Référence : Pharmaceuticals 2025. — PMC11944447 · DOI 10.3390/ph18030366 Type : Article de recherche original (étude expérimentale in vitro) · Plante : Millepertuis perforé · Propriété → Antiviral Accès : ⭐ libre (CC-BY 4.0) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Contexte/Objectifs : Cette étude vise à mieux comprendre l’activité antimicrobienne et antiherpétique d’un extrait de Hypericum perforatum L. (HP) riche en hyperforine, en utilisant des vecteurs lipidiques nanostructurés (nanostructured lipid carriers, NLC) comme plateformes de délivrance. Méthodes : Deux spécimens de NLC déjà établis, composés de béhénate de glycéryle et d’huile d’amande ou d’huile de bourrache, ainsi que leurs équivalents chargés en extrait (HP-NLC), ont été utilisés. Leurs concentrations bactéricides/fongicides minimales (CMB ; CMF) ont été étudiées vis-à-vis d’Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 et Candida albicans ATCC 10231. Le potentiel anti-virus herpès (HSV-1) a été évalué quant à l’activité antivirale et virucide et à l’impact sur l’adsorption virale. Résultats : La nanodispersion chargée en extrait à base d’huile de bourrache (HP-NLC2) a présenté une activité microbicide prononcée vis-à-vis de S. aureus (CMB 6,3 mg/mL), K. pneumoniae (CMB 97,7 µg/mL) et C. albicans (CMF < 48,8 µg/mL), contrairement à l’échantillon contenant l’huile d’amande (HP-NLC1), qui n’a montré qu’une faible inhibition de la croissance fongique. HP-NLC2 s’est révélé moins cytotoxique et a supprimé la réplication du HSV-1 légèrement plus que HP-NLC1, mais globalement les effets ont été faibles. Ni les nanoparticules lipidiques vides ni les vecteurs chargés en extrait HP n’ont exprimé d’activité vis-à-vis d’E. coli, de P. aeruginosa, des virions extracellulaires du HSV-1 ou de l’adhésion virale. Conclusions : On a pu conclure que les deux échantillons HP-NLC n’ont révélé qu’un potentiel antiherpétique mineur de l’extrait riche en hyperforine, mais que HP-NLC2 a démontré une activité antibactérienne et antimycosique significative. Par conséquent, ce dernier a été retenu comme le système vecteur de HP le plus commode pour des formulations pharmaceutiques dermiques nano-conçues. Une investigation aussi approfondie des effets anti-HSV-1 déterminés par l’hyperforine et des propriétés antibactériennes et antimycosiques, la première du genre, contribue aux connaissances fondamentales sur le HP et ouvre de nouvelles perspectives quant à l’utilisation, aux limites et à la désignation thérapeutique de ses composants apolaires.
Le millepertuis (Hypericum perforatum L. ; HP) a une histoire en tant que plante médicinale qui remonte à l’Antiquité. Outre son application bien connue dans les troubles mentaux (dépression, mélancolie, anxiété et hyperexcitation), il a aussi été utilisé pour traiter diverses pathologies cutanées telles qu’hémorragies, infections, inflammations, brûlures, plaies, ecchymoses, etc. L’évolution technologique de la recherche scientifique répond à l’intérêt croissant pour la plante ; de multiples essais biochimiques, pharmacologiques, pharmacocinétiques et cliniques ont été conduits et ont mis en évidence ses propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires, antibactériennes et antivirales, ainsi que les mécanismes qui les sous-tendent. De plus, après une analyse phytochimique détaillée, il a été révélé que plusieurs groupes de composés biologiquement actifs (CBA) du millepertuis contribuent à ces effets, à savoir les phloroglucinols, les naphtodianthrones, les acides phénoliques et depsides, les flavonoïdes et les xanthones.
En ce qui concerne l’activité antibactérienne du HP, les phloroglucinols et les naphtodianthrones se distinguent comme les principaux constituants microbicides ( [ ]). De nombreuses études attestent de l’effet prononcé de la plante vis-à-vis des bactéries à Gram positif. Parmi les représentants les plus sensibles, sont rapportés Staphylococcus aureus (y compris les souches résistantes à la méticilline), Bacillus cereus et Enterococcus faecalis. La plupart des travaux indiquent une absence d’activité des préparations de millepertuis vis-à-vis des bactéries à Gram négatif et des champignons. Toutefois, certains rapports contredisent cette dernière affirmation en signalant des effets antimicrobiens vis-à-vis d’Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans.
