Référence : Jeon D. et al., Nutrients 2018;10(7):951. — PMC6073547 · DOI 10.3390/nu10070951 Plante : Pissenlit officinal · Type : étude expérimentale in vitro (cellules neuronales HT22) Accès : ⭐ libre (open access, licence Creative Commons) → texte intégral traduit ci-dessous.
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Les lésions neuronales médiées par le stress oxydatif sont considérées comme un contributeur important à la pathogenèse et au développement des maladies neurodégénératives. Taraxacum officinale a été rapporté comme possédant des activités antioxydantes. Cependant, sa capacité à protéger les neurones contre les dommages oxydatifs et les mécanismes moléculaires sous-jacents n’ont pas été entièrement déterminés. Dans la présente étude, nous avons examiné les effets neuroprotecteurs des extraits éthanoliques de cette plante (ETOW) sur le stress oxydatif induit par le glutamate dans les cellules HT22. Les tests de viabilité cellulaire et d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ont tous deux montré que l’ETOW atténuait efficacement la cytotoxicité et la génération de ROS induites par le glutamate. De plus, nos résultats ont révélé que l’ETOW augmentait l’expression de l’hème oxygénase-1 (HO-1) et favorisait la translocation nucléaire du facteur nucléaire érythroïde 2-apparenté au facteur 2 (Nrf2). Les effets inhibiteurs de l’ETOW sur la toxicité cellulaire et la production de ROS stimulées par le glutamate ont été partiellement inversés par la protoporphyrine d’étain (SnPP), un inhibiteur de l’activité HO. Pris ensemble, ces résultats démontrent que l’ETOW peut protéger les cellules HT22 contre les dommages oxydatifs induits par le glutamate en induisant les voies Nrf2/HO-1. Notre étude appuie l’idée que Taraxacum officinale Wigg. est un agent prometteur pour la prévention des maladies neurodégénératives.
Le stress oxydatif (SO), une condition métabolique pathologique résultant d’un déséquilibre entre la génération et l’élimination des espèces réactives actives de l’oxygène (ROS) et des espèces réactives de l’azote (RNS), peut induire des dommages cellulaires significatifs […]. Le système nerveux central (SNC), avec sa teneur élevée en acides gras polyinsaturés, sa forte consommation d’oxygène et ses faibles systèmes antioxydants, est particulièrement vulnérable au SO, qui provoque des troubles neurodégénératifs […]. Les maladies neurodégénératives, dont la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie de Huntington (MH) et l’ataxie de Friedreich (AF), provoquent démence, troubles du mouvement ou troubles moteurs […]. Plusieurs éléments de preuve issus des résultats d’études cliniques et précliniques ont suggéré la présence de niveaux élevés de biomarqueurs du SO et d’altérations des défenses antioxydantes dans le cerveau et les tissus périphériques dans les maladies neurodégénératives […]. Par conséquent, le SO pourrait constituer une cible thérapeutique potentielle, et les efforts thérapeutiques ont visé à réduire les ROS et à renforcer les défenses antioxydantes pour prévenir ou atténuer les maladies neurodégénératives.
Les tissus neuronaux sont dotés dès la naissance d’une panoplie d’enzymes antioxydantes qui travaillent de concert avec des piégeurs de radicaux libres de faible poids moléculaire pour réduire les dommages cellulaires causés par le SO […]. Déduites d’études in vitro et in vivo, les hème oxygénases (HO) ont été reconnues comme des capteurs dynamiques du SO cellulaire et probablement des arbitres de l’homéostasie redox tissulaire […]. La HO-1 est extrêmement sensible à l’induction par le SO comparée aux autres protéines HO. La HO-1 réside dans le réticulum endoplasmique (RE), où elle fonctionne de concert avec la NADPH cytochrome P450 réductase pour oxyder l’hème pro-oxydant en fer ferreux libre, en monoxyde de carbone (CO) et en pigments biliaires piégeurs de radicaux, tels que la biliverdine (BV) et la bilirubine, afin d’assurer une cytoprotection […]. Des rapports antérieurs ont indiqué que la HO-1 a une action neuroprotectrice […]. Ces études suggèrent que les agents qui induisent l’expression de la HO-1 peuvent être utilisés pour protéger les cellules cérébrales contre les conditions oxydatives et neurodégénératives.
