Référence : Scientific Reports 2017. — PMC5613005 · DOI 10.1038/s41598-017-12388-2 Type : Article de recherche original (études in vitro et in vivo) · Plante : Mélisse officinale · Propriété → Antiviral Accès : ⭐ libre (Open Access CC-BY 4.0) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
L’infection par l’entérovirus 71 (EV71) est endémique dans la région Asie-Pacifique. Aucun médicament antiviral spécifique n’est disponible pour traiter l’infection à EV71. Melissa officinalis (MO) est une plante médicinale employée de longue date en Europe et au Moyen-Orient. Nous avons cherché à déterminer si une solution aqueuse d’extrait méthanolique concentré (MOM) possède une activité antivirale. Le MOM a inhibé la formation de plages de lyse, l’effet cytopathique et la synthèse des protéines virales dans les cellules infectées par l’EV71. À l’aide de techniques spectrales, nous avons identifié l’acide rosmarinique (RA) comme constituant biologiquement actif du MOM. Le RA a réduit l’attachement et l’entrée du virus ; le clivage du facteur d’initiation de la traduction eucaryote 4 G (eIF4G) ; la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ; et la translocation de la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène A1 (hnRNP A1) du noyau vers le cytoplasme. Il a atténué l’hyperphosphorylation, induite par l’EV71, de la kinase p38 et d’EPS15. Le RA est susceptible de réprimer l’activation de la kinase p38 médiée par les ROS, ainsi que les événements moléculaires en aval tels que la translocation de hnRNP A1 et le trafic membranaire régulé par EPS15 dans les cellules infectées par l’EV71. Ces résultats suggèrent que MO et son constituant RA possèdent des activités anti-EV71 et pourraient servir de médicament candidat pour des usages thérapeutiques et prophylactiques contre l’infection à EV71.
Le syndrome pieds-mains-bouche (SPMB) est une maladie infectieuse infantile fréquente causée par plusieurs souches virales appartenant au genre Enterovirus au sein de la famille des Picornaviridae. L’entérovirus 71 (EV71) est l’un des principaux agents pathogènes responsables du SPMB chez les nourrissons et les enfants de moins de 5 ans. Les patients atteints de SPMB souffrent de fièvre et d’exanthèmes vésiculaires sur les mains, les pieds, les fesses et la bouche. Une faible proportion des patients infectés par l’EV71 développent une infection sévère du système nerveux central (SNC), pouvant entraîner une défaillance neurologique cardiopulmonaire, des complications systémiques, voire un décès. Même ceux qui survivent à une infection sévère peuvent présenter des déficits moteurs et cognitifs à long terme. L’EV71 a été isolé pour la première fois chez des patients atteints d’une maladie du SNC en Californie, aux États-Unis, entre 1969 et 1972, et a provoqué plusieurs cas sporadiques dans le monde durant les années 1970 et 1980. Au cours des deux dernières décennies, de graves épidémies d’EV71 ont touché plus de plusieurs millions d’enfants et coûté la vie à des centaines d’entre eux dans la région Asie-Pacifique. Il n’existe pas de traitement spécifique de l’infection entérovirale du SNC, et des thérapies de soutien ont été utilisées pour gérer l’insuffisance cardiaque pulmonaire induite par l’EV71. Le développement de nouvelles thérapeutiques est nécessaire pour améliorer le pronostic clinique de l’infection.
L’EV71 est un virus à ARN simple brin de polarité positive, dont le génome mesure environ 7 400 nucléotides. Le génome ARN est enfermé dans une coque capsidique icosaédrique. Lors de l’infection virale, l’EV71 s’attache aux récepteurs cellulaires et pénètre dans les cellules hôtes par endocytose. L’engagement du virus avec le récepteur scavenger B2 (SCARB2) entraîne la libération de l’ARN viral. L’ARN viral contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES) de type I fortement structuré, situé dans la région 5′ non traduite (UTR). L’IRES interagit avec des protéines de l’hôte, à savoir les facteurs agissant en trans sur l’IRES (ITAF), pour recruter le ribosome et initier la traduction. La ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène (hnRNP) A1, une protéine de liaison à l’ARN, agit comme un ITAF pour renforcer la traduction médiée par l’IRES de l’EV71. La translocation de hnRNP A1 du noyau vers le cytoplasme est requise pour la traduction et la réplication virales lors de l’infection à EV71. L’ARN viral est traduit en une unique polyprotéine précurseur, qui est hydrolysée par les protéases virales, 2A^pro et 3C^pro, pour produire les protéines structurales virales matures (VP1, VP2, VP3 et VP4) et les protéines non structurales (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C et 3D). L’EV71 utilise l’appareil de traduction des cellules hôtes pour produire les protéines virales et bascule la traduction de l’ARNm coiffé vers l’ARN viral. Les protéases virales, 2A^pro et 3C^pro, clivent le facteur d’initiation eucaryote 4 G (eIF4G), le facteur d’initiation eucaryote 4A (eIF4A) et la protéine de liaison à la poly(A) (PABP), qui sont requis pour la traduction dépendante de la coiffe. L’infection à EV71 induit l’expression du miR-141 qui cible le facteur d’initiation eucaryote 4 G (eIF4G).
Plusieurs éléments de preuve étayent l’idée que le statut redox de l’hôte affecte la pathogenèse virale. Nous avons précédemment montré que l’infection à EV71 induit un stress oxydatif, qui à son tour favorise la réplication virale. Le traitement par des antioxydants, tels que la N-acétylcystéine (NAC) ou le mito-Tempo, réprime la réplication de l’EV71. Des antioxydants naturels, le gallate d’épigallocatéchine (EGCG) et le gallate de gallocatéchine (GCG), présents dans le thé vert, possèdent une activité antivirale qui corrèle bien avec leur capacité antioxydante. Il est probable que les activités antivirales des produits naturels puissent être en partie attribuées à leurs activités antioxydantes.
