Référence : Molecules 2019. — PMC6832739 · DOI 10.3390/molecules24203795 Type : Article de recherche original (expérimental in vitro + in silico) · Plante : Petite centaurée · Propriété → Digestion Accès : ⭐ libre → texte intégral traduit (open-access, licence CC BY 4.0) Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Centaurium erythraea est recommandée pour le traitement des troubles gastro-intestinaux et pour réduire l’hypercholestérolémie dans la pratique ethno-médicinale. Afin de mener une étude top-down susceptible d’éclairer les bases moléculaires de ces bioactivités, des décoctions de feuilles de C. erythraea ont été préparées et les composés ont été identifiés par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem à haute résolution (LC–MS/MS). Des glycosides sécoiridoïdes, comme la gentiopicroside et le sweroside, ainsi que plusieurs xanthones, telle la di-hydroxy-dimethoxyxanthone, ont été identifiés. À la suite de certaines des bioactivités précédemment attribuées à C. erythraea, nous avons étudié sa capacité antioxydante et son aptitude à inhiber l’acétylcholinestérase (AChE) et la 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A réductase (HMGR). Des activités antioxydantes significatives ont été observées, selon trois essais : réduction du radical libre 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) ; lipoperoxydation ; et capacité de piégeage du radical NO. Les activités inhibitrices de l’AChE et de l’HMGR de la décoction ont également été mesurées (respectivement 56 % à 500 μg/mL et 48 % à 10 μg/mL). Les études d’amarrage moléculaire (molecular docking) ont indiqué que les xanthones sont de meilleurs inhibiteurs de l’AChE que la gentiopicroside, tandis que ce dernier composé présente une meilleure complémentarité de forme avec le site actif de l’HMGR que les xanthones. À notre connaissance, il s’agit du premier rapport sur les activités AChE et HMGR par des décoctions de C. erythraea, dans une analyse top-down, complétée par un amarrage moléculaire in silico, qui vise à comprendre, au niveau moléculaire, certains des effets biologiques attribués aux infusions de cette plante.
Centaurium erythraea (C. erythraea) est une plante appartenant à la famille des Gentianaceae, connue sous le nom de petite centaurée commune, poussant dans presque toute l’Europe, en Afrique du Nord et en Asie du Sud-Ouest. C’est une plante médicinale aux applications multiples, parmi lesquelles on peut mentionner la motilité gastro-intestinale, les dommages gastriques ainsi que la réduction du cholestérol sanguin total. L’Agence européenne des médicaments (EMA) dispose d’un rapport sur ses applications et, en Chine, un sécoiridoïde présent dans cette plante a été approuvé comme nouveau médicament pour traiter l’ictère aigu et l’hépatite active chronique.
L’effet gastro-protecteur observé avec les extraits hydro-éthanoliques de C. erythraea pourrait, en partie, s’expliquer par son activité antioxydante. Des espèces radicalaires peuvent se former à l’intérieur des cellules à cause de plusieurs processus d’oxydation. Ces espèces réactives de l’oxygène et de l’azote induisent des modifications de l’ADN, des protéines et des molécules lipidiques, ce qui peut conduire à de graves dommages cellulaires. Les cellules disposent de plusieurs mécanismes de réparation pour gérer ces molécules endommagées, ainsi que de nombreux composés antioxydants qui évitent la formation de radicaux ou neutralisent promptement leur effet. Plusieurs maladies sont liées aux processus oxydatifs dans les cellules.
Les parties aériennes de C. erythraea ont montré des propriétés antimicrobiennes et gastro-protectrices, et la gentiopicroside de C. erythraea a montré des effets anti-inflammatoires, sans exhiber de toxicité envers les animaux de laboratoire (rongeurs). Les extraits de cette plante sont riches en glycosides sécoiridoïdes, à savoir la gentiopicroside, le sweroside, la swertiamarine, et en dérivés xanthoniques. Plusieurs activités biologiques ont été attribuées à la gentiopicroside, à savoir l’inhibition de la contraction spontanée du muscle lisse de l’iléon, y compris des activités analgésiques, anti-inflammatoires et anti-acétylcholinestérasiques. Ce glycoside iridoïde offre une hépatoprotection contre des composés qui produisent une défaillance hépatique et peut également protéger l’ADN des dommages. La gentiopicroside a pu augmenter la motilité gastro-intestinale en modifiant l’expression de plusieurs hormones liées à la propulsion intestinale, ainsi que réduire le taux de cholestérol total chez les animaux de laboratoire. Les xanthones, également présentes dans C. erythraea, ont montré plusieurs effets biologiques, dont des activités antitumorales et anti-inflammatoires. Les dérivés xanthoniques peuvent inhiber l’acétylcholinestérase (AChE) et bloquer l’agrégation β-amyloïde induite par l’acétylcholinestérase. Ces composés sont également connus pour leur effet antiprolifératif et leur capacité à inhiber plusieurs cibles moléculaires dans les cellules tumorales, dont les kinases, les cyclooxygénases et les ADN polymérases.