Un certain nombre de phytomédicaments se sont révélés être des piégeurs efficaces de radicaux libres, capables de réduire les ROS et bénéfiques pour les maladies neurodégénératives. La recherche actuelle a exploré les médecines indigènes pour faire revivre les cellules des lésions médiées par l’oxydation […]. Le genre Taraxacum, largement distribué dans les zones tempérées chaudes de l’hémisphère Nord, appartient à la famille des Astéracées, sous-famille des Cichorioideae, tribu des Lactuceae […]. L’espèce Taraxacum officinale, communément appelée « dandelion » (pissenlit) — mot qui provient du français « dent de lion » […] — est une herbe populaire comestible […] ; traditionnellement, elle a été utilisée en phytothérapie pour traiter divers troubles tels que l’hépatite, la cirrhose, les troubles de la vésicule biliaire, les troubles digestifs et les maladies rhumatismales […]. Et il est rapporté que Taraxacum officinale présente également plusieurs activités biologiques, notamment anti-cancéreuse, hépatoprotectrice, anti-inflammatoire, anti-obésité et antidépressive […]. Les feuilles, les fleurs et les racines de T. officinale (TO) sont souvent consommées fraîches ou cuites dans des salades, des sandwichs et des en-cas, et sont aussi utilisées pour faire du miel, du jus, des substituts de café, des vins et d’autres boissons […]. L’extrait brut de TO s’est montré posséder des propriétés antioxydantes dans des études in vitro et in vivo […]. Chi-Su Yoon et ses collègues ont rapporté que Taraxacum coreanum Nakai protège contre la neuro-cytotoxicité induite par le glutamate dans les cellules HT22 […]. Cependant, il n’y a eu aucune étude concernant les effets de l’extrait de TO sur les troubles neurodégénératifs induits par le glutamate. Dans cette étude, nous avons entrepris d’étudier l’effet neuroprotecteur des extraits éthanoliques de Taraxacum officinale Wigg. (ETOW) et le mécanisme sous-jacent par lequel l’ETOW protège contre la neurotoxicité médiée par le glutamate.
L’éthanol (EtOH), l’acide formique et le méthanol (MeOH) ont été achetés chez Merck Co. (Darmstadt, Allemagne). Le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), le sérum de veau fœtal (SVF) et les autres réactifs de culture tissulaire ont été achetés chez Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, États-Unis). La protoporphyrine de cobalt (CoPP), inducteur de HO-1, et la protoporphyrine d’étain (SnPP) ont été obtenues chez Porphyrin Products. Tous les autres produits chimiques ont été obtenus chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis), sauf indication contraire.
Des Taraxacum officinale Wigg. ont été obtenus à Yili, Sinkiang, en août 2017, et identifiés par le professeur Huang Shan de l’Université des sciences et technologies de Qingdao. Les plantes entières de Taraxacum officinale Wigg. ont été broyées et extraites à l’EtOH à 70 % (1:20 p/v) deux fois sous reflux pendant 2 h. Après filtration, les extraits ont été concentrés et évaporés à sec, et le rendement est de 18,6 %. Les extraits ont été conservés à −20 °C jusqu’à leur utilisation pour les expériences ultérieures.