Quant aux propriétés antivirales du millepertuis, la substance végétale est rapportée comme efficace vis-à-vis de virus enveloppés — VIH-1, virus de la grippe de type A, virus de la bronchite infectieuse aviaire, SARS-CoV-2, ainsi que d’autres. Fait intéressant, seuls les naphtodianthrones (hypéricine, pseudohypéricine) ont été testés et se sont avérés présenter une activité anti-virus herpès. Leur action est déterminée dans une large mesure par une photoactivation lors de l’exposition à la lumière du jour. Cependant, lorsqu’ils sont activés en présence d’oxygène, les naphtodianthrones deviennent de puissants générateurs d’oxygène singulet, d’anions superoxydes et d’autres espèces réactives de l’oxygène. Ces derniers activent diverses cascades cytotoxiques dans les cellules, dont le résultat ultime est la mort cellulaire. Cet effet est utilisé dans la thérapie dite photodynamique, mais peut se transformer en « défaut » dans d’autres conditions pathologiques cutanées.
Un obstacle majeur à l’application topique des phloroglucinols du HP est leur instabilité chimique intrinsèque. En particulier, le principal phytocomposé de cette classe, l’hyperforine, est photosensible et hautement réactif vis-à-vis de l’oxygène. Une approche efficace pour préserver de tels CBA labiles est leur incorporation dans des systèmes de délivrance de médicaments à l’échelle nanométrique. Parmi les premiers ainsi créés figuraient les nanoparticules polymères et métalliques, les liposomes et les nanoémulsions. Au début des années 1990, les équipes de Müller et de Gasco ont été les pionnières de l’idée des nanoparticules lipidiques solides (solid lipid nanoparticles, SLN). Les SLN se présentent comme une alternative plus sûre et non toxique aux autres types de nanoparticules. De plus, elles sont physiquement plus stables que les liposomes et, en outre, leur production est plus économique. Les SLN possèdent un cœur lipidique solide entouré d’une couche de tensioactif stabilisante. Leurs principaux avantages en tant que vecteurs de médicaments sont la biocompatibilité, la biodégradabilité, l’absence de toxicité et la possibilité d’une libération modifiée du médicament. Leurs principaux inconvénients, à savoir une faible capacité de charge en médicament et une libération rapide de celui-ci, sont liés à leur matrice lipidique cristalline hautement organisée. Pour surmonter les inconvénients susmentionnés des SLN, les vecteurs lipidiques nanostructurés (NLC) ont ensuite été introduits. Contrairement aux SLN, leur stabilité est accrue, et leur capacité de charge en médicament est également bien plus élevée. La supériorité des NLC sur les SLN est déterminée par les lipides liquides inclus dans le cœur des premiers.
Notre travail précédent visait à obtenir un extrait de millepertuis riche en hyperforine et à l’incorporer dans un système NLC approprié en vue d’une application topique dans la cicatrisation des plaies. À notre connaissance, notre étude sur l’isolement et la « préservation » d’un tel extrait par une approche fondée sur un nanovecteur lipidique est la première du genre. Le travail présenté ici sur l’activité antimicrobienne des nanovecteurs en question est également sui generis. Nous avons déjà démontré les propriétés cicatrisantes des HP-NLC. Ici, nous visons à souligner davantage leur importance thérapeutique en étudiant leur effet vis-à-vis des pathogènes « classiques » responsables des infections de plaies — S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa et C. albicans. Nous pensons aussi que la préservation du principal phloroglucinol de l’extrait par nanoencapsulation nous permettrait d’obtenir des éclairages sur son potentiel anti-virus herpès.
Toutes les données concernant l’extraction du HP, la formulation des NLC et leur caractérisation ont déjà été publiées ailleurs. Nous résumons ici certaines des observations essentielles qui pourraient être reliées aux résultats actuels.