Les effets des extraits végétaux mentionnés, comme la propulsion gastro-intestinale et la réduction du cholestérol sanguin, en plus de leur association avec la maladie d’Alzheimer, nous ont guidés pour évaluer les activités de l’AChE et de la 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A réductase (HMGR). L’AChE (EC 3.1.1.7) est une enzyme localisée dans les fentes synaptiques et les jonctions neuromusculaires qui catalyse l’hydrolyse du neurotransmetteur acétylcholine, essentielle à la connectivité neuronale et au mécanisme de contraction de la jonction. Il a également été montré que l’AChE influence la motilité gastro-intestinale et colique, et que son inhibition réversible peut aider à traiter les troubles gastro-intestinaux (GI) et la maladie d’Alzheimer. L’enzyme HMGR (EC 1.1.1.34) est un régulateur important de la voie de biosynthèse du cholestérol et son inhibition par les statines a été utilisée à des fins thérapeutiques pour réduire les taux de cholestérol sanguin total.
Le but de cette étude est d’identifier les composés clés présents dans la décoction de C. erythraea, une manière courante de consommer les boissons à base de plantes, et de tester ses effets antioxydants, ainsi que ses activités inhibitrices de l’AChE et de l’HMGR, ce qui peut aider à expliquer l’impact des décoctions en ethno-médecine. Dans cette approche top-down, nous réaliserons également des calculs d’amarrage moléculaire computationnel pour aider à rationaliser les détails moléculaires des mécanismes d’action et cerner les contributions individuelles de chaque composé. Dans l’ensemble, cette étude contribue à la connaissance scientifique des mécanismes d’action des décoctions de C. erythraea, une herbe décrite par le Comité des médicaments à base de plantes (HMPC, de l’EMA).
Des décoctions de C. erythraea ont été préparées et analysées par chromatographie liquide haute performance en phase inverse avec détecteur à barrette de diodes (RP-HPLC–DAD) [ ]. Comme l’eau peut extraire les polymères de sucre, une précipitation à l’éthanol de ces composés (précipitation des mucilages) a été réalisée, et le surnageant de décoction sans mucilages (DMf) a été analysé par RP-HPLC–DAD [ ]. La quantité de matériel précipité était très faible (seulement 5,5 %), ce qui signifie que C. erythraea a une très faible quantité de polymères de sucre. Le culot n’avait pas de composés phénoliques puisque aucun pic n’a été observé dans le chromatogramme [ ]. Dans ce chromatogramme, un pic majeur est détecté vers 11 min et plusieurs composés apparaissent après ce temps de rétention. On peut voir que la décoction sans mucilages se superpose à l’extrait complet et que le culot n’a aucun composé détectable.
Afin d’identifier les composés, une LC–MS/MS a été réalisée. La LC–MS en modes négatif et positif [a,b, respectivement] et la LC–MS/MS ont permis l’identification des composés indiqués dans [ ], soit en utilisant les informations de la littérature, soit en tenant compte de la masse exacte. Le premier chromatogramme dans [a,b] est le chromatogramme BPC avec tous les composés présents dans l’extrait complet. Ce chromatogramme est identique à celui obtenu par RP-HPLC–DAD, c’est-à-dire un composé majeur suivi de nombreux composés d’intensité plus faible. L’identification des composés a indiqué la présence de cinq sécoiridoïdes, six xanthones et un flavonoïde (quercétine). Le composé majeur est la gentiopicroside, un composé de structure sécoiridoïde caractéristique de la famille des Gentianaceae à laquelle appartient C. erythraea. Les composés dont le temps de rétention est compris entre 8 et 30 min ont été identifiés comme des dérivés xanthoniques et de la quercétine [ ]. Avant ce temps de rétention, la plupart des composés avaient le même type de structure que les sécoiridoïdes. En raison de la similitude entre les chromatogrammes et de l’utilisation du composé étalon gentiopicroside, le pic de plus haute intensité en RP-HPLC–DAD [ ] contient les dérivés sécoiridoïdes. Les petits pics à temps de rétention plus élevé appartiennent aux composés de type xanthone, selon les résultats d’identification par la masse.
La séparation entre xanthones et iridoïdes a été relativement facile en raison de leurs différences structurelles. Une fraction contenant principalement des xanthones (XF) a été obtenue en injectant à plusieurs reprises la DMf dans l’HPLC–DAD et en ne collectant que les composés sortant de la colonne entre 11,5 et 30 min. Cette fraction a été réinjectée dans le système chromatographique pour confirmer que les composés appartenaient à la fraction xanthonique dans [ ].
