, ce qui suggère que ces huiles essentielles sont de puissants inhibiteurs de la production d’IL-6 [ ].
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La LEO du début de la période de floraison a présenté l’activité la plus élevée parmi les trois huiles essentielles étudiées pour atténuer l’expression de l’ARNm d’IL-8, bien que l’inhibiteur de NFκB ACHP ait été plus efficace que les huiles essentielles pour réduire le taux d’ARNm d’IL-8 [ ]. Les mêmes résultats ont été obtenus au niveau protéique [ ].
Les taux d’ARNm et de protéines d’IL-1β se sont révélés modifiés de manière similaire à ceux d’IL-8. Le linalol et la LEO du début de la période de floraison ont été capables de réduire l’expression de l’ARNm d’IL-1β par rapport au traitement par le LPS, mais ni la LEO de la fin de la période de floraison ni la lutéoline n’ont permis de la diminuer [ ]. Au niveau protéique, la LEO du début de la période de floraison a efficacement inhibé la sécrétion de la cytokine IL-1β, mais ce taux protéique demeurait significativement plus élevé que la sécrétion des cellules THP-1 traitées par l’ACHP [ ].
Dans le cas de l’expression de la cytokine TNFα, le linalol et la LEO du début de la période de floraison ont été capables d’inhiber la synthèse de l’ARNm, mais cette dernière a été plus efficace [ ]. Toutefois, l’inhibiteur de NFκB ACHP a mieux réussi à réduire le taux d’ARNm du TNFα que la LEO du début de la période de floraison [ ]. Au niveau protéique, nous avons obtenu des résultats opposés : le linalol a davantage diminué la sécrétion de TNFα que la LEO du début de la période de floraison, mais le traitement par l’ACHP demeurait le plus efficace, avec un taux de TNFα très similaire à celui des cellules témoins [ ].
Il est intéressant d’observer que la LEO de la fin de la période de floraison a entraîné des sécrétions d’IL-6, d’IL-8 et d’IL-1β aussi élevées que celles des cellules THP-1 traitées par le LPS. En outre, le prétraitement des cellules THP-1 par la LEO de la fin de la période de floraison a entraîné un taux de sécrétion de TNFα deux fois plus élevé que celui des cellules traitées par le LPS [ ].
L’huile essentielle de lavande (LEO) est principalement utilisée en aromathérapie, mais elle possède plusieurs propriétés pharmacologiques et thérapeutiques. La LEO exerce un effet remarquable sur l’anxiété et peut être utilisée à des fins de relaxation par inhalation de ses vapeurs. Elle pourrait être efficace dans le traitement de plusieurs troubles neurologiques puisqu’elle possède des propriétés neuroprotectrices. Elle possède également une activité anesthésique ainsi que des activités antifongiques et antibactériennes. L’effet anti-inflammatoire de la LEO a été évalué dans des modèles d’inflammation aiguë de pleurésie et d’œdème de l’oreille. Dans les tissus de l’oreille de souris, elle a diminué les niveaux d’expression de NFκB, de la cyclo-oxygénase 2 et du TNFα.
Il a été décrit que la LEO peut augmenter l’activité phagocytaire et modifier la prolifération bactérienne intracellulaire dans les macrophages humains en augmentant la production d’espèces réactives de l’oxygène lors d’une infection par Staphylococcus aureus.
L’activité anti-inflammatoire des huiles essentielles peut dépendre de la composition et des rapports entre les composés. La composition des huiles essentielles extraites aux différents stades de la période de floraison varie, ce qui laisse supposer que le moment de récolte des fleurs influence leurs effets anti-inflammatoires.
Les macrophages alvéolaires, cellules du système immunitaire inné, constituent la principale source initiale de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires, notamment IL-1β, IL-6, IL-8 et TNF-α, qui sont sécrétées par les macrophages lors d’une infection par P. aeruginosa. Ces cytokines favorisent l’éradication de P. aeruginosa, mais des taux élevés de ces molécules inflammatoires peuvent provoquer de graves lésions des tissus pulmonaires.