La concentration d’hyperforine dans les extraits de HP a été trouvée égale à 8,9 µg/mL, soit un rendement d’extraction de 44,35 % ; sachant cela, c’est la teneur en hyperforine, et non la teneur totale de l’extrait de HP, qui a été utilisée pour le calcul de l’efficacité d’encapsulation (EE). L’extrait de HP a été incorporé dans les NLC à une concentration de 1,25 % (p/p), car selon l’étude ATR-FTIR (réflexion totale atténuée), des quantités plus élevées conduisaient à la formation de co-agrégats extrait–nanoparticule. Les nanodispersions « vides » (NLC1 et NLC2) se présentaient sous la forme de liquides blanc laiteux, tandis que celles chargées en HP (HP-NLC1 et HP-NLC2) héritaient de la teinte verte de l’extrait ( [ ]A). L’analyse par diffusion dynamique de la lumière (DLS) a révélé une taille hydrodynamique moyenne initiale d’environ 150 nm ( [ ]B). L’EE (%), dérivée du rapport entre l’hyperforine théoriquement chargée et l’hyperforine réellement détectée par HPLC, se situait dans l’intervalle 70,44–74,49 % ( [ ]C). Ensuite, la microscopie électronique en transmission (TEM) a mis en évidence la forme irrégulière des particules et leurs cœur et coquille bien définis. En présence de l’extrait végétal, la structure en bicouche des nanoparticules paraissait plus amorphe, mais l’encapsulation n’a pas affecté l’organisation ni l’intégrité de leur matrice ( [ ]D). À l’exception de HP-NLC1, les nanovecteurs ont conservé un diamètre moyen de particule inférieur à 200 nm pendant un mois de stockage à 4 °C ( [ ]B). Les nanoplateformes chargées en extrait à base d’huile d’amande ont également montré une détérioration significative de l’homogénéité, exprimée par l’indice de polydispersité le plus élevé ( [ ]B). De plus, leur capacité à encapsuler et à préserver l’extrait de HP était également inférieure à celle de HP-NLC2. Cependant, dans la recherche d’un meilleur choix pour le vecteur de HP le plus adapté, malgré les propriétés physicochimiques manifestement avantageuses du spécimen HP-NLC à base de bourrache jusqu’à présent, nous avons décidé de soumettre les deux échantillons aux tests antimicrobiens et antiviraux.
Avant de mener les expériences antivirales, nous avons établi l’intervalle non toxique des échantillons étudiés afin d’exclure un effet toxique sur les cellules. NLC1 et NLC2 n’ont montré aucune toxicité, même à la plus forte concentration testée. Les nanoparticules porteuses de l’extrait actif ont montré une cytotoxicité proche de celle de l’aciclovir de référence {[9-(2-hydroxyéthoxyméthyl)-guanine] ; ACV}, mais légèrement plus forte — de l’ordre de 2,5 à 3 fois plus toxique. HP-NLC2 a démontré une cytotoxicité plus faible vis-à-vis des cellules rénales bovines Madin–Darby (MDBK) que HP-NLC1 ( [ ]).
L’activité anti-virus herpès des nanovecteurs étudiés a été déterminée dans l’intervalle de concentration non toxique défini. Les deux spécimens « vides » n’ont montré aucun effet sur la réplication du virus herpès simplex humain de type 1 (HSV-1). Les deux échantillons chargés en extrait ont démontré un faible effet sur la réplication virale du HSV-1, avec un indice de sélectivité (SI) ≤ 4. Cependant, un effet plus marqué a été établi pour HP-NLC2, avec SI = 4,0 ( [ ]).
Les NLC « vides » et chargés ont également été examinés quant à leur impact sur les virions extracellulaires du HSV-1. L’effet a été suivi à différents intervalles de temps sur 120 min. À tous les intervalles de temps étudiés, aucun des échantillons n’a induit de baisse significative du titre viral ( [ ]), ce qui indique qu’ils agissent uniquement comme des vecteurs qui ne libèrent pas l’extrait à l’extérieur de la cellule.
Les résultats obtenus jusqu’ici montrent que l’effet des HP-NLC ne survient qu’à l’intérieur de la cellule, mais nous avons décidé de vérifier la possibilité qu’ils aient un effet sur l’étape d’adsorption du virus en influençant la membrane cellulaire et la liaison des récepteurs cellulaires aux structures virales responsables de l’attachement du virus à la cellule. Des intervalles de temps de durée différente au sein de l’adsorption virale (60 min) ont été étudiés. Aucun des échantillons n’a montré d’effet sur cette étape, à aucun des intervalles de temps examinés ( [ ]). C’est une preuve supplémentaire que les nanovecteurs étudiés exercent leur effet uniquement à l’intérieur de la cellule.
Au cours de cette étude, tous les tubes à essai ont acquis l’aspect blanc cassé opaque inhérent aux suspensions NLC/HP-NLC ; par conséquent, la détermination des concentrations minimales inhibitrices par évaluation visuelle de la turbidité liée à la croissance microbienne n’a pas été possible. À l’étape suivante, les concentrations bactéricides/fongicides minimales (CMB ; CMF) ont été relevées après transfert sur gélose au sang et une nouvelle incubation. Les NLC eux-mêmes (ou leurs composants au sein de la composition) ne se sont pas révélés posséder d’activité vis-à-vis des micro-organismes pathogènes ciblés ( [ ]). L’agent antimicrobien témoin, le diacétate de chlorhexidine, a montré des CMB de 35,3 µg/mL (S. aureus), 141,2 µg/mL (E. coli), 564,8 µg/mL (K. pneumoniae), 1130,0 µg/mL (C. albicans) et 2260,0 µg/mL (P. aeruginosa).