Les plantes médicinales constituent des sources potentielles pour le développement de médicaments antiviraux. Melissa officinalis (MO), également connue sous le nom de mélisse (« lemon balm »), est une plante vivace appartenant à la famille des Labiées (Labiatae). En Europe du Sud, dans la région méditerranéenne, en Asie occidentale et en Afrique du Nord, les feuilles fraîches de MO ont été utilisées pour parfumer les plats, les tisanes, les vinaigres et les huiles depuis plus de 2 000 ans. Les feuilles et les tiges séchées ou fraîches de MO sont utilisées comme médicament pour traiter les troubles inflammatoires, gastro-intestinaux, mentaux, névralgiques et rhumatismaux. MO présente une activité antivirale contre le virus de l’herpès simplex de type 1, le virus de l’herpès simplex de type 2, le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 et le virus de la grippe. Choi et al. ont montré que l’extrait aqueux de MO prévient la perte de viabilité dans les cellules Vero infectées par l’EV71. Cependant, le mécanisme sous-jacent à l’activité antivirale de MO est actuellement inconnu.
Dans la présente étude, nous montrons que l’extrait méthanolique de MO (MOM) inhibe l’effet cytopathique, la formation de plages de lyse et la synthèse des protéines virales dans les cellules infectées par l’EV71. Une caractérisation et une identification plus poussées révèlent que l’acide rosmarinique (RA) est un constituant anti-entéroviral actif du MOM. Sur le plan mécanistique, le RA inhibe l’accumulation de ROS induite par l’EV71, la translocation de hnRNP A1, le clivage d’eIF4G et la phosphorylation, médiée par p38, du substrat 15 du récepteur du facteur de croissance épidermique (EPS15). Nos résultats suggèrent que le RA agit sur de multiples voies pour exercer son effet antiviral.
Le sirop de MOM a été dilué dans l’eau et testé pour son activité antivirale. À l’aide du test de réduction des plages de lyse, nous avons examiné l’activité anti-EV71 du MOM. Des monocouches de cellules RD ou Vero ont été infectées avec 100 PFU/puits ou 200 PFU/puits des souches d’EV71, BrCr, 1743 ou 4643, pendant 1 h, puis recouvertes d’un milieu semi-solide contenant 0,3 % d’agarose et 0, 78 ou 156 μg/ml de MOM. Le MOM a diminué les plages formées par ces souches virales dans les cellules RD et Vero à des concentrations allant jusqu’à 156 μg/ml (Fig. [ ]). À ces concentrations, le MOM n’était pas cytotoxique pour les cellules RD (CC50 = 370,9 ± 1,07 μg/ml, Fig. supplémentaire [ ]) ni pour les cellules Vero (CC50 = 555,4 ± 1,05 μg/ml, Fig. supplémentaire [ ]). De plus, le MOM a inhibé l’effet cytopathique (CPE) induit par le virus dans les cellules RD et Vero (Fig. supplémentaire [ ]). Les cellules infectées présentaient un CPE caractérisé par l’arrondissement des cellules et la présence de noyaux en forme de croissant avec une chromatine condensée, du fait du CPE à 16 h après l’infection. Le pourcentage de cellules à noyaux en forme de croissant diminuait après traitement au MOM de manière dose-dépendante (Fig. supplémentaire [ ]). Cela s’accompagnait d’une diminution de l’expression des protéines de l’EV71, notamment la capside virale (VP2), l’ARN polymérase ARN-dépendante (3D^pol) et la protéase (3CD^pro), dans les cellules infectées traitées au MOM. Les taux de protéine 3D^pol étaient réduits de 98 % et 99 %, respectivement, dans les cellules RD infectées traitées avec 156 et 312 μg/ml de MOM (Fig. [ ]). Les niveaux d’expression de VP2 étaient abaissés de plus de 99 % dans les cellules infectées traitées avec 156 et 312 μg/ml (Fig. [ ]). La concentration inhibitrice à 50 % (IC50) du MOM pour son effet inhibiteur sur l’EV71 dans les cellules RD était de 45,92 ± 1,05 µg/ml (Fig. [ ]). Ces résultats indiquent que le MOM possède une activité anti-EV71.
Pour identifier les constituants antiviraux du MOM, nous avons dilué le sirop vert foncé de MOM dans l’eau et l’avons partitionné avec un volume égal d’acétate d’éthyle (EtOAc) (Fig. [ ]). Les fractions aqueuse et organique ont été évaporées, et les fractions résultantes MOMW et MOME ont été obtenues. Ces fractions ont été testées pour leur activité antivirale. Les deux fractions MOMW et MOME ont réduit la formation de plages de lyse pour toutes les souches virales testées (Fig. [ ]). À ces concentrations, MOMW (CC50 = 153,7 ± 1,07 μg/ml, Fig. supplémentaire [ ]) et MOME (CC50 = 21,61 ± 1,08 μg/ml, Fig. supplémentaire [ ]) présentaient une faible cytotoxicité envers les cellules Vero, telle que déterminée par le test standard au rouge neutre. Ces résultats suggèrent que ces extraits possèdent en commun certains composants biologiquement actifs. Les fractions MOMW et MOME ont été dissoutes dans le DMSO et soumises à une analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC/MS). Le chromatogramme du pic de base est présenté (Fig. [ ]). Le composé de rapport masse/charge (m/z) de 359,07 était le plus abondant dans l’analyte issu de la fraction aqueuse, et présent en quantité similaire dans l’analyte issu de la fraction EtOAc. Le composé a été identifié plus précisément par LC/MS/MS (Fig. supplémentaire [ ]). Le spectre de masse de ce composé correspondait à celui de l’acide rosmarinique (RA) (Fig. supplémentaire [ ]). Le composé a été purifié à partir de MOMW par chromatographie sur colonne (Fig. supplémentaire [ ]) et analysé par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN). Le spectre RMN ^1H de ce composé (Fig. supplémentaire [ ]) était identique à celui du RA (Fig. supplémentaire [ ]).