Comme plusieurs activités biologiques ont été attribuées soit à la gentiopicroside, soit aux dérivés xanthoniques, nous avons complété l’analyse des décoctions complètes de C. erythraea par des études de la DMf et de la XF.
Les phénols totaux ont été quantifiés dans tous les échantillons [ ], et les quantités détectées par la méthode de Folin–Ciocalteu étaient assez faibles. Cela était attendu puisque cette méthode quantifie les groupes hydroxyles phénoliques, absents de certains des composés identifiés à partir des résultats HPLC–DAD et LC–MS/MS, tels que la gentiopicroside, la swertiamarine ou le sweroside. L’extrait aqueux (D) a la plus haute quantité de composés phénoliques mesurés en équivalents d’acide gallique (GAE) (22,37 ± 0,36 μg GAE/mg d’extrait), suivi de la DMf (18,82 ± 0,25 μg GAE/mg d’extrait) et enfin de la XF (16,31 ± 0,25 μg GAE/mg d’extrait). Ces valeurs étaient statistiquement différentes à p ≤ 0,05.
Ces dernières années, une grande attention a été portée aux antioxydants naturels qui peuvent être utilisés dans notre alimentation et aider l’organisme à contrer le stress oxydatif. Pour évaluer les activités biologiques des composés présents dans les décoctions, nous avons utilisé à la fois la XF et l’étalon gentiopicroside pour représenter le composé le plus abondant du chromatogramme. La méthode la plus largement utilisée pour mesurer les activités antioxydantes est le test de piégeage du radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), mais en raison de certains inconvénients rapportés de cette méthode et de la complexité des mécanismes antioxydants à l’intérieur des cellules, nous avons complété notre étude par d’autres méthodologies in vitro rapides et peu coûteuses, qui modélisent les processus antioxydants in vivo. Dans ces essais, le potentiel antioxydant de C. erythraea a été évalué par sa capacité à réduire le radical DPPH, à inhiber la peroxydation lipidique et à capturer les radicaux d’oxyde nitrique, évitant sa réaction avec les molécules biologiques.
Comme le montre [ ], à la même concentration (50 μg/mL), D est celui avec le plus haut pourcentage de capture de radical libre (environ 25 %) tandis que la DMf a un pourcentage de réduction du radical d’environ 22 %. Ces résultats suggèrent que, pendant le processus de précipitation des mucilages, certains composés antioxydants sont retenus dans les mucilages, ou que certains composés constitutifs des mucilages ont la capacité de réduire le radical DPPH. La XF a une bonne activité antioxydante comparée à la décoction complète ; 68 % de la capacité de piégeage du DPPH dans la décoction complète correspond à la fraction xanthonique, ou 75 % par rapport à la DMf. Cela suggère une faible activité antioxydante des sécoiridoïdes détectés dans cette décoction. Comme attendu, les activités antioxydantes mesurées corrèlent bien avec la quantité de phénols totaux quantifiée dans les différents échantillons (r² = 0,9677). Sur la base des résultats obtenus par LC–MS/MS, nous proposons que la plupart des xanthones ont des groupes hydroxyles dans leur structure, qui peuvent facilement fournir des électrons et neutraliser le radical DPPH.
Il est à noter que l’étalon gentiopicroside a montré une faible activité antioxydante (~1 %), tandis que pour l’hydroxytoluène butylé commercial (BHT), la rutine et la quercétine, les valeurs d’EC50 sont respectivement de 9,89 μg/mL, 6,27 μg/mL et 3,23 μg/mL. Le résultat de la gentiopicroside était attendu puisque ce composé n’a pas de groupe stabilisant les radicaux, il est donc incapable de donner des électrons à la forme radicalaire du DPPH.
Il est notable que des études menées avec les sécoiridoïdes de C. erythraea ont révélé que ni la swertiamarine ni le sweroside, identifiés par LC–MS/MS dans ce travail, n’ont d’activité antioxydante. Par conséquent, ces données combinées à l’activité pratiquement inexistante de la gentiopicroside peuvent expliquer la faible activité antioxydante de cet extrait comparé aux étalons commerciaux mentionnés ci-dessus. En outre, nos résultats d’activité antioxydante sont en bon accord avec d’autres extraits végétaux ayant des composés similaires.
L’activité antioxydante mesurée comme formation de TBARs indique une capacité à contrer l’oxydation des lipides. Comme présenté dans [ ], pour la concentration finale de 400 μg/mL, D a une inhibition d’environ 32 %, qui est plus faible que celle du BHT, l’étalon commercial (49,09 μg/mL). Cette activité est plus faible que celle obtenue avec des extraits aqueux de plantes contenant des polyphénols. Dans les extraits de C. erythraea, les sécoiridoïdes et les xanthones sont les principaux composants et, bien que les xanthones à groupes hydroxyles libres aient la capacité d’éviter la peroxydation lipidique, la plupart de celles détectées dans notre étude ont plusieurs groupes hydroxyles méthylés ou fonctionnalisés avec des fragments de sucre. Ces modifications réduisent significativement le nombre de groupes hydroxyles libres disponibles, qui sont justement la source de l’activité antioxydante détectée dans le présent travail.