HP-NLC2 a démontré un effet microbicide net vis-à-vis de K. pneumoniae et C. albicans, avec des CMB/CMF de 97,7 µg/mL (dilution 1:128) et < 48,8 µg/mL (dilution 1:256), respectivement. Une activité plus faible mais toujours présente de la nanosuspension en question a été relevée vis-à-vis de S. aureus, avec une CMB de 6,3 mg/mL (dilution 1:2) ( [ ]). Aucune activité antimicrobienne n’a été établie pour les nanoparticules chargées en extrait vis-à-vis des Gram négatif E. coli et P. aeruginosa.
Les résultats ainsi obtenus attestent que l’action antimicrobienne et anti-virus herpès établie des HP-NLC est due à l’extrait riche en hyperforine et non aux nanoplateformes de délivrance employées. Cependant, en raison de l’extrême instabilité chimique du composé principal, la formulation de l’extrait dans les particules lipidiques nanométriques pourrait être considérée comme une condition nécessaire à la manifestation de l’activité. Cette observation ne fait que souligner l’importance pratique de la présente étude et des résultats obtenus. De plus, elle explique la raison pour laquelle un extrait standard riche en hyperforine ne peut pas être utilisé comme formulation de référence.
Un système nanovecteur idéal devrait offrir une endurance physique dans le temps, une capacité de charge élevée, une inertie chimique, la stabilité ou la stabilisation du médicament, l’absence de toxicité, la biocompatibilité, ainsi qu’une perméation et une libération opportunes du médicament. Selon nos résultats antérieurs et actuels, la formulation HP-NLC2 remplit tous ces critères et contribue également à une potentialisation explicite des activités antibactérienne et antimycosique vis-à-vis de K. pneumoniae, S. aureus et C. albicans. Une explication raisonnable de ce phénomène pourrait être recherchée dans la présence d’huile de bourrache comme lipide liquide dans la composition des nanovecteurs. Plusieurs rapports scientifiques ont confirmé son action antimicrobienne, ainsi que celle de ses principaux acides gras polyinsaturés, à savoir les acides linoléique et γ-linolénique, y compris vis-à-vis des pathogènes étudiés ici. Il est probable que la teneur relative en huile de bourrache dans les nanoparticules lipidiques était inférieure à ses concentrations minimales inhibitrices, et c’est pour cette raison que nous n’avons pas observé son propre effet antimicrobien en appliquant l’échantillon NLC2 « vide ». Nous émettons l’hypothèse que les propriétés promotrices de perméation de l’huile pourraient aussi avoir renforcé l’activité de l’extrait de HP en facilitant son passage intracellulaire à travers les parois bactériennes.
Les résultats relatifs à un éventuel mécanisme d’action préférentiel de l’extrait riche en hyperforine vis-à-vis des pathogènes à Gram positif ou à Gram négatif restent non concluants. Il est évident qu’aux côtés de C. albicans, le Gram négatif K. pneumoniae se distingue comme le plus sensible à l’action de l’extrait, tandis que le Gram positif S. aureus n’est affecté qu’à des doses bien plus élevées. Néanmoins, les autres représentants à Gram négatif de cette étude, E. coli et P. aeruginosa, ont démontré une résistance à l’action de l’extrait aux doses appliquées. Une faible sensibilité aux agents antimicrobiens est propre à P. aeruginosa. Son résistome riche, ses multiples systèmes d’efflux et sa capacité à former des biofilms contribuent à sa grande résistance. En outre, les lipopolysaccharides et les protéines porines de sa membrane externe sont distincts de ceux de la famille des Enterobacteriaceae, ce qui assure également sa perméabilité bien plus faible aux substances exogènes.