La formation de plages de lyse était efficacement inhibée par un traitement avec 39 ou 78 μg/ml de RA, pour les cellules Vero et RD et pour toutes les souches virales testées (Fig. [ ]). À ces concentrations, le RA n’était pas cytotoxique pour les cellules RD (CC50 = 209,8 ± 1,04 μg/ml, Fig. supplémentaire [ ]) ni pour les cellules Vero (CC50 = 593,7 ± 1,08 μg/ml, Fig. supplémentaire [ ]). En cohérence avec cela, l’expression de la protéine entérovirale 3D^pol a diminué de 78 % et 91 % dans les cellules RD infectées traitées avec 78 et 156 μg/ml de RA (Fig. [ ]). Les taux de VP2 ont chuté de 73 % et 86 %, respectivement, dans les cellules infectées par BrCr après traitement avec 19 et 39 μg/ml de RA (Fig. [ ] et Fig. supplémentaire [ ]). Les taux de VP0 étaient inférieurs de 42 % et 63 % dans des cellules RD infectées par BrCr traitées de façon similaire, comparativement aux cellules infectées seules. La diminution discordante des niveaux de ces protéines implique que le traitement de VP0 en VP2 pourrait être affecté. Le rapport entre le niveau de VP2 et celui de VP0 diminue dans les cellules traitées au MOM ou au RA de manière dose-dépendante (Fig. supplémentaire [ ]). De plus, le RA a inhibé la synthèse du génome viral dans les cellules RD et Vero infectées par l’EV71 de manière dose-dépendante (Fig. [ ] et Fig. supplémentaire [ ]). Le niveau d’ARN de l’EV71 dans les cellules RD infectées a diminué de 71 % et 78 %, respectivement, après traitement avec 78 et 156 μg/ml de RA (Fig. [ ]). De même, son niveau dans les cellules Vero infectées a décliné de 79 % après traitement avec 312 μg/ml de RA (Fig. supplémentaire [ ]). Les diminutions de la réplication de l’ARN viral et de la synthèse des protéines s’accompagnent d’une réduction du virus de descendance. Les particules virales extracellulaires et intracellulaires ont diminué de 91 % et 90 % dans les cellules RD infectées après traitement avec 78 μg/ml de RA (Fig. [ ]). L’IC50 du RA pour son effet inhibiteur sur l’EV71 dans les cellules RD était de 43,07 ± 1,05 μg/ml (Fig. supplémentaire [ ]). Ces résultats valident l’activité anti-EV71 du RA.
Comme première étape de l’étude du mécanisme antiviral du RA, nous avons réalisé un test de temps d’addition (« time-of-addition ») afin d’identifier les stades auxquels le RA inhibe l’infection par l’EV71. Le RA a été administré à différents stades de l’infection par BrCr (Fig. [ ]), et le niveau d’expression de la protéine virale VP1, indicateur de la réplication virale, a été étudié. Lorsque les cellules étaient prétraitées avec le RA, le RA n’a pas réussi à réprimer l’infection par l’EV71 et l’a même légèrement renforcée (Fig. [ ], condition 2). Le traitement des cellules avec le RA pendant l’absorption virale (Fig. [ ], condition 3) et pendant la période post-adsorption (Fig. [ ], condition 4) a diminué modérément la réplication virale. L’inclusion du RA pendant les stades d’adsorption et de post-absorption a réduit significativement la réplication virale (Fig. [ ], condition 5). Ces résultats indiquent que le RA inhibe l’infection virale durant l’attachement viral et après l’absorption virale. Le RA a montré un effet anti-EV71 synergique lorsqu’il était présent au cours des deux phases.
Le RA inhibe la réplication virale durant l’attachement viral. Il est possible que le RA interagisse avec les virions et empêche leur interaction avec les récepteurs cellulaires. Pour tester cette hypothèse, des particules virales ont été incubées avec 156 μg/ml de RA sur glace pendant 1 h, et tout excès de RA a été retiré par filtration centrifuge. Le titre viral restant a été déterminé par test de plages de lyse. Le titre viral dans le groupe traité au RA était de 4,28 ± 1,17 × 10^4 PFU/ml, inférieur à celui du groupe témoin véhicule (1,18 ± 0,25 × 10^5 PFU/ml) (Fig. [ ]). Un tel résultat suggère que le RA pourrait interagir avec les virions et interférer avec leur liaison aux récepteurs cellulaires.
La capacité du RA à inhiber la réplication virale durant la phase de post-absorption nous a incités à étudier le mécanisme antiviral sous-jacent. On sait que l’infection à EV71 induit le basculement entre la traduction dépendante de la coiffe et la traduction dépendante de l’IRES. Pour déterminer si le RA affecte ce processus moléculaire, des cellules RD ont été transfectées avec un plasmide bicistronique pRHF-EV71-5′UTR (Fig. [ ]), infectées par BrCr pendant 1 h, puis traitées au RA. Le rapport entre l’activité de la luciférase de luciole et celle de la luciférase Renilla (Fluc/Rluc) est indicatif des activités relatives de la traduction dépendante de l’IRES et de la traduction dépendante de la coiffe. Il était supérieur de 27,66 % dans les cellules infectées par l’EV71 par rapport aux cellules non infectées (p < 0,001) (Fig. [ ]). Le RA a atténué une telle augmentation du rapport Fluc/Rluc de manière dose-dépendante (Fig. [ ]). Il est possible que le RA perturbe le basculement, induit par l’EV71, entre traduction dépendante de la coiffe et traduction dépendante de l’IRES. On sait que la protéase virale 2A^pro hydrolyse le facteur d’initiation de la traduction eIF4G, entraînant l’arrêt de la traduction dépendante de la coiffe. Pour explorer la possibilité que le traitement au RA puisse inhiber le clivage d’eIF4G induit par l’EV71 afin de bloquer l’arrêt de la traduction dépendante de la coiffe, nous avons examiné le niveau d’expression d’eIF4G dans les cellules infectées par l’EV71. Des cellules RD ont été infectées par l’EV71 à une multiplicité d’infection (m. o. i.) de 20 et traitées avec 156 μg/ml de RA dans les conditions représentées à la Fig. [ ]. L’infection à EV71 a conduit à un clivage complet d’eIF4G (Fig. [ ], condition 1). Le prétraitement au RA n’a pas affecté le clivage d’eIF4G (Fig. [ ], condition 2). Lorsque le RA était ajouté durant la phase d’adsorption virale ou la phase post-adsorption, le clivage d’eIF4G était partiellement inhibé (Fig. [ ], conditions 3 et 4). Lorsque le RA était administré durant les deux phases, d’adsorption virale et de post-absorption, il agissait de façon synergique pour inhiber le clivage d’eIF4G (Fig. [ ], condition 5). Ces résultats suggèrent que le RA inhibe l’arrêt, induit par l’EV71, de la traduction dépendante de la coiffe, par préservation de l’eIF4G intact.