NO• est une espèce radicalaire libre naturellement générée dans la cellule, avec d’importantes fonctions physiologiques. Cependant, il devient un composé dangereux lorsqu’il réagit avec le radical superoxyde, formant l’anion peroxynitrite (ONOO⁻), un puissant oxydant. L’activité de piégeage du radical NO• est une mesure de l’élimination du peroxynitrite, donc de l’évitement du stress oxydatif dans la cellule. Dans cette méthode, le NO• est formé à partir de nitroprussiate de sodium et il réagit avec l’oxygène moléculaire pour produire du nitrate et du nitrite, ce dernier étant quantifié à l’aide du réactif de Griess. En utilisant cette méthode pour modéliser la synthèse de NO• dans la cellule, nous pouvons mesurer la capacité de piégeage de radical de la décoction [ ]. Dans cette étude, l’extrait aqueux (D) a une capacité inhibitrice plus faible (EC50 = 775 μg/mL) que la rutine (EC50 = 314 μg/mL), un antioxydant puissant connu pour sa capacité de piégeage du NO•. Néanmoins, des décoctions contenant un mélange de dérivés flavonoïdes ont montré une activité plus élevée, ce qui suggère que ni les sécoiridoïdes ni les xanthones n’ont une capacité significative de capture du radical NO.
C. erythraea est utilisée en décoctions ou infusions pour améliorer le processus digestif des aliments. Une façon d’améliorer ce processus digestif est d’augmenter le transit intestinal, ce qui peut être accompli en inhibant l’enzyme acétylcholinestérase (AChE) dans les jonctions neuromusculaires. Il a été montré que ce mécanisme accélère la motilité gastro-intestinale chez les patients humains post-opérés et chez les animaux. Les essais d’inhibition de l’AChE ont été réalisés en utilisant D, DMf, XF et l’étalon gentiopicroside. Aucune corrélation n’a été observée entre la quantité de phénols totaux présents dans les fractions et l’activité inhibitrice de l’enzyme (r² = 0,0256), ce qui était attendu puisqu’il y a de nombreux facteurs qui influencent la constante d’inhibition de l’AChE et que la plupart ne sont pas liés au nombre de groupes phénoliques dans le composé. De plus, tous les composés ne sont pas capables de s’insérer dans le site actif de l’enzyme de la manière la plus efficace.
Pour la concentration finale de 500 μg/mL, l’échantillon qui a montré la plus haute activité inhibitrice était la XF (~60 %), suivie de D (~56 %) et de la DMf (~47 %). Des études antérieures avec la 1,5,8-trihydroxy-3-methoxyxanthone (isolée de Gentiana campestris, appartenant également à la famille des Gentianaceae) ont montré des valeurs d’inhibition de l’enzyme très similaires à l’étalon commercial galantamine, soulignant le rôle que ces composés peuvent jouer dans le traitement des problèmes digestifs et même de la maladie d’Alzheimer. En raison de la faible activité de D contenant le composant majeur gentiopicroside relativement à la XF, le composé étalon a également été ajouté dans cette étude et son activité inhibitrice de l’AChE déterminée [ ]. L’inhibition de l’AChE en utilisant le composé pur, à 500 μL/mL, était très faible (6,5 %), confirmant sa faible contribution comparée à l’étalon galantamine (0,14 μg/mL) ou au donépézil (2 ng/mL).
Les différences nettes dans les capacités d’inhibition de l’AChE par la gentiopicroside et la xanthone nous ont conduits à étudier les interactions composé/enzyme au niveau moléculaire. Nous avons réalisé des calculs d’amarrage computationnel du faible inhibiteur gentiopicroside et de plusieurs dérivés xanthoniques [ ] qui respectent la masse moléculaire rapportée par l’essai LC–MS/MS [ ]. Nous avons divisé les xanthones testées en trois classes : les xanthones précédemment décrites dans la littérature (xan01-11), les composés xanthoniques conçus rationnellement (xan12-15) et les dérivés xanthoniques issus des inhibiteurs les plus puissants des deux groupes précédents (xan08.1-15.1). Les xanthones identifiées dans le présent travail sont indiquées dans [ ] par le numéro de pic correspondant dans [ ]. Dans cette étude, plusieurs hypothèses ont été proposées pour la localisation des groupes OH et OMe selon différentes identifications rapportées dans la littérature. Ce fait attribue plusieurs composés au même pic identifié par LC–MS/MS.