Il existe de nombreux solvants et techniques d’extraction qui pourraient être appliqués pour la production d’extraits de millepertuis, et ils aboutissent tous à une teneur qualitative et quantitative en CBA très différenciée. À moins que les préparations à base de plantes ne soient traditionnelles ou standardisées, leurs effets établis sont difficiles à relier à d’autres données de la littérature scientifique. À cet égard, la directive 2004/24/CE du Parlement européen et du Conseil fournit une liste de plusieurs préparations traditionnelles de HP. Celles-ci comprennent l’extrait sec obtenu avec le solvant d’extraction éthanol 45 % (v/v), qui contient de l’hypéricine à environ 0,3–0,7 % et de l’hyperforine entre 0,3 et 1,6 % ; l’extrait liquide obtenu avec le solvant d’extraction huile de maïs dans un rapport plante–extractant (DER) de 1:13, avec une teneur approximative en hypéricine de 0,0013 % et en hyperforine de 0,01 % ; l’extrait liquide obtenu avec le solvant d’extraction constitué d’autres huiles végétales (DER 1:4–20), dans lequel l’hypéricine est d’au moins 0,005 % ; et enfin les teintures éthanoliques à 45–50 % (v/v) (DER 1:5 ou 1:10), l’extrait éthanolique à 50 % (v/v) (DER 1:2), le suc exprimé de la plante fraîche, la substance végétale fragmentée pour infusion en tisane et la substance en poudre pour formes solides. D’autre part, la Pharmacopée européenne (Ph. Eur.) prévoit la production d’un extrait sec quantifié de millepertuis à partir de la substance végétale en utilisant de l’éthanol (50–80 %, v/v) ou du méthanol (50–80 %, v/v), avec une teneur totale en hypéricines, exprimée en hypéricine, dans l’intervalle 0,10–0,30 % ; en flavonoïdes, exprimée en rutine, minimum 6,0 % ; et en hyperforine, maximum 6,0 %. La substance végétale est définie comme les sommités fleuries entières ou fragmentées et séchées de HP, avec une teneur totale minimale en hypéricines, exprimée en hypéricine, de 0,08 %. Comme le dérivé de phloroglucinol qu’est l’hyperforine est lipophile, il est mieux extrait par des extractants apolaires tels que le CO_2 supercritique, l’acétate d’éthyle, l’éther de pétrole, le n-hexane, le dichlorométhane et le n-heptane. En effet, le rendement de production le plus élevé d’hyperforine est atteint à l’aide de l’extraction au CO_2 supercritique ; c’est pourquoi cette méthode est désormais aussi établie commercialement. Compte tenu de tout ce qui précède, nous avons relié les résultats de cette étude à des rapports fournissant une preuve analytique de la teneur en hyperforine comme principal CBA de l’extrait, ou du moins utilisant des solvants capables d’extraire le phloroglucinol.
Drozdov et al. ont rapporté l’absence d’activité antibactérienne d’un extrait supercritique de millepertuis vis-à-vis des bactéries et des champignons. Fait intéressant, les auteurs ont isolé l’hyperforine pure de l’extrait et ont démontré son effet antimicrobien vis-à-vis de P. aeruginosa. Naeem et al. ont établi une efficacité équivalente des extraits de millepertuis au n-butanol et à l’acétate d’éthyle vis-à-vis des bactéries à Gram positif et à Gram négatif (Bacillus subtilis, Sarcina lutea, P. aeruginosa et E. coli), mais n’ont observé aucune activité antibactérienne des extraits obtenus au n-hexane et au dichlorométhane. Schempp et al., de leur côté, ont prouvé que l’hyperforine n’était active que vis-à-vis des bactéries à Gram positif, à savoir S. aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae et Corynebacterium diphteriae. Des résultats similaires ont été obtenus par Avato et al., qui ont trouvé que l’hyperforine et un extrait de millepertuis à l’acétate d’éthyle contenant de l’hyperforine étaient efficaces vis-à-vis de différentes souches de S. aureus, ainsi que vis-à-vis de B. cereus, Bacillus subtilis et E. faecalis, mais inefficaces vis-à-vis des bactéries à Gram négatif et des champignons. Malgré la relative controverse de ces résultats, il faut reconnaître que les extraits étudiés étaient de compositions chimiques différentes et ont été appliqués à des doses différentes. Plus important encore, aucun des rapports ci-dessus n’a utilisé de système de nano-délivrance pour les préparations végétales contenant de l’hyperforine, et aucun n’a non plus suivi la stabilité du phloroglucinol. Quant à l’activité antiherpétique du HP, seuls les naphtodianthrones de la plante, à savoir les hypéricines, ont été rapportés jusqu’à présent comme en possédant une ; nous en sommes donc venus à conclure que la présente étude constitue une première investigation approfondie de la puissance de l’extrait de HP riche en hyperforine vis-à-vis du HSV-1.
Tous les matériaux utilisés dans l’étude étaient de qualité pharmaceutique. Les fleurs, feuilles et pousses de millepertuis séchées à l’air et broyées ont été fournies par la société Bilec, Troyan, Bulgarie ; le chlorure de méthylène anhydre ≥ 99,7 % et le monooléate de sorbitane ont été fournis par Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis ; l’eau bidistillée a été obtenue en conditions de laboratoire (Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel, Allemagne) ; l’huile d’amande et l’huile de bourrache ont été achetées auprès d’Alteya Organics, Stara Zagora, Bulgarie ; le monooléate de polyoxyéthylène (20) sorbitane a été fourni par Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis. Le béhénate de glycéryle (Compritol^® ATO 888) a été un don aimable de Gattefossé, Saint-Priest, France.