Nous avons étudié si le RA inhibe la traduction dépendante de l’IRES de la protéine entérovirale. L’initiation de la traduction dépendante de l’IRES est régulée par les ITAF, tels que hnRNP A1. hnRNP A1 se relocalise dans le cytoplasme durant l’infection et interagit avec l’IRES situé dans la 5′UTR de l’EV71. Pour étudier l’hypothèse que le RA puisse interférer avec ce processus, nous avons transfecté des cellules RD avec un plasmide d’expression codant un hnRNP A1 marqué à la GFP (pGFP-hnRNP A1) ; infecté les cellules transfectées avec l’EV71 ; et analysé l’effet du RA sur la translocation cytoplasmique du hnRNP marqué à la GFP. Le hnRNP A1 marqué à la GFP était localisé dans les noyaux des cellules non infectées (« mock ») et transloqué des noyaux vers le cytoplasme dans les cellules infectées par l’EV71 (Fig. [ ]). La relocalisation de hnRNP A1 dans les cellules infectées était inhibée par un traitement avec 156 μg/ml de RA (Fig. [ ]). Le pourcentage de cellules montrant une accumulation cytoplasmique de hnRNP A1 marqué à la GFP (c.-à-d. les cellules GFP-positives cytoplasmiques) a été quantifié à l’aide d’une technique d’imagerie à haut débit. Le pourcentage de ces cellules était de 14,39 ± 2,91 % dans le groupe non infecté, mais il a augmenté à 49,74 ± 4,52 % dans le groupe infecté par l’EV71 (Fig. [ ]). Le traitement au RA a diminué le pourcentage de cellules GFP-positives cytoplasmiques de manière dose-dépendante. Le pourcentage de cellules infectées montrant une relocalisation de hnRNP A1 a décliné à 30,92 ± 3,97 % après traitement avec 156 μg/ml de RA (Fig. [ ]). Il est possible que le RA régule à la baisse la translocation de hnRNP A1 et inhibe la traduction dépendante de l’IRES.
La distribution subcellulaire de hnRNP A1 est régulée par la signalisation p38. La capacité du RA à réprimer la redistribution de hnRNP A1 induite par l’EV71 soulève la possibilité que le RA régule la relocalisation de hnRNP A1 via son effet sur la voie p38. Pour tester cette hypothèse, nous avons infecté des cellules RD avec BrCr à une m. o. i. de 20 ; traité les cellules infectées sans ou avec 156 μg/ml de RA ; récolté leur protéine totale pour une analyse par immunoblot de la kinase p38 phosphorylée. L’infection à EV71 a induit une phosphorylation biphasique de la kinase p38. La phosphorylation de la kinase p38 augmentait légèrement autour de 15 à 30 min après l’infection. Une phosphorylation plus forte de la kinase p38 dans les cellules infectées par l’EV71 a été observée durant la période allant de 2 h à 6 h après l’infection (Fig. [ ]). Le traitement au RA a réprimé la phosphorylation de p38 induite par l’EV71 (Fig. [ ]). Pour démontrer le rôle de la kinase p38 dans l’infection à EV71, des cellules RD ont été traitées avec l’inhibiteur de p38 SB202190, puis infectées par l’EV71. Le SB202190 a inhibé l’expression de la protéine de capside virale VP1 de manière dose-dépendante (Fig. [ ]). La production de virus de descendance a diminué de 92 % dans les cellules infectées par l’EV71 traitées avec 50 μM de SB202190, comparativement aux cellules traitées au témoin véhicule (Fig. [ ]). Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de p38 induite par l’EV71 peut être réprimée par le RA. Il est intéressant de noter que le clivage d’eIF4G dans les cellules infectées par l’EV71 n’était pas modifié par le traitement au SB202190 (Fig. [ ]), indiquant que le clivage d’eIF4G induit par l’EV71 est indépendant de l’activation de p38.
Pour étudier la relation causale entre l’activité de p38 et la relocalisation de hnRNP A1, nous avons étudié l’effet du SB202190 sur la distribution de hnRNP A1. Des cellules RD ont été transfectées avec pGFP-hnRNP A1, traitées au SB202190, puis infectées par BrCr. Le SB202190 a diminué la relocalisation de hnRNP A1 induite par l’EV71 de manière dose-dépendante (Fig. [ ]). Un tel résultat suggère que l’EV71 pourrait induire l’accumulation cytoplasmique de hnRNP A1 via la signalisation p38.