L’ETOW a été analysé par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à trappe d’ions et temps de vol (LCMS-IT-TOF) (SHIMADZU, Kyoto, Japon). Les analyses chromatographiques de l’ETOW ont été réalisées à l’aide d’une colonne ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) (Waters, Milford, MA, États-Unis) maintenue à 40 °C. La phase mobile était constituée d’une solution d’acide formique à 0,1 % (v/v) (A) et de MeOH (B). Le programme de gradient a été réalisé comme suit : 0–20 min, 5–95 % de B ; 20–23 min, 95 % de B en 23 min, à un débit de 0,3 mL/min. La détection a été effectuée à une longueur d’onde de 246 nm. Le volume d’injection de l’échantillon était de 2 μL. Les analyses par spectrométrie de masse ont été réalisées avec une source d’ionisation par électronébulisation (ESI). Les conditions ESI étaient les suivantes : température : 200 °C ; débit d’azote gazeux : 1,5 L/min ; tension du nébuliseur en mode positif : 4500 V ; tension du nébuliseur en mode négatif : −3500 V. Les spectres de balayage de masse complet ont été enregistrés en modes ionique positif et négatif sur une plage de m/z de 100 à 1000 daltons, pour la MS et la MS/MS.
Des cellules HT22 d’hippocampe de souris ont été obtenues auprès du Dr Inhee Mook (Université nationale de Séoul, Gwanak-gu, Corée). Les cellules HT22 ont été cultivées dans du milieu DMEM supplémenté avec 10 % de SVF inactivé à la chaleur, de la streptomycine (100 mg/mL), de la pénicilline G (100 U/mL) et de la L-glutamine (2 mM), et incubées dans une atmosphère humidifiée contenant 95 % d’air et 5 % de CO₂ à 37 °C.
La viabilité cellulaire a été évaluée par un test au bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Les cellules (2 × 10⁴ cellules/puits dans des plaques à 96 puits) ont été incubées avec du MTT à une concentration finale de 0,5 mg/mL pendant 4 h. Du diméthylsulfoxyde (DMSO) a été ajouté pour dissoudre les cristaux de formazan bleu foncé formés dans les cellules viables. La densité optique a été mesurée à 490 nm. La densité optique du formazan formé dans les cellules témoins (non traitées) a été considérée comme correspondant à 100 % de viabilité cellulaire.
La sonde fluorescente diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCF-DA) a été utilisée pour mesurer la génération intracellulaire de ROS. Les cellules HT22 (2,5 × 10⁴ cellules/puits dans des plaques à 24 puits) ont été traitées avec 5 mM de glutamate, en présence ou en l’absence d’ETOW ou de SnPP (50 μM), un inhibiteur de l’activité HO, et incubées pendant 8 h. Après lavage au tampon phosphate salin (PBS), les cellules ont été colorées avec 10 μM de DCF-DA pendant 30 min à l’obscurité. Les cellules ont ensuite été à nouveau lavées au PBS et extraites à l’aide de Triton X-100 à 1 % pendant 10 min à 37 °C. La fluorescence a été enregistrée à une longueur d’onde d’excitation de 490 nm et une longueur d’onde d’émission de 525 nm à l’aide d’un spectrofluoromètre (Spectramax Gemini XS ; Molecular Devices, Sunnyvale, San Jose, CA, États-Unis), respectivement.
Les cellules HT22 ont été homogénéisées (1:20, p/v) avec du tampon d’extraction de protéines PER-Mammalian (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, États-Unis) contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéases I fraîchement ajouté (EMD Biosciences, San Diego, CA, États-Unis) et 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). La fraction cytosolique des cellules a été préparée par centrifugation. Les extraits cytoplasmiques et nucléaires des cellules HT22 ont été isolés avec les réactifs d’extraction nucléaire et cytoplasmique NE-PER (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, États-Unis) selon les instructions du fabricant. La concentration en protéines a été déterminée à l’aide d’un kit de dosage de protéines à l’acide bicinchoninique (BCA) (Thermo Scientific, Rockford, IL, États-Unis).