La procédure d’extraction pour la préparation de l’extrait de HP riche en hyperforine a été récemment établie. L’extrait a été obtenu en appliquant une méthode de macération dans des conditions compatibles avec la haute réactivité de l’hyperforine. L’extraction a été réalisée dans des flacons en verre ambré sous atmosphère d’argon et à l’obscurité. Le chlorure de méthylène anhydre a été employé comme extractant, et le rapport matériel végétal/solvant a été fixé à 30:100 (p/v). L’extrait obtenu après séparation du résidu végétal, filtration et élimination du solvant organique a été dissous dans du méthanol anhydre (jusqu’à une concentration de 20,0 µg/mL) et soumis à une analyse HPLC-UV. La présence d’hyperforine a été déterminée par le temps de rétention rapporté à l’aide d’un étalon d’hyperforine, et sa concentration dans l’extrait isolé a été déterminée par la méthode de calibration absolue.
Les vecteurs optimaux pour l’extrait ainsi obtenu ont été identifiés sur la base d’une caractérisation physicochimique approfondie de vingt spécimens potentiels par DLS, électrophorèse Doppler laser, détermination de l’EE, spectroscopie ATR-FTIR, analyse par diffraction des rayons X et TEM. Les échantillons actuellement étiquetés NLC1 et NLC2 ont été reconnus comme les « meilleurs candidats » pour la désignation des particules. Ici, un total de quatre spécimens (deux « vides », à savoir NLC1 et NLC2, et les échantillons correspondants chargés en extrait de millepertuis riche en hyperforine, c’est-à-dire HP-NLC1 et HP-NLC2) ont été obtenus comme décrit précédemment. Ils comprenaient tous une phase lipidique à 10 % (p/p) avec un rapport béhénate de glycéryle/huile d’amande (NLC1 et HP-NLC1) ou béhénate de glycéryle/huile de bourrache (NLC2 et HP-NLC2) de 7:3. Le mélange de tensioactifs employé (5 % p/p) pour leur préparation était dans un rapport monooléate de polyoxyéthylène (20) sorbitane/monooléate de sorbitane de 3:2. Les nanodispersions « vides » ont été développées comme suit : la phase aqueuse (eau bidistillée et monooléate de polyoxyéthylène (20) sorbitane) a été chauffée à 80 ± 2 °C et ajoutée goutte à goutte à la phase lipidique (un mélange de béhénate de glycéryle, d’huile d’amande ou de bourrache, et de monooléate de sorbitane), préalablement chauffée à la même température, sous agitation continue à une vitesse de 750 tr/min pendant 3 min. La macroémulsion résultante a été homogénéisée pendant 3 min à 10 000 tr/min, puis soumise aux ultrasons pendant 15 min à 25 °C. Les échantillons chargés en extrait de millepertuis riche en hyperforine ont été préparés en incorporant l’extrait (1,25 % p/p) dans la phase lipidique avant l’émulsification, en conditions d’obscurité.
Des souches de référence d’Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 et Candida albicans ATCC 10231 ont été fournies sous forme de MicroSwabs^® par Ridacom, Bulgarie. Les souches microbiennes ont été activées selon les instructions du fabricant, en les ensemençant d’abord sur gélose au sang (HiMedia, fournie par Ridacom, Bulgarie). Avant de préparer l’inoculum bactérien, chaque souche bactérienne a été cultivée pendant 24 h dans un bouillon d’infusion cœur-cervelle (Brain Heart Infusion, HiMedia, fourni par Ridacom, Bulgarie) puis réensemencée sur milieu gélosé. Des colonies isolées ont été transférées dans une solution de chlorure de sodium afin d’obtenir une suspension dont la turbidité correspondait à l’étalon 0,5 McFarland (Grant Bio DEN-1, Grant Instruments, Cambridge, Royaume-Uni).
Les cellules MDBK ont été fournies par la Banque nationale de micro-organismes industriels et de cultures cellulaires de Sofia, Bulgarie. Elles ont été cultivées en milieu DMEM (Gibco, Grand Island, NY, États-Unis) supplémenté avec 10 % de FCS (Gibco BRL, Paisley, Écosse, Royaume-Uni), 10 mM de tampon HEPES (AppliChem GmbH, Darmstadt, Allemagne) et des antibiotiques (100 UI/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Allemagne) à 37 °C et sous atmosphère à 5 % de CO_2 (Radobio Scientific Co., Ltd., Shanghai, Chine).