L’infection à EV71 induit un stress oxydatif dans les cellules hôtes, qui active la phosphorylation de la kinase p38. La capacité antioxydante du RA a été déterminée à l’aide du test du pouvoir antioxydant par réduction du fer (FRAP) à 2,235 ± 0,035 g Trolox/g RA. On émet l’hypothèse que le RA piège la génération de ROS induite par l’EV71 et réprime l’activation de p38. Pour étudier cette hypothèse, nous avons marqué les cellules infectées par l’EV71 avec le H2DCFDA ou le colorant CellROX Deep Red afin de déterminer la génération intracellulaire de ROS. Les niveaux de ROS augmentaient dans les cellules infectées par BrCr, 1743 et 4643, comparativement aux cellules non infectées. Le traitement au RA a réduit la génération de ROS dans les cellules infectées par l’EV71 (Fig. [ ] et Fig. supplémentaire [ ]). Pour évaluer si le RA agit en bloquant l’activation de p38 induite par les ROS, nous avons traité des cellules RD avec 500 μM de H2O2 et examiné l’effet du RA sur la phosphorylation de p38. Comme attendu, le peroxyde d’hydrogène a induit la phosphorylation de p38, mais le traitement au RA a atténué l’activation de p38. En cohérence avec cela, le peroxyde d’hydrogène a induit l’accumulation cytoplasmique de hnRNP A1 dans les cellules RD (Fig. supplémentaire [ ]). Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de p38 et la translocation de hnRNP A1 induites par les ROS peuvent être inhibées par le RA.
EPS15, une protéine cible de p38, régule le trafic intracellulaire, qui est essentiel à la réplication virale. L’infection à EV71 a conduit à une augmentation de la phosphorylation d’EPS15 au niveau de la Ser796. Le traitement au RA a significativement réduit une telle augmentation dans les cellules RD infectées (Fig. [ ], pistes 2 et 3). Pour déterminer si p38 induit la phosphorylation d’EPS15, des cellules RD ont été traitées au SB202190, infectées par l’EV71, et la phosphorylation d’EPS15 a été détectée par immunoblot. Le SB202190 a significativement réduit la phosphorylation d’EPS15 induite par l’EV71 de manière dose-dépendante (Fig. [ ]). Ces résultats suggèrent que l’EV71 induit la phosphorylation d’EPS15 via la voie de la kinase p38. Il est possible que le RA puisse inhiber la phosphorylation d’EPS15 en réprimant la signalisation p38.
Pour étudier si le RA protège les souris de l’infection par l’EV71, des souris ICR exemptes d’organismes pathogènes spécifiques (SPF), âgées de sept jours, ont été infectées par voie intrapéritonéale avec le virus adapté à la souris, puis traitées au RA (50 mg/kg) ou au PBS à intervalles quotidiens pendant 14 jours. Le taux de survie des souris traitées au RA (66,67 %, n = 6) était supérieur à celui des souris traitées au PBS (33,33 %, n = 6) (Fig. supplémentaire [ ]). De plus, un pourcentage plus élevé de souris traitées au RA se sont rétablies de la maladie par rapport aux souris traitées au PBS (Fig. supplémentaire [ ]). Ces résultats suggèrent que le RA pourrait offrir une protection contre l’infection à EV71 in vivo.
La présente étude a montré que le MOM présente une activité anti-EV71. Le RA, identifié comme un constituant antiviral du MOM, inhibe la réplication virale et offre un effet protecteur contre l’infection à EV71 in vivo. Sur le plan mécanistique, le RA réprime l’attachement du virion aux cellules hôtes, le clivage d’eIF4G et la relocalisation cytoplasmique de hnRNP A1. Le RA agit comme un piégeur de ROS pour bloquer la signalisation des ROS et l’activation de la kinase p38, entraînant une diminution de la relocalisation cytoplasmique de hnRNP A1 et de la phosphorylation d’EPS15. Nos résultats suggèrent que le RA exerce son effet antiviral via de multiples mécanismes.
MO est originaire d’Europe du Sud, de la région méditerranéenne, des pays du Moyen-Orient et d’Afrique du Nord, et est aujourd’hui cultivée dans le monde entier. MO est couramment consommée dans l’alimentation et dans des boissons bénéfiques. Choi et al. ont montré que l’extrait de MO préparé par extraction dans l’eau à 40 °C possède des activités antivirales. L’extrait de MO préparé par extraction méthanolique à 60 °C a montré une activité anti-EV71 dans notre étude. Cependant, l’extraction méthanolique à température ambiante a produit, dans l’étude de Choi, un extrait dépourvu d’activité anti-EV71. Une différence majeure pourrait résider dans la température à laquelle l’extraction a été réalisée. La température d’extraction plus élevée employée dans notre étude pourrait être bénéfique à l’extraction des constituants antiviraux biologiquement actifs de MO. L’étude du mécanisme antiviral du MOM nécessite l’identification des constituants biologiquement actifs. Le MOM dilué dans l’eau a ensuite été partitionné avec un volume égal d’EtOAc. Les deux phases ont été traitées plus avant, et les fractions résultantes ont conservé une activité anti-EV71 (Fig. [ ]). À l’aide de la chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) ainsi que de la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), nous avons constaté que le RA était présent à la fois dans les fractions aqueuse et organique. Chimiquement parlant, le RA est un ester de l’acide caféique et de l’acide 3,4-dihydroxyphénylactique. On le trouve dans de nombreuses plantes de la famille des Labiées. Plusieurs plantes de cette famille, notamment Salvia miltiorrhiza (danshen) et Ocimum basilicum, présentent des activités anti-EV71. L’acide rosmarinique a également été identifié comme un constituant antiviral de Salvia miltiorrhiza. Notre constatation que le RA possédait une activité antivirale contre un certain nombre de souches d’EV71 cliniquement pertinentes, à savoir les souches 1743 et 4643, est intéressante (Fig. [ ]). Cela ouvre l’espoir de développer un traitement contre l’EV71, et possiblement contre d’autres virus neurotropes.
Un test de temps d’addition a été utilisé pour examiner les stades mécanistiques auxquels le RA agit pour inhiber le processus d’infection par l’EV71. Le RA agit durant les phases d’adsorption virale et post-adsorption (Fig. [ ]). L’incubation du virus avec le RA a réduit son infectiosité (Fig. [ ]), impliquant que le RA pourrait se lier directement aux particules entérovirales et interférer avec leur attachement au récepteur cellulaire. On sait que l’extrait de MO et le RA peuvent interagir directement avec les particules virales enveloppées. La densité du virion du VIH-1 augmente après traitement avec un extrait aqueux de MO, possiblement en conséquence d’une modification chimique de la particule virale par les constituants de l’extrait et de leur liaison à celle-ci. De plus, l’extrait de MO et le RA inhibent l’attachement du virus de l’herpès simplex de type I. La manière dont les constituants de MO et le RA agissent pour interférer avec l’attachement viral demeure insaisissable, de même que la question de savoir si un mécanisme similaire est impliqué pour les virus enveloppés et l’entérovirus non enveloppé.