L’objectif de notre étude était de déterminer si les huiles essentielles distillées à partir de fleurs de lavande récoltées au début et à la fin de la période de floraison pouvaient influencer la production de cytokines pro-inflammatoires par des monocytes humains THP-1 traités par le LPS de P. aeruginosa. Le LPS active la polarisation des macrophages vers l’état M1, ce qui signifie que les macrophages exercent des activités pro-inflammatoires, libèrent des molécules pro-inflammatoires telles que le monoxyde d’azote, le TNFα, l’IL-1β, l’IL-6 et les prostaglandines, et présentent une activité phagocytaire accrue. La production de cytokines pro-inflammatoires est principalement médiée par la voie de signalisation NFκB.
Selon la littérature, le linalol et l’acétate de linalyle exercent un effet anti-inflammatoire en diminuant la phosphorylation des facteurs de transcription NFκB p65 et p50 et réduisent ainsi la production des cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNFα. Plusieurs huiles essentielles, par exemple celles d’eucalyptus, d’arbre à thé ou de thym, et leurs principaux composants, l’eucalyptol, le terpinène-4-ol et le thymol, sont capables de réduire l’inflammation dans différents modèles animaux et dans des cultures cellulaires in vitro de microglies, de monocytes et de lymphocytes.
Les principaux composants que nous avons identifiés dans l’huile de lavande du début de la période de floraison étaient le linalol à 36,33 % et l’acétate de linalyle à 21,47 %, tandis que ceux de l’huile de lavande de la fin de la période de floraison étaient le linalol à 41,63 % et l’acétate de linalyle à 14,78 %. Les autres composés présents à des pourcentages plus élevés étaient le terpinène-4-ol, respectivement 9,47 et 16,69 %, l’α-terpinéol, 4,27 et 5,23 %, l’acétate de géranyle, 3,19 et 2,92 %, le β-ocimène, 3,43 et 1,33 %, l’acétate de lavandulyle, 2,35 et 1,1 %, et le β-farnésène, 1,51 et 1,3 %. La présence de ces composés et d’autres composés supplémentaires, même en très faibles quantités, peut modifier les effets anti-inflammatoires des LEO étudiées. Il a été décrit que le terpinène-4-ol peut supprimer la libération de médiateurs inflammatoires par les macrophages, tandis que l’α-terpinéol diminue la production de la cytokine pro-inflammatoire IL-6. L’acétate de géranyle et l’acétate de lavandulyle peuvent tous deux contribuer aux propriétés anti-inflammatoires de la LEO, ce dernier étant capable de réduire la production d’IL-6 et d’IL-8 dans les kératinocytes. Le β-ocimène est une molécule puissante dotée d’une activité anti-inflammatoire et le β-farnésène possède une activité antimicrobienne contre P. aeruginosa. Le caryophyllène, l’oxyde de caryophyllène et l’α-humulène ont également été identifiés comme composés mineurs des deux LEO. Ces sesquiterpènes sont connus pour participer à l’activité anti-inflammatoire des huiles essentielles en inhibant la cascade de signalisation TLR et l’activation de NFκB conduisant à la libération de médiateurs inflammatoires par les cellules immunitaires.
Afin de mesurer l’efficacité des LEO pour réduire l’inflammation, deux inhibiteurs sélectifs de NFκB modulant l’activité de la voie à des niveaux distincts ont été utilisés comme témoins positifs. La lutéoline inhibe la dégradation d’IκBα et la translocation nucléaire de la sous-unité p65 de NFκB ; elle inhibe également la production de TNFα et d’IL-6 induite par le LPS en diminuant l’activité de liaison à l’ADN de la protéine activatrice 1 induite par le LPS et la phosphorylation de l’IκB kinase (IKK). L’ACHP est un inhibiteur d’IKK sélectif pour IKKα et IKKβ. L’ACHP bloque également l’activité de liaison à l’ADN de NFκB et la signalisation STAT3.
Les traitements des cellules THP-1 par le linalol et les LEO ont révélé que seuls le linalol et la LEO de la fin de la période de floraison augmentaient la production d’IL-6, ce qui suggère que les huiles essentielles peuvent influencer la voie NFκB, mais cet effet n’était pas significatif. L’augmentation du taux d’IL-6 peut témoigner de l’effet autocrine de la cytokine. Par l’intermédiaire de son récepteur, l’IL-6 active la voie JAK/STAT3, qui exerce un effet synergique avec la voie NFκB ; ensemble, elles médient l’expression d’IL-6. En outre, la régulation négative d’IL-8 et d’IL-1β suggère que les huiles essentielles seules n’ont pas activé la différenciation des monocytes.