La souche Victoria du HSV-1 a été obtenue auprès du Centre national des maladies infectieuses et parasitaires (Sofia, Bulgarie) et a été propagée dans une monocouche confluente de cellules MDBK en DMEM (Gibco BRL, Paisley, Écosse, Royaume-Uni) avec 0,5 % de sérum de veau fœtal (Gibco BRL, Écosse, Royaume-Uni) et un mélange d’antibiotiques ajouté. Après incubation à 37 °C et 5 % de CO_2, le stock viral a été collecté, aliquoté et conservé à −80 °C. Le titre infectieux a été déterminé à 10^8,5 CCID_50/mL.
L’ACV a été aimablement fourni par le Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, sous forme d’une solution mère à 3,0 mg/mL dans le DMSO, qui a été diluée dans le milieu de maintien DMEM jusqu’à la concentration requise.
Des monocouches confluentes de cellules MDBK cultivées en plaques 96 puits (Costar^®, Corning Inc., Kennebunk, ME, États-Unis) ont été traitées avec 0,1 mL/puits des échantillons de test (NLC « vides » et chargés en extrait riche en HP), dilués au dixième dans le milieu de maintien DMEM, puis placées à 37 °C et 5 % de CO_2 pendant 48 h. Après évaluation microscopique, l’échantillon de test a été retiré et son influence sur la viabilité de la monocouche cellulaire a été déterminée par le test d’absorption du rouge neutre (Neutral Red Uptake Assay, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Allemagne), comme décrit précédemment, et lue par spectrophotométrie. La concentration cytotoxique à 50 % (CC_50) a été estimée pour les spécimens chargés en HP comme la dose d’extrait réduisant de 50 % la survie cellulaire par rapport aux cellules non traitées. Chaque échantillon a été testé en triplicat, avec quatre puits par échantillon de test. La concentration maximale tolérable (MTC) de l’extrait de HP riche en hyperforine dans chaque spécimen NLC était la concentration la plus élevée (dilution la plus faible) à laquelle la monocouche cellulaire n’était pas affectée et où l’aspect des cellules traitées était similaire à celui des cellules du témoin non traité.
Après que les cellules MDBK ont atteint la confluence en plaques 96 puits, elles ont été infectées avec 0,1 mL de suspension virale à des dilutions décroissantes au dixième. Au bout d’une heure, le virus non adsorbé a été éliminé et 0,1 mL/puits de milieu DMEM a été ajouté aux cellules. Les plaques ont été incubées à 37 °C et 5 % de CO_2 dans un incubateur à CO_2 (Radobio Scientific Co., Ltd., Shanghai, Chine) pendant 48 h. Le titre viral infectieux a été déterminé par observation microscopique de la monocouche cellulaire et détermination de l’effet cytopathique (ECP). L’ECP déterminé visuellement a été confirmé par le test d’absorption du rouge neutre comme décrit dans la section précédente. Les titres viraux sont exprimés en lg IU (unités infectieuses) (CCID_50)/mL.
Des cellules MDBK confluentes en plaques 96 puits ont été inoculées avec une dose infectieuse de culture cellulaire à 50 % de 100 cellules (CCID_50) dans 0,1 mL. Après 60 min d’adsorption virale sur les cellules hôtes, le virus non adsorbé a été retiré et l’échantillon de test a été ajouté selon un pas de dilution au dixième. Les cellules ont été incubées pendant 48 h à 37 °C et 5 % de CO_2. L’ECP a été déterminé par le test d’absorption du rouge neutre, et le pourcentage d’inhibition de l’ECP pour chaque concentration de l’échantillon de test a été calculé selon un protocole de calcul établi. La concentration à laquelle 50 % de l’effet cytopathique était inhibé par rapport au témoin fictif (mock) a été définie comme la concentration inhibitrice à 50 % (IC_50). À partir des valeurs d’IC_50 et de toxicité CC_50 ainsi déterminées, le SI de l’extrait de HP dans chaque échantillon NLC chargé a été déterminé à l’aide du rapport CC_50/IC_50.
Des échantillons contenant du virus (10^5 CCID_50) et l’échantillon de test à sa MTC ont été mélangés dans un rapport 1:1, puis conservés à 20 °C pendant des intervalles de 15, 30, 60, 90 et 120 min. La teneur résiduelle en virus infectieux de chaque échantillon a ensuite été déterminée par titrage, et la réduction du titre viral dans les échantillons contenant les produits de test par rapport au témoin viral non traité a été évaluée en déterminant la différence de titres viraux ∆lg (delta log).