Plusieurs mécanismes pourraient être tenus responsables des activités anti-EV71 du RA en phase post-adsorption. Le RA réprime la subversion, induite par l’EV71, de la traduction de la cellule hôte et l’initiation de la traduction virale. Le clivage d’eIF4G et de PABP par 2A^pro et celui de PABP par 3C^pro sont impliqués dans ce processus. Il est probable que le RA inhibe les protéases virales. Par exemple, 2A^pro est une protéase à cystéine homologue de la famille trypsine-like des protéases à sérine. Le RA peut réagir avec le site actif d’une autre protéase à cystéine, la caspase 3. Il est possible que le RA puisse inhiber les protéases virales de manière similaire. De plus, le RA pourrait réprimer la traduction virale et réduire l’expression des protéases virales. L’initiation de la traduction virale implique l’association des facteurs agissant en trans spécifiques de l’IRES (ITAF) et des sous-unités ribosomiques avec l’IRES de type I. Un ITAF, hnRNP A1, se relocalise du noyau vers le cytoplasme durant l’infection et se lie aux boucles-tiges (« stem loops ») II et VI de l’IRES de l’EV71 pour renforcer l’initiation de la traduction. L’effet inhibiteur du RA sur la translocation de hnRNP A1 pourrait conduire à une réduction de la traduction et de la réplication virales. Il est intéressant de noter que la discordance dans les niveaux d’expression de VP0 et VP2 implique que le traitement de VP0 est affecté négativement par le MOM et le RA. Il est probable que le RA et les constituants biologiquement actifs du MOM puissent inhiber la protéase virale et le clivage de VP0.
La distribution subcellulaire de hnRNP A1 peut être régulée par les ROS. L’arsénite, qui induit un stress oxydatif, provoque la relocalisation de hnRNP A1 vers le cytoplasme. Nous avons également constaté que le traitement des cellules RD avec 500 μM de peroxyde d’hydrogène induit la relocalisation cytoplasmique de hnRNP A1 (Fig. supplémentaire [ ]). On sait que l’infection à EV71 déclenche la génération de ROS mitochondriaux et/ou l’activation de la NADPH oxydase. L’augmentation des ROS pourrait activer la signalisation en aval et la translocation de hnRNP A1. Étant donné la puissante capacité antioxydante du RA (Fig. [ ]), il pourrait piéger les ROS pour bloquer de tels événements moléculaires.
L’activation des voies liées aux MAPK a été impliquée dans la pathogenèse de l’EV71. Une phosphorylation accrue de la kinase p38 a été observée durant les stades précoces (15 min à 30 min) et tardifs (2 à 6 h après l’infection) du cycle de vie de l’EV71 dans les cellules RD (Fig. [ ]). Il est probable que l’activation de la kinase p38 soit essentielle à la réplication de l’EV71. L’inhibition pharmacologique de la kinase p38 a réduit significativement la traduction virale (Fig. [ ]). En cohérence avec cela, la cascade de signalisation de la kinase p38 joue un rôle régulateur dans la distribution subcellulaire de hnRNP A1. L’activation de cette voie renforce la relocalisation de hnRNP A1, tandis que son inhibition contrarie ce processus. En accord avec cela, nous avons montré que le traitement avec l’inhibiteur de la kinase p38 bloquait la relocalisation cytoplasmique de hnRNP A1 induite par l’EV71 (Fig. [ ]). Notre constatation que le traitement au RA réprimait l’activation, induite par l’EV71, de la kinase p38 est intrigante (Fig. [ ]). Elle implique que le RA agit sur la kinase p38 ou en amont de celle-ci. Il a été montré que les ROS peuvent activer la cascade de la kinase p38. Le traitement au peroxyde d’hydrogène a induit la phosphorylation de la kinase p38, qui était inhibée en présence de RA (Fig. [ ]). Comme mentionné précédemment, le RA agit comme un piégeur de ROS et, de cette manière, pourrait prévenir l’activation de la kinase p38. Cela n’est pas sans précédent. Il a été montré que le traitement antioxydant réprime l’activation de la kinase p38 induite par les ROS. De plus, le RA est connu pour réguler l’expression des enzymes antioxydantes. Par exemple, l’administration de RA à des souris âgées induit l’expression de la superoxyde dismutase, de la catalase et de la glutathion peroxydase dans leur foie et leurs reins. Ces résultats suggèrent que le RA pourrait réprimer l’activation de la kinase p38 et la translocation de hnRNP A1 par un mécanisme antioxydatif.
EPS15, une autre cible de la kinase p38, joue un rôle important dans l’infection à EV71. EPS15 co-localise avec l’α-adaptine et la clathrine, et est supposée moduler l’endocytose médiée par la clathrine (CME) et le trafic membranaire. Des résultats récents ont suggéré que la phosphorylation régule l’activité biochimique d’EPS15. EPS15 peut être phosphorylée par p38 au niveau de la Ser796, et ce site de phosphorylation est impliqué dans la régulation du processus endocytique. Le silençage d’EPS15 a un effet répresseur sur l’infection entérovirale. EPS15 pourrait être impliquée dans la CME du virus et dans le trafic membranaire essentiel à la réplication de l’EV71. Il a récemment été montré que l’entérovirus utilise la machinerie endocytique pour distribuer le cholestérol vers les organites de réplication, où le cholestérol facilite la réplication et le traitement de 3CD^pro. L’activité antivirale du RA pourrait s’expliquer en partie par sa capacité à inhiber la kinase p38 et la phosphorylation d’EPS15.