L’expression de l’ARNm d’IL-6 ainsi que sa sécrétion ont été diminuées par le linalol ou par la LEO du début de la période de floraison, aussi bien après le prétraitement par le LPS qu’après le traitement par le LPS faisant suite aux prétraitements par les huiles essentielles, et leur effet était plus puissant que celui des inhibiteurs de NFκB. Ces résultats suggèrent que le linalol et la LEO du début de la période de floraison influencent plusieurs points de régulation de la voie NFκB et peuvent également inhiber la signalisation JAK/STAT3.
L’IL-8 est une chimiokine majeure qui stimule la migration et l’activité des monocytes et des macrophages. Sa sécrétion est régulée positivement par la stimulation au LPS et elle agit à la fois selon des modes autocrine et paracrine. L’IL-8 peut en outre moduler la production d’IL-6 et d’IL-1β, mais pas celle du TNFα, ce qui suggère que, bien que l’IL-8 déclenche l’activité du facteur de transcription NFκB, elle n’affecte pas l’activité du promoteur du TNFα. Dans notre étude, le linalol ou la LEO du début de la période de floraison ont été capables de diminuer les taux d’ARNm et de protéines d’IL-8 après le prétraitement par le LPS. En outre, la LEO du début de la période de floraison a mieux réussi à diminuer le taux d’IL-8 que les inhibiteurs de NFκB. Toutefois, ces résultats prometteurs étaient moins marqués dans le cas du prétraitement par l’huile essentielle. Les huiles essentielles précédemment mentionnées ont réduit la production d’IL-8, mais l’inhibiteur de NFκB ACHP s’est révélé plus efficace, ce qui suggère que l’activité inhibitrice de NFκB était plus faible dans le cas des huiles essentielles.
Fait intéressant, la synthèse d’IL-1β est médiée par TLR4 après stimulation par le LPS, mais cela ne suffit pas à provoquer la sécrétion d’IL-1β. La transcription de l’ARNm d’IL-1β est activée par la voie de signalisation NFκB. L’IL-1β est traduite sous la forme d’une molécule précurseur puis convertie en forme active par la caspase-1. Cette enzyme fait partie de l’inflammasome, qui est activé par la signalisation TLR4. Il a été démontré que l’infection des macrophages par différentes souches bactériennes, par exemple Mycobacterium tuberculosis et Pseudomonas aeruginosa, induit la sécrétion d’IL-1β par l’activation d’un inflammasome. P. aeruginosa déclenche en outre l’autophagie des macrophages par l’augmentation de la sécrétion d’IL-1β et, par conséquent, l’IL-1β réduit la capacité de destruction des macrophages. Une régulation négative de la sécrétion d’IL-1β par les macrophages serait donc bénéfique pour accroître leur activité contre l’infection par P. aeruginosa. Fait intéressant, après un prétraitement par le LPS, il semble que les deux huiles essentielles étudiées aient été capables de diminuer l’expression de l’ARNm d’IL-1β, mais seule la LEO du début de la période de floraison a réduit la sécrétion d’IL-1β par rapport au traitement par le LPS. Ces observations suggèrent que les huiles essentielles peuvent inhiber la voie NFκB, mais qu’elles ne peuvent pas bloquer l’activation de l’inflammasome et, par conséquent, la sécrétion d’IL-1β. Une raison possible de l’action des huiles essentielles est que l’inhibition d’IKKβ, un activateur de NFκB, peut induire la sécrétion d’IL-1β après un traitement par le LPS. Le linalol et la LEO du début de la période de floraison ont produit des résultats plus prometteurs lors des prétraitements des cellules THP-1. Tous deux ont efficacement régulé négativement les taux d’ARNm et de protéines de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β, ce qui suggère qu’ils peuvent empêcher l’activation à la fois de NFκB et de l’inflammasome.