L’expression de diverses protéines a été analysée par Western blot. Les cellules HT22 ont été lysées dans du tampon Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) contenant un mélange d’inhibiteurs de protéases (0,1 mM de PMSF, 5 mg/mL d’aprotinine, 5 mg/mL de pepstatine A et 1 mg/mL de chymostatine). La concentration en protéines a été déterminée à l’aide d’un kit de dosage de protéines BCA. Trente microgrammes d’extraits protéiques de chaque échantillon ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) à 12 %, puis transférés par électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose Hybond à chimiluminescence renforcée (ECL) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, États-Unis). La membrane a été bloquée avec du lait écrémé en poudre à 5 % et incubée successivement avec l’anticorps primaire et l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, États-Unis). Les bandes protéiques ont été visualisées par détection ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, États-Unis) et quantifiées avec un programme d’analyse d’image (logiciel Image Gauge v3.12 ; Fujifilm, Tokyo, Japon).
L’ARN total a été extrait des cellules récoltées à l’aide du système TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis) selon les recommandations du fabricant. L’ARN total a été rétro-transcrit à l’aide d’un kit High Capacity RNA-to-cDNA (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, États-Unis). L’ADNc a ensuite été amplifié à l’aide d’un kit SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japon) et d’un système de PCR en temps réel StepOnePlus (Applied Biosystems). Les séquences d’amorces étaient les suivantes : HO-1, sens 5′-ACAGAAGAGGCTAAGACCGC, antisens 5′-TGTCAGGTATCTCCCTCCATT et β-actine, sens 5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC, antisens 5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA […]. Les résultats ont été obtenus en 28–30 cycles d’amplification. Les produits de PCR ont été séparés par électrophorèse, visualisés sous lumière UV et quantifiés par analyse densitométrique par intégration de volume avec Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, États-Unis).
Pour la localisation de Nrf-2, les cellules HT22 ont été cultivées sur des lames à chambres Lab-Tek II. Après traitement à l’ETOW, les cellules ont été fixées au formol et perméabilisées à l’acétone froide. Les cellules ont été sondées avec un anticorps anti-facteur 2 apparenté au facteur nucléaire érythroïde 2 (Nrf2) et un anticorps secondaire marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (Alexa Fluor 488 ; Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis). Pour visualiser les noyaux, les cellules ont été traitées au 4′,6-diamino-2-phénylindole (DAPI, 1 μg/mL) pendant 30 min, lavées au PBS pendant 5 min, et traitées avec 50 μL de VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, États-Unis). Les cellules colorées ont été visualisées et photographiées à l’aide d’un microscope à fluorescence Provis AX70 (Olympus Optical, Tokyo, Japon).
Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type (ET) d’au moins trois expériences indépendantes. Pour comparer trois groupes ou plus, une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test de Dunnett a été utilisée. L’analyse statistique a été réalisée avec le logiciel GraphPad Prism, version 3.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, États-Unis).
Il a été rapporté que les espèces de Taraxacum possèdent de nombreux types d’acides phénoliques et de glycosides de flavonoïdes […]. Comme le montre [ ] et déterminé par analyse LC/MS, l’ETOW contient de l’acide cis-caftarique, de l’acide trans-coutarique, de l’acide férulique, de l’esculétine, de l’acide 5-O-caféoylquinique, de l’acide caféique, de l’acide chicorique, de la lutéoline, de l’acide 11β,13-dihydro-taraxinique et du quercétine-3′,4′,7-triméthyléther […].
Pour déterminer le potentiel cytotoxique de l’ETOW, les effets sur la viabilité des cellules HT22 d’hippocampe de souris ont été mesurés à l’aide du test MTT. L’ETOW (de 50 à 400 µg/mL) n’a pas montré de changements significatifs de la viabilité cellulaire, mais lorsqu’il a été augmenté à 800 µg/mL, la viabilité cellulaire a légèrement diminué [ ]. Ainsi, la plage de concentrations de l’ETOW a été maintenue entre 50 et 400 µg/mL pour les expériences ultérieures.