Sur la base de nos résultats, nous proposons un modèle de l’activité antivirale du RA (Fig. supplémentaire [ ]). Le RA agit de multiples façons pour inhiber la réplication virale. Le RA se lie aux particules virales pour interférer avec leur attachement aux récepteurs et leur internalisation ; réprime le clivage d’eIF4G ; élimine les ROS et inhibe l’activation de la kinase p38, bloquant la translocation de hnRNP A1 et la phosphorylation d’EPS15.
Des parties aériennes séchées de Melissa officinalis ont été authentifiées et fournies par Lian-Tung Trading Co. (Tihua St, Taipei, Taïwan). Un spécimen de référence (« voucher », CGU-MO-1) a été déposé dans l’herbier de l’Université Chang Gung, Taoyuan, Taïwan.
Sauf indication contraire, tous les produits chimiques ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis). L’acétonitrile (ACN), le méthanol (MeOH, qualité UPLC), l’eau (qualité UPLC), l’acétate d’éthyle (EtOAc, qualité LC-MS CHROMA SLOV), le diméthylsulfoxyde (DMSO, qualité culture cellulaire), le Sephadex LH-20 (taille de particules 25–100 μm), le Diaion HP-20 (taille de particules 250–850 μm), le SB202190, le cristal violet et le RA ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis). Le milieu d’Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), le milieu d’Eagle modifié (MEM), l’OPTI-MEM, la pénicilline (10 000 U/ml) et la streptomycine (10 000 μg/ml) (P/S), la L-glutamine (200 mM), la solution d’acides aminés non essentiels MEM (NEAA), le kit de transcription MEGAscript T7, le kit de synthèse d’ADNc First strand ReverseAid™, MluI, la Lipofectamine 2000, les réactifs CellROX Deep Red, le 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine diacétate (H2DCFDA) et le Hoechst 33342 provenaient de Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, États-Unis). Le sérum de veau fœtal (FBS) a été obtenu auprès de Caisson Laboratories, Inc. (East Smithfield, UT, États-Unis). Le SsoFast EvaGreen supermix a été acheté auprès de Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, États-Unis). L’agarose a été obtenu auprès d’Amresco Inc. (Solon, OH, États-Unis).
Des feuilles et tiges séchées de MO (500 g) ont été extraites avec du MeOH (5 L) à 60 °C pendant 4 heures, à deux reprises. L’extrait brut de MO a été filtré sur papier filtre Waterman No. 1 (GE Healthcare Life Sciences ; Chicago, IL, États-Unis). La fraction liquide a été concentrée à l’aide d’un évaporateur rotatif pour donner un sirop vert foncé nommé MOM (d’un poids de 94,33 g). Le MOM a été dilué dans l’eau et partitionné avec un volume égal d’EtOAc. Les phases eau et EtOAc ont été séparées et concentrées à l’aide d’un évaporateur rotatif pour donner respectivement un concentré brun foncé (MOMW) et une poudre vert foncé (MOME). Le MOMW a été dilué dans l’eau pour les études cellulaires et dans le DMSO pour l’analyse chimique. Le MOME a été dissous dans le DMSO. Le MOMW, le MOME et le solvant DMSO ont été chromatographiés sur une colonne ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 μm, 2,1 × 100 mm, Waters, États-Unis) à l’aide d’un gradient de 5 % ACN à 50 % ACN. Chaque fraction a été soumise à une spectrométrie de masse en tandem à ionisation par électronébulisation (ESI-MS/MS ; HDMS-G1, Waters, États-Unis) en mode ion négatif. Pour la purification des composés biologiquement actifs du MOMW, le sirop a été dilué avec de l’eau. Il a été soumis à une chromatographie sur colonne Diaion HP-20, suivie d’une chromatographie sur colonne Sephadex LH-20. Les éluants étaient l’eau, l’eau/méthanol (1:1, V/V) et le méthanol. L’éluat MOMW-1-1 a été ensuite évaporé pour obtenir un sirop brun clair. L’échantillon a été analysé par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du proton (spectromètre RMN Bruker Avance III-400 ; Bruker Daltonik GmbH, Brême, Allemagne).
Des cellules de rhabdomyosarcome humain (RD ; ATCC CCL-136) ont été maintenues dans du DMEM supplémenté avec 10 % de FBS, 100 unités/ml de pénicilline, 0,1 mg/ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 0,1 mM de NEAA. Les cellules ont été cultivées à 37 °C dans un environnement humidifié à 5 % de CO2. Des cellules épithéliales de rein de singe vert africain (Vero ; ATCC CCL-81) ont été cultivées dans du MEM avec 10 % de FBS, 100 U/ml de pénicilline et 0,1 mg/ml de streptomycine. Trois souches cliniques isolées d’EV71 ont été utilisées. La souche prototype de l’EV71, CA-BrCr-70 (BrCr), appartient au génogroupe A. L’isolat clinique TW-1743-98 (1743) appartient au génogroupe B4, tandis que Tainan/4643/TW (4643) est classé dans le génogroupe C2. Les stocks de virus ont été propagés dans des cellules Vero ou RD comme décrit précédemment. La souche d’EV71 adaptée à la souris, MP4, a été préparée à partir d’un clone infectieux, MP4/y5. Le clone infectieux a été digéré par MluI, et l’ARN viral a été préparé à l’aide du kit de transcription MEGAscript T7 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Les cellules RD ont été ensemencées dans des plaques 6 puits à 4 × 10^5 par puits et incubées une nuit. Trois microgrammes d’ARN viral ont été transfectés dans les cellules RD à l’aide de Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) selon les instructions du fabricant. Les particules virales ont été récoltées à 24 h après l’infection en trois cycles de congélation-décongélation. Le virus MP4 a été propagé une fois de plus dans des cellules RD avant l’étude animale. Le titre du stock viral résultant a été déterminé par test de plages de lyse.
Le titre du virus a été déterminé par tests de plages de lyse avec des cellules Vero ou RD. Le surnageant viral a été dilué en série avec un milieu sans sérum au dixième. Les cellules en monocouche à une confluence de 80 % ont été infectées avec les surnageants viraux dilués, et le titre viral a été quantifié sous forme d’unités formant plage (PFU) par ml, comme décrit précédemment.