Les calculs d’amarrage réalisés montrent que ces deux familles de composés se lient à des régions de poche distinctes. La gentiopicroside se lie dans une position plus profonde, près de la triade catalytique de l’AChE, tandis que les xanthones se lient au niveau de la gorge du tunnel d’accès [A,B]. Les deux positions de liaison sont complémentaires et, ensemble, ressemblent au mode de liaison du donépézil. Comme la galantamine, le donépézil est un inhibiteur très puissant de l’AChE et nous nous attendions à ce que ni la gentiopicroside ni aucune xanthone ne puissent être des inhibiteurs aussi forts, car ceux-ci ne présentent qu’une fraction de la complémentarité de forme et des interactions que le donépézil établit dans la poche de l’AChE. Selon nos simulations, la gentiopicroside est un inhibiteur modeste de l’AChE (Ki calculé = 62,3 μM), conséquence du fait qu’elle n’interagit pas fortement avec l’enzyme. Nous n’observons que quelques liaisons hydrogène individuelles entre le groupe glycoside et les chaînes latérales de tyrosine, tandis que le reste de la molécule de gentiopicroside se lie près de la triade catalytique sans établir d’interactions directes notables [C].
Le mode de liaison préféré de la plupart des xanthones se situe au niveau du tunnel d’accès du site actif, où les composés semblent maximiser le nombre d’interactions et présentent une forte complémentarité de forme. La faible polarité de cette classe de molécules conduit à une affinité de liaison accrue obtenue par désolvatation. De toutes les xanthones évaluées, xan08, xan09, xan12 et xan12.1 [D–F] ont présenté des constantes d’inhibition significativement fortes [ ]. Contrairement à la gentiopicroside, les xanthones sont capables d’établir un plus grand nombre de liaisons hydrogène, dont un réseau de liaisons partagées avec les chaînes latérales de tyrosine mentionnées précédemment. La taille de ce réseau hydrogène peut expliquer les différences entre les inhibiteurs forts et les moins forts [ ]. La position R1 semble être la substitution la plus importante pour la formation du réseau hydrogène mentionné, qui devient particulièrement fort avec un groupe hydroxyle, se comportant à la fois comme accepteur et donneur de liaison hydrogène. La position R5 est également importante puisqu’elle interagit avec le squelette de la protéine, soit comme donneur (avec le carbonyle), soit comme accepteur (avec l’amide). Le composé xan12 est capable d’établir une liaison hydrogène supplémentaire avec Trp286 [F], qui a été conservée dans le mode de liaison de xan12.1, un dérivé obtenu en retirant le groupe méthoxy en position R2 (la flèche dans [F]), l’inhibiteur le plus fort trouvé dans notre étude computationnelle.
Les études d’amarrage réalisées ont montré que, contrairement à la gentiopicroside, les xanthones également présentes dans la décoction de C. erythraea peuvent être de forts inhibiteurs de l’AChE, et que leur pouvoir d’inhibition dépend de leurs substitutions de groupes Rx. En outre, dans notre travail, xan09 a été identifié comme un bon inhibiteur, ce qui est en bon accord avec la valeur d’IC50 mesurée expérimentalement de 18,5 μM. Une série de xanthones conçues rationnellement a été créée sur la base des meilleurs inhibiteurs trouvés dans cette étude, et xan12.1 a été identifié comme l’inhibiteur le plus fort que nous ayons observé. Cependant, des inhibiteurs à base de xanthone plus forts avec ce modèle pourraient encore être non découverts, puisque nous n’avons saisi qu’une fraction de toutes les combinaisons possibles de groupes chimiques et de positions de substitution. Par conséquent, notre protocole d’amarrage moléculaire est particulièrement utile pour estimer la plage de valeurs de constante d’inhibition d’un grand nombre de xanthones, surtout en considérant qu’aucune identification spécifique de xanthone n’a été réalisée dans la fraction extraite de la décoction de C. erythraea. De plus, nos études d’amarrage peuvent aider à prévoir l’emplacement ou la position des substituants dans les xanthones identifiées dans l’extrait, à titre d’identification provisoire, selon les activités élevées déterminées.
C. erythraea a également été rapportée comme réduisant les taux élevés de cholestérol sanguin. En clinique, les taux élevés de cholestérol sanguin sont traités avec des statines, connues comme inhibiteurs de la biosynthèse du cholestérol. Elles agissent en inhibant l’activité de l’enzyme régulatrice de la voie biosynthétique du cholestérol, la 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A réductase (HMGR).