Des monocouches de culture de cellules MDBK en plaques 24 puits ont été pré-refroidies à 4 °C et inoculées simultanément avec 10^4 CCID_50 de HSV-1 et la MTC de l’échantillon de test. Cela a été suivi d’une incubation à 4 °C pendant la durée de l’adsorption du virus. À différents intervalles de temps (15, 30, 45 et 60 min), les cellules ont été lavées au PBS pour éliminer à la fois les composants de test et le virus non attaché, puis recouvertes de milieu de maintien et incubées à 37 °C pendant 24 h. Une triple congélation-décongélation des échantillons obtenus a été suivie d’une estimation du titre de virus infectieux de chaque échantillon par une méthode de dilution au point final. Le ∆lg a été calculé sur la base des différences de titres viraux par rapport au témoin viral (non traité par les produits). Chaque échantillon a été préparé en quadruplicat.
Les activités antibactérienne et antifongique des échantillons NLC, « vides » et chargés en extrait riche en HP, ont été testées vis-à-vis d’E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae et C. albicans. La concentration initiale d’extrait dans les échantillons chargés (HP-NLC1 et HP-NLC2) était de 12,5 mg/mL. Une dilution sérielle au facteur 2 des échantillons a été réalisée dans des tubes stériles contenant 1,0 mL de bouillon Mueller–Hinton, jusqu’à une dilution 1:256 des solutions mères. Les flacons ont ensuite été inoculés avec 0,1 mL de suspension microbienne standardisée à l’équivalent de turbidité 0,5 McFarland, correspondant à une densité de comptage cellulaire d’environ 1,5 × 10^8 UFC/mL. Les échantillons de contrôle positif ont été constitués en combinant 0,1 mL de chaque suspension microbienne avec 1,0 mL de bouillon Mueller–Hinton ; des mélanges non inoculés des échantillons de test avec le bouillon Mueller–Hinton dans un rapport 1:1 ont été laissés comme témoins négatifs. La sensibilité antimicrobienne de toutes les souches a été évaluée en utilisant le diacétate de chlorhexidine comme inhibiteur témoin. Toutes les expériences ont été répétées en triplicat. Les flacons de test contaminés par les souches bactériennes ont été incubés pendant 24 h à 37 °C, et ceux contaminés par C. albicans pendant 48 h à 35 °C. Les CMB et CMF ont été déterminées en transférant toutes les suspensions de test, à raison du volume d’une seule anse bactériologique, sur gélose au sang. Les spécimens ainsi obtenus ont été incubés de nouveau dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. La concentration la plus faible à laquelle la croissance bactérienne/fongique paraissait inhibée à ≥ 99,9 % a été rapportée comme CMB/CMF.
Les valeurs de CC_50 ont été calculées par analyse de régression non linéaire (logiciel GraphPad 4, San Diego, CA, États-Unis). Les valeurs ont été présentées comme des moyennes ± SD à partir de trois expériences indépendantes. La signification de la différence entre les valeurs de cytotoxicité des échantillons et de la substance de référence ACV, ainsi qu’entre les effets des produits de test sur la réplication virale, a été évaluée par le test t de Student, où des valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme significatives.
Dans notre étude, nous avons examiné les propriétés anti-virus herpès et antimicrobiennes d’un extrait de millepertuis riche en hyperforine incorporé dans des NLC. Nous avons rapporté une légère activité vis-à-vis du HSV-1, qui portait sur la réplication virale mais n’affectait ni les virions extracellulaires ni l’adsorption virale. En comparant les effets des NLC chargés et « vides », nous avons également prouvé que cette dernière était due à l’extrait. Les propriétés antimicrobiennes des HP-NLC ont aussi été évaluées comme étant présentes du fait de l’extrait lui-même. Une activité plus prononcée a été exhibée par HP-NLC2. Ce dernier était hautement efficace vis-à-vis de K. pneumoniae et C. albicans, tandis que son activité vis-à-vis de S. aureus se manifestait à des concentrations d’extrait bien plus élevées. En considérant l’ensemble des résultats obtenus, nous pouvons conclure que HP-NLC2 sert de nanovecteur plus efficace pour l’extrait de millepertuis riche en hyperforine.
Encart — effet antimicrobien & antiherpétique (HSV), rôle de la nanoencapsulation, composés, niveau de preuve
Étude expérimentale in vitro (bulgare, la première du genre selon les auteurs). Elle teste un extrait de millepertuis riche en hyperforine (un phloroglucinol lipophile et très instable), encapsulé dans des nanovecteurs lipidiques (NLC) à base de béhénate de glycéryle et d’huile d’amande (HP-NLC1) ou d’huile de bourrache (HP-NLC2). L’encapsulation est présentée comme une condition nécessaire pour que l’hyperforine, chimiquement labile, puisse agir.
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