Il semble que les huiles essentielles étudiées aient été moins efficaces pour réduire l’expression du TNFα. Cette divergence pourrait s’expliquer par le mécanisme d’action du TNFα. Le TNFα stimule la prolifération des macrophages ainsi que leur différenciation vers l’état M1. Il joue donc un rôle essentiel dans la régulation de la production de cytokines inflammatoires en activant la voie NFκB par la dégradation d’IκBα et l’activation des sous-unités de NFκB. En outre, l’action autocrine du TNFα médiée par l’activation de TLR4 contribue à la survie à long terme des macrophages. Après l’activation par le LPS, seul le linalol a été capable de diminuer significativement l’expression de l’ARNm du TNFα, tandis que la sécrétion de TNFα était significativement plus faible avec les traitements par le linalol et par l’huile de lavande du début de la période de floraison. Ces taux étaient en outre similaires à ceux observés avec les traitements par la lutéoline et l’ACHP. Les prétraitements par le linalol et par l’huile de lavande du début de la période de floraison ont réussi à diminuer le TNFα, mais l’ACHP s’est révélé significativement meilleur que les huiles essentielles. Une explication possible de ces résultats est que le LPS active la voie canonique et la libération de l’hétérodimère p65/p50, ainsi que la voie alternative/non canonique comprenant la libération de l’hétérodimère RelB/p52. Cette dernière inhibe la production de TNFα dans les macrophages. Le linalol et la LEO du début de la période de floraison peuvent influencer les deux voies NFκB, lesquelles exercent des effets opposés sur l’expression du TNFα.
Bien que la LEO de la fin de la période de floraison ait diminué l’expression des ARNm d’IL-6, d’IL-1β et d’IL-8 après un prétraitement par le LPS, elle n’a pas été capable de réduire la sécrétion des cytokines. En outre, dans le cas du prétraitement par l’huile essentielle, la LEO de la fin de la période de floraison a principalement augmenté la production de cytokines pro-inflammatoires au lieu de l’inhiber.
La synergie entre les composants des huiles essentielles étudiées peut contribuer à leurs propriétés anti-inflammatoires. Les différences de composition entre l’huile de lavande extraite au début et celle extraite à la fin de la période de floraison peuvent participer à leurs effets distincts sur la régulation et la production des cytokines pro-inflammatoires IL-6, IL-1β, IL-8 et TNFα dans les cellules THP-1 stimulées par le LPS de P. aeruginosa.
Dans notre étude, nous avons mis en évidence les différents effets anti-inflammatoires des LEO extraites au début et à la fin de la période de floraison sur la lignée cellulaire humaine de monocytes/macrophages THP-1. Dans nos expériences, un traitement par le LPS de P. aeruginosa a été utilisé pour induire l’inflammation, compte tenu de sa grande pertinence dans les infections respiratoires à travers le monde. Nous avons déterminé les concentrations d’ARNm ainsi que de protéines des puissantes cytokines pro-inflammatoires IL-6, IL-8, IL-β et TNFα produites par les macrophages au cours de l’inflammation. Afin de démontrer l’efficacité des LEO et de leur principal composant, le linalol, nous avons utilisé des inhibiteurs bien connus de la synthèse des cytokines pro-inflammatoires. Selon nos résultats, il semble que les différences de composition entre les LEO étudiées contribuent aux effets anti-inflammatoires. D’après nos résultats, il a été démontré que la LEO extraite au début de la période de floraison est un puissant inhibiteur de la synthèse de quatre cytokines pro-inflammatoires, IL-6, IL-8, IL-β et TNFα, par les cellules THP-1. Cela confirme la pertinence de la récolte des fleurs de lavande au début de la floraison pour la production d’huile essentielle et son utilisation comme traitement anti-inflammatoire.
Fichier supplémentaire 1.
Cette étude in vitro sur la lignée humaine de monocytes/macrophages THP-1 montre que l’huile essentielle de Lavandula angustifolia Mill. extraite de fleurs récoltées au début de la floraison, testée à une dilution de 500 fois, inhibe la synthèse des cytokines pro-inflammatoires IL-6, IL-8, IL-1β et TNFα après stimulation par 100 ng/mL de LPS de Pseudomonas aeruginosa. Elle contenait notamment 36,33 % de linalol et 21,47 % d’acétate de linalyle, contre 41,63 % et 14,78 % dans l’huile de fin de floraison. Le linalol et l’huile de début de floraison ont produit des effets comparables à ceux des inhibiteurs de NFκB, la lutéoline et l’ACHP, ce qui suggère une action sur la voie NFκB et, possiblement, sur JAK/STAT3 et l’inflammasome. L’huile de fin de floraison a réduit certains ARNm après prétraitement par le LPS sans réduire la sécrétion des cytokines et a principalement accru leur production lorsqu’elle était utilisée en prétraitement. Le niveau de preuve est celui d’une étude expérimentale in vitro sur une lignée cellulaire humaine, avec trois répétitions de chaque expérience, et ne constitue pas une preuve d’efficacité clinique.
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