L’inhibition de cette enzyme a été testée avec D (48 %) et DMf (27 %), pour la même concentration de 10 μg/mL. Ces résultats suggèrent que le potentiel inhibiteur de C. erythraea est principalement dû aux monoterpénoïdes, ce qui peut refléter le potentiel de cette plante à réduire la synthèse du cholestérol. Le médicament simvastatine a un IC50 de 0,2 μg/mL, ce qui signifie qu’il a une activité bien plus forte que les composés présents dans C. erythraea. Cependant, le médicament est un composé pur, et la décoction à l’étude est un mélange naturel de plusieurs composés, dont certains peuvent avoir des activités significatives qui se retrouvent masquées dans le mélange.
Des études d’amarrage in silico rapportent que la swertiamarine, identifiée dans ce travail, agit au niveau de plusieurs enzymes et facteurs de transcription impliqués dans le métabolisme du glucose et des lipides, y compris dans l’inhibition de l’HMGR. Peffley et al. ont observé que les monoterpénoïdes dérivés de la voie du mévalonate de la plante peuvent contrôler la synthèse de l’HMGR par un mécanisme qui semble moduler l’efficacité de la traduction de l’ARNm.
Afin d’évaluer au niveau moléculaire et d’attribuer à quel type de composés présents dans l’extrait la forte activité d’inhibition de l’HMGR pourrait être imputée, des études d’amarrage ont également été réalisées avec la gentiopicroside et toutes les xanthones présentées précédemment. La famille de composés xanthoniques a une affinité de liaison modeste envers l’HMGR, présentant des Ki calculés allant de 54,8 à 184,8 μM [ ]. Cependant, la gentiopicroside semble mieux remplir le site actif de l’HMGR et établir davantage d’interactions par liaison hydrogène que les composés xanthoniques, résultant en une inhibition plus forte (Ki calculé = 19,9 μM). Cette protéine a un site actif très peu profond et, contrairement à la plupart des statines (Ki calculé = 3,5 nM pour l’exemple donné), nos composés ne sont capables d’occuper qu’une fraction de ce site [ ]. Même si les composés testés sont de taille comparable à celle des inhibiteurs plus forts tels que l’acide piscidique, ce dernier, étant anionique, est capable d’interagir avec un nombre significatif de résidus cationiques (Lys735, Arg590, Lys692, Lys691), ce qui explique sa performance.
Tous les produits chimiques étaient de qualité analytique. Le méthanol (MeOH), le sulfate de fer(II) heptahydraté et l’acide trichloracétique ont été obtenus auprès de Riedel-de Haën™ (Seelze, Allemagne), et l’acide formique, l’eau et l’acétonitrile (ACN) auprès de Fisher Scientific, Optima™ (Hampton, NH, USA). L’acide trifluoroacétique (TFA), le dihydrogénophosphate de potassium, le tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris) et le chlorure de sodium ont été achetés auprès de Merck (Darmstadt, Allemagne). L’éthanol 96 % a été acheté auprès de Carlo Erba (Peypin, France), la gentiopicroside auprès de TransMIT (Hesse, Allemagne) et le chlorure de potassium auprès de Fluka (Seelze, Allemagne). L’acétylcholinestérase (AChE), l’iodure d’acétylcholine (AChI), l’acide 5-5′-dithiobis(2-nitrobenzoïque) (DTNB), le kit d’essai HMG-CoA réductase, l’acide gallique, le 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), l’hydroxytoluène butylé (BHT), la quercétine, la rutine et la galantamine ont été obtenus auprès de Sigma (Barcelone, Espagne). Le chlorure de magnésium hexahydraté, l’acide thiobarbiturique, le peroxyde d’hydrogène, l’hydrogénophosphate de sodium et le 1-butanol ont été achetés auprès de PanReac (Barcelone, Espagne). L’hydroxyde de sodium a été obtenu auprès de JT Baker, Royaume-Uni, et le nitroprussiate de sodium et le réactif de Griess auprès de VWR Chemicals PL.
Les parties aériennes de C. erythraea Rafin. ont été achetées dans une herboristerie locale (Celeiro-Dieta, Lisbonne), séchées, en sachets. La plante est récoltée aux coordonnées GPS (Global Positioning System) 39°30′42″ N, 8°47′58″ O, Portugal, identifiée chez le fournisseur et commercialisée par une entreprise certifiée pour la commercialisation de plantes médicinales (ISO 9001/2015). Un spécimen de référence (voucher) de la même espèce est conservé à l’herbier du jardin botanique sous le numéro LISU253536. Pour obtenir l’extrait aqueux, une décoction de la plante a été préparée, en utilisant 95 g de plante bouillie dans 950 mL d’eau distillée pendant 10 min. La décoction (D) a été filtrée à travers du papier Whatman grade n°1 et lyophilisée avec un rendement de 19,3 %. Tout au long du travail, l’extrait a été stocké à −80 °C.