Pour le test de réduction des plages de lyse, des cellules RD et Vero en plaques 6 puits ont été respectivement infectées avec 100 et 200 PFU de virus pendant 1 h à 37 °C. Après retrait du virus non absorbé, les cellules ont été recouvertes de 0,3 % d’agarose dans un milieu supplémenté avec 2 % de sérum et une concentration indiquée d’extrait ou de RA. Dans le groupe témoin, les cellules non infectées (« mock ») ont été traitées avec les mêmes concentrations d’échantillons testés. La taille et le nombre des plages ont été déterminés pour évaluer l’activité antivirale de l’extrait ou du RA.
Pour la quantification de l’ARN viral intracellulaire, l’ARN cellulaire total a été extrait des cellules infectées par l’EV71 à l’aide du réactif TRIzol (Thermo Fisher Scientific, États-Unis) selon les instructions du fabricant. La concentration d’ARN cellulaire total a été déterminée par spectrophotomètre (Nanophotometer, Implen, Allemagne). Le nombre relatif de copies de l’EV71 a été quantifié par PCR quantitative avec transcription inverse (qRT-PCR), comme décrit précédemment.
L’EV71 (BrCr) a été dilué à 1 × 10^5 PFU/ml dans 10 ml et incubé avec ou sans 156,25 μg/ml de RA pendant 1 h sur glace. Le milieu contenant le virus non adsorbé a été transféré dans une unité de filtre centrifuge Amicon Ultra avec membrane Ultracel-100 (#UFC910024, Merck Millipore Darmstadt, Allemagne), et le RA a été retiré par centrifugation à 5 000 × g à 4 °C pendant 30 min. Les particules virales dans le rétentat ont été remises en suspension dans 1 ml de DMEM sans sérum. Le titre du virus a été quantifié par test de plages de lyse.
La construction bicistronique pRHF-EV71-5′UTR contient la région 5′UTR de l’EV71 entre les gènes de la luciférase Renilla (Rluc) et de la luciférase de luciole (Fluc), et a été utilisée pour le test de l’activité de l’IRES. L’ADN plasmidique (0,5 µg) a été transfecté dans des cellules RD avec de la Lipofectamine 2000 selon les protocoles du fabricant. Douze heures après la transfection, les cellules ont été non infectées ou infectées avec 6 × 10^6 PFU de virus pendant une heure. Une heure plus tard, du DMEM/2 % FBS supplémenté avec les concentrations finales indiquées de RA a été ajouté à chaque puits. Après 6 h, les lysats cellulaires ont été récoltés et les activités de Rluc et Fluc ont été mesurées avec le système de test rapporteur dual-luciférase (Promega, Madison, États-Unis) et un luminomètre à tube unique GloMax 20/20 (Promega, Madison, États-Unis) selon les instructions du fabricant.
Pour évaluer la translocation de la protéine nucléaire hnRNP A1, nous avons employé la construction pGFP-hnRNP A1, qui code une protéine hnRNP A1 marquée à la protéine fluorescente verte (GFP). Les cellules RD ont été transfectées avec 0,5 µg de plasmide pGFP-hnRNP A1 à l’aide de Lipofectamine 2000. Deux jours plus tard, les cellules ont été infectées ou non avec 6 × 10^6 PFU de BrCr dans un milieu sans sérum à 37 °C pendant 1 h. Après l’adsorption virale, du DMEM contenant 2 % de FBS et 78 ou 156 μg/ml de RA a été ajouté, et les cellules infectées ont été incubées pendant encore 6 h à 37 °C. Les cellules infectées et les cellules traitées à blanc ont été fixées avec 10 % de formol pendant 30 min, et les noyaux cellulaires ont été colorés avec du Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, États-Unis) dans du PBS à température ambiante. Les images de fluorescence ont été obtenues à l’aide de l’IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare Life Sciences, États-Unis). La région du noyau a été définie comme une région de fluorescence bleue. La translocation de hnRNP A1 du noyau vers le cytoplasme est visualisée sous forme d’une augmentation de l’intensité de la fluorescence verte dans le cytoplasme par rapport à celle du noyau. Le pourcentage de cellules montrant une relocalisation de hnRNP A1 a été quantifié à partir de 30 champs aléatoires par puits.
Pour l’étude en microscopie confocale, les cellules RD ont été cultivées dans une boîte de culture à fond de verre de 35 mm revêtue de poly-D-lysine (MatTek Corporation, MA, États-Unis) et traitées comme décrit ci-dessus. Les cellules ont été analysées avec le système Zeiss LSM 780 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Heidelberg, Allemagne), comme décrit précédemment.
Le lysat cellulaire a été séparé par SDS-PAGE et analysé par western blot, comme décrit précédemment. Les anticorps utilisés dans cette étude sont listés dans le Tableau supplémentaire [ ].
Le pouvoir antioxydant du RA a été mesuré comme décrit précédemment. Cette méthode repose sur la capacité de l’antioxydant à réduire le complexe ferrique-tripyridyltriazine en sa forme ferreuse de couleur bleue, qui présente un maximum d’absorption à 593 nm. L’absorbance a été analysée par lecteur ELISA (VersaMax, Molecular Devices LLC, CA, États-Unis).
Pour la détermination de la formation intracellulaire de ROS, les cellules ont été colorées avec des colorants fluorogéniques perméables aux cellules, le réactif CellROX Deep Red ou le H2DCFDA, comme décrit précédemment.
Toutes les méthodes et soins concernant les animaux décrits dans la présente étude ont été réalisés conformément au guide national. Ils ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Chang Gung Memorial Hospital à Linkou (IACUC No. 2012101801).
Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart-type (SD). Les calculs statistiques ont été réalisés avec le logiciel Graphpad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, Californie, États-Unis). Les données ont été analysées par le test t de Student. Une valeur p inférieure à 0,05 est considérée comme significative.
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