Pour évaluer les effets neuroprotecteurs de l’ETOW, les effets cytoprotecteurs et les activités de piégeage des ROS de l’ETOW ont été examinés dans des cellules HT22 induites par le glutamate. Après traitement au glutamate, la viabilité des cellules HT22 a significativement diminué par rapport aux cellules non traitées [ ]. Le prétraitement à l’ETOW a augmenté la viabilité des cellules HT22 de manière concentration-dépendante [ A]. Le glutamate a nettement augmenté la génération intracellulaire de ROS dans les cellules HT22. Après prétraitement à l’ETOW, la génération de ROS induite par le glutamate a été régulée à la baisse de manière significative [ B]. Le Trolox (50 μM), utilisé comme témoin positif pour ses effets antioxydants, a montré un effet cytoprotecteur et une activité de piégeage des ROS significatifs. Les résultats ont démontré que l’ETOW atténuait la cytotoxicité et la génération de ROS induites par le glutamate dans les cellules HT22.
Pour déterminer l’effet de l’ETOW sur la HO-1, l’expression de la HO-1 aux niveaux protéique et ARNm a été étudiée à la suite du traitement à l’ETOW. L’ETOW a augmenté l’expression de la HO-1 aux niveaux protéique et ARNm de manière concentration-dépendante [ A,B]. L’inducteur de HO-1 CoPP, utilisé comme témoin positif, a augmenté significativement l’expression de la HO-1 aux niveaux protéique et ARNm [ A,B]. Le traitement à l’ETOW (400 µg/mL) a augmenté les niveaux protéique et ARNm de la HO-1 de manière temps-dépendante en 18 h, les niveaux diminuant légèrement par la suite [ C,D]. Les résultats ont montré que l’ETOW favorisait l’expression de la HO-1.
Parce que Nrf2 est un modulateur amont clé de l’induction de la HO-1 […], la translocation de Nrf2 a été étudiée. Après incubation avec l’ETOW (400 µg/mL), l’expression de Nrf2 dans les fractions nucléaires a été augmentée de manière temps-indépendante [ A]. En revanche, l’expression de Nrf2 dans les fractions cytosoliques a diminué en conséquence [ B]. Des résultats similaires ont été observés par microscopie à immunofluorescence [ C]. Les résultats ont indiqué que l’ETOW induisait la translocation de Nrf2.
Pour étudier le rôle de la HO-1 dans les effets neuroprotecteurs de l’ETOW, la voie de la HO-1 a été inhibée par la SnPP. L’ETOW a supprimé significativement la cytotoxicité [ A] et la génération de ROS [ B] induites par le glutamate. Le traitement à la SnPP a inversé efficacement l’action inhibitrice de l’ETOW sur la cytotoxicité et la génération d’espèces réactives de l’oxygène induites par le glutamate [ A,B]. Par conséquent, on pourrait en déduire que l’ETOW inhibait la cytotoxicité et la génération de ROS induites par le glutamate en partie en induisant la voie d’expression de la HO-1.
Les maladies neurodégénératives, un groupe hétérogène de troubles caractérisés par une perte progressive et sélective de systèmes neuronaux anatomiquement ou physiologiquement apparentés, entraînent l’aggravation du dysfonctionnement neurologique et sont finalement fatales […]. Il est nécessaire de diagnostiquer à temps et de mener l’intervention thérapeutique appropriée pour arrêter la progression de la maladie et la souffrance des patients. La médecine traditionnelle chinoise a du potentiel dans le traitement des maladies neurodégénératives par ses caractéristiques multi-cibles, multi-liaisons, multi-voies. Par exemple, Ginkgo biloba […], Panax ginseng […] et Astragalus […] ont montré des effets neuroprotecteurs. Dans ce travail, nous avons étudié l’activité neuroprotectrice de l’ETOW dans des cellules HT22 stimulées par le glutamate.
Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central des mammifères […]. Cependant, une concentration excessive d’acide glutamique entraîne la mort des neurones […]. Les lésions neuronales peuvent être déclenchées par le glutamate de deux façons : l’une est l’excitotoxicité oxydative médiée par les récepteurs du glutamate, causée par l’influx excessif de Ca²⁺ et la modification de l’homéostasie calcique ; l’autre est le dommage oxydatif lié aux ROS, principalement lié à l’antiporteur glutamate/cystéine nécessitant l’apport de cystéine […]. Les cellules HT22, une lignée cellulaire neuronale immortalisée dérivée de l’hippocampe de souris, sont dépourvues de récepteurs ionotropiques fonctionnels du glutamate […]. Par conséquent, les cellules HT22 sont fréquemment utilisées pour étudier le mécanisme de toxicité oxydative du glutamate non médiée par les récepteurs, à savoir le modèle in vitro de SO induit par le glutamate, qui exclut l’excitotoxicité comme cause de la mort neuronale stimulée par le glutamate […]. Dans notre présente étude, nous avons étudié les effets neuroprotecteurs de Taraxacum officinale Wigg. dans des cellules HT22 induites par le glutamate. Nous avons constaté que des concentrations non toxiques d’ETOW étaient capables d’atténuer la cytotoxicité et la génération de ROS induites par le glutamate [ A,B], ce qui suggère que l’ETOW pourrait agir comme un agent neuroprotecteur potentiel.
La HO-1, un membre de 32 kDa de la superfamille des protéines de stress, est également connue sous le nom de protéine de choc thermique (Hsp)-32. La HO-1 et ses produits enzymatiques, notamment le CO, la BV et la bilirubine, jouent des rôles importants dans la régulation du système biologique de stress oxydatif […]. Il existe de nombreuses preuves impliquant un rôle neuroprotecteur de la HO-1, à la fois in vitro et in vivo […]. Le facteur de transcription nucléaire Nrf2, qui appartient à la famille Cap ‘N’ Collar (CNC) contenant un facteur de transcription à fermeture éclair à leucine basique (bZIP) conservé, joue un rôle important dans l’expression de la HO-1 […]. La voie médiée par Nrf2 est connue comme un mécanisme de protection essentiel contre le SO […]. Dans des conditions physiologiques, Nrf2 reste dans le cytoplasme, lié à la protéine 1 associée à ECH de type Kelch (Keap1), un inhibiteur de Nrf2 qui agit comme capteur du stress ROS/électrophile, et Bach1, un facteur de transcription bZip, forme des hétérodimères avec l’homologue K de l’oncogène du fibrosarcome musculo-aponévrotique (MafK) ; dans des conditions de stress, Nrf2 se libère de Keap1 et se transloque vers le noyau où il s’hétérodimérise avec une petite protéine Maf, se lie à l’élément de réponse antioxydant (ARE) et active finalement la transcription du gène HO-1 […]. Dans notre investigation, nous avons constaté que l’ETOW induisait l’expression de la protéine HO-1 et augmentait les niveaux de Nrf2 dans le noyau [ et ]. De plus, les expériences avec la SnPP ont indiqué que l’expression de la HO-1 provoquée par l’ETOW était positivement associée aux effets neuroprotecteurs dans les cellules HT22 [ ]. Ces résultats ont indiqué que l’ETOW pourrait exercer des effets neuroprotecteurs en activant Nrf2/HO-1.
Pris ensemble, notre étude a démontré que l’ETOW atténuait le SO induit par le glutamate dans les cellules HT22, ce qui est lié à l’activation de Nrf2/HO-1 (en favorisant la translocation de Nrf2 vers le noyau et l’expression de la HO-1). Par conséquent, Taraxacum officinale Wigg. pourrait avoir le potentiel d’être utilisé comme agent neuroprotecteur grâce à une exploitation et une utilisation appropriées.
Niveau de preuve : étude in vitro (lignée cellulaire neuronale) — mécanisme cellulaire, ne préjuge pas d’un effet clinique chez l’humain. Molécules identifiées dans l’extrait (LC/MS) : acide caféique, acide chicorique, acide férulique, esculétine, lutéoline, quercétine (dérivé), acide caftarique, acide coutarique, acide caféoylquinique, acide dihydro-taraxinique. ↩ Retour : Pissenlit officinal