Une purification de D a été réalisée en retirant les mucilages par précipitation des polymères selon la méthode de Henriques et al. En bref, à une solution à 10 mg/mL de la décoction lyophilisée a été ajouté de l’éthanol 96 % dans un rapport de 1:5. Le mélange a été maintenu dans la glace pendant 8 h et centrifugé dans un appareil Eppendorf 5415D, DE, à 3500× g pendant 30 min. Le surnageant exempt de mucilages a été séparé et conservé pour les expériences suivantes. Le culot a été lavé à nouveau avec de l’eau et les mucilages précipités une fois de plus avec de l’éthanol comme décrit précédemment. Le second surnageant a été mélangé au premier et lyophilisé. Cette fraction a été désignée comme Décoction Sans Mucilage (DMf) et a été stockée à −80 °C pendant le travail expérimental.
La fraction xanthonique (XF) a été séparée par HPLC–DAD en injectant à plusieurs reprises 25 μL de DMf à 10 mg/mL et en collectant les fractions au temps de rétention 11,5–30 min.
L’analyse chromatographique des décoctions, la collecte de la fraction xanthonique et l’essai enzymatique de la 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A réductase (HMGR) ont été réalisés sur un VWR-Hitachi Elite LaChrom®, équipé d’une colonne LiChroCART® RP-18, 5 μm, 250 × 4 mm, 100 Å de Merck, d’un passeur d’échantillons L-2200, d’un four à colonne L-2300 et d’un détecteur à barrette de diodes (DAD) L-2455. Le logiciel d’acquisition de données était EZChrom Elite®, Hitachi Japon. Pour l’analyse des extraits, 1 mg/mL de chaque extrait a été utilisé, et pour l’isolement de la XF, 10 mg/mL de DMf a été utilisé. Le débit était de 0,8 mL/min et la détection réalisée entre 200 et 500 nm en utilisant le DAD. Pour l’analyse des décoctions et la collecte de la XF, la phase mobile consistait en 0,05 % (v/v) de TFA dans l’eau (A) et de l’acétonitrile (B). Les conditions d’élution étaient les suivantes : 0 min, 92 % A, 8 % B ; 20 min, 82 % A, 18 % B ; 25 min, 45 % A, 55 % B ; 28 min, 92 % A, 8 % B et 30 min, 92 % A, 8 % B. Pour l’essai d’inhibition de l’HMGR, la phase mobile consistait en KH₂PO₄ 100 mM dans l’eau (A) et MeOH (B), le gradient est décrit dans Falé et al. L’étalon gentiopicroside a été utilisé pour confirmer l’identification du pic de plus haute intensité.
Les échantillons ont été analysés par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem à haute résolution (LC–MS-MS) en utilisant un système Ultimate 3000 RSLCnano (Thermo Fischer Scientific, Idstein, Allemagne) interfacé avec un spectromètre de masse à temps de vol quadripolaire (QqToF) Impact II équipé d’une source électrospray (Bruker Daltonics, Brême, Allemagne).
La séparation chromatographique a été réalisée sur une colonne Kinetex 1,7 µm C18 100 Å, colonne LC 150 × 2,1 mm (Phenomenex, Californie, USA), à un débit de 150 µL/min. La phase mobile consistait en 0,1 % (v/v) d’acide formique dans l’eau (A) et 0,1 % (v/v) d’acide formique dans l’acétonitrile (B), les conditions d’élution ont été décrites dans André et al. La colonne et le passeur ont été maintenus à 35 °C et 10 °C, respectivement.
Les spectres de masse à haute résolution ont été acquis en modes d’ionisation par électrospray (ESI) positif/négatif. Les paramètres optimisés ont été fixés comme suit : tension de spray d’ions, +4,5/−2,5 kV ; décalage de plaque terminale, 500 V ; gaz de nébulisation (N₂), 2,8 bars ; gaz sec (N₂), 8 L/min ; chauffage sec, 200 °C. Une calibration interne a été réalisée en mode de calibration de haute précision (HPC) avec une solution de formiate de sodium 10 mM introduite dans la source d’ions via une boucle de 20 µL au début de chaque analyse en utilisant une vanne à six ports. L’acquisition a été réalisée en mode balayage complet dans la plage m/z 50–1300, et en mode MS/MS dépendant des données, avec une acquisition de 3 Hz utilisant une méthode dynamique avec un temps de cycle fixe de 3 s. La durée d’exclusion dynamique était de 0,4 min. Les données acquises ont été traitées par le logiciel DataAnalysis 4.1 (Bruker Daltoniks).
La teneur en phénols totaux a été mesurée spectrophotométriquement, à 760 nm, en utilisant le réactif de Folin–Ciocalteu comme décrit dans Henriques et al., en utilisant l’acide gallique comme étalon (10–500 μg/mL). Les échantillons analysés étaient D, DMf et XF. La concentration de phénols totaux a été déterminée en μg d’équivalents d’acide gallique par mg d’extrait sec, comme la moyenne de trois répliques.
L’activité de piégeage de radical de C. erythraea a été évaluée en utilisant la méthode DPPH décrite par Falé et al. En bref, 10 μL de la solution d’échantillon ont été ajoutés à une concentration de 5 mg/mL à 1 mL de la solution de DPPH (0,002 % dans MeOH), les solutions ont été incubées à température ambiante pendant 30 min, puis l’absorbance des différents échantillons a été mesurée sur le lecteur de microplaques à 517 nm contre un blanc. Le BHT, la rutine et la quercétine ont été utilisés comme étalons et, pour ces composés, la valeur de concentration permettant d’accomplir une extinction d’absorption de 50 % (EC50) a été déterminée. Tous les essais ont été réalisés en triplicat et sont présentés comme moyenne et écart-type associés aux mesures. Afin de calculer le pourcentage d’activité antioxydante, l’expression suivante a été utilisée : [ ]
Dans laquelle AA (%) correspond au pourcentage d’activité antioxydante, A_échantillon se réfère à l’absorbance de chaque échantillon et A_test à l’absorbance de la solution de contrôle.
L’inhibition de l’oxydation des lipides a été évaluée par la méthode des substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS) décrite par Tokur et al. avec des optimisations mineures, les valeurs étant présentées comme la moyenne de trois tests indépendants et l’écart-type associé aux mesures. Dans cet essai, l’étalon commercial utilisé était le BHT et son EC50 déterminé. Le pourcentage d’inhibition de la peroxydation lipidique a été calculé selon l’équation (1).
L’essai de piégeage du radical oxyde nitrique a été réalisé en triplicat selon la méthode modifiée décrite par Sakat et al. avec quelques adaptations décrites dans [ ]. Les valeurs sont présentées comme la moyenne de trois tests indépendants et l’écart-type associé aux mesures. Le pourcentage d’inhibition a été calculé selon l’équation (1) pour D et pour l’étalon rutine.
L’inhibition de l’AChE a été réalisée en triplicat comme décrit par Falé et al. Succinctement, pour calculer l’activité enzymatique sans inhibiteur (100 % d’activité), 325 µL de tampon Tris 50 mM pH 8, 100 µL d’eau Milli-Q et 25 µL de solution d’AChE (1,33 U/mL) ont été mélangés dans une cuve et incubés, à 25 °C, pendant 15 min. Ensuite, 75 µL d’AChI (0,33 mg/mL), 475 µL de DTNB (1,2 mg/mL de tampon Tris 50 mM pH 8 contenant 0,1 M NaCl et 0,02 M MgCl₂) ont été ajoutés et l’absorbance a été lue sur le spectrophotomètre Shimadzu UV-160A, Japon, à 405 nm, pendant 4 min avec des intervalles de 10 secondes, et la vitesse initiale a été calculée. La même procédure a été réalisée avec les différents échantillons, mais au lieu d’ajouter 100 μL d’eau Milli-Q, le même volume d’une solution des divers échantillons, à 5 mg/mL, a été ajouté. Dans cet essai, l’étalon commercial utilisé était la galantamine.
Pour déterminer l’inhibition de l’activité enzymatique de l’HMGR, l’oxydation du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate hydraté (NADPH) a été évaluée en triplicat selon la méthode décrite par Mozzicafreddo et al. avec des modifications mineures. D’abord, afin de calculer l’activité enzymatique maximale (100 %), les indications du kit ont été suivies. Ensuite, des aliquotes ont été prélevées à 0, 1, 2, 4 et 6 min, la réaction a été arrêtée en ajoutant du MeOH jusqu’à un volume final de 50 %, et les échantillons ont été analysés par HPLC–DAD en utilisant le VWR-Hitachi Elite LaChrom®, mentionné en 4.4. La diminution de l’absorbance du NADPH a été suivie à 340 nm, en évaluant la diminution de l’aire du pic au cours du temps, ce qui a permis de faire une régression linéaire et d’obtenir la vitesse de réaction.
Les structures de l’AChE et de l’HMGR (PDB IDs : AChE–1B41 ; HMG–3CCT) ont été traitées comme décrit précédemment. Les ligands étudiés étaient : la gentiopicroside et une série de dérivés xanthoniques avec des combinaisons de groupes hydroxyles et méthoxy. Les optimisations de géométrie ont été réalisées avec Gaussian 09 en utilisant le niveau de théorie B3LYP et la base 6-31G(d,p). Les conformations optimisées ont été utilisées dans les calculs d’amarrage avec la suite AutoDock version 4.2.6. Dans ces calculs, l’AChE a été traitée comme un corps rigide avec quatre résidus partiellement flexibles (Tyr124, Trp286, Tyr337 et Tyr341) dans le site actif de l’enzyme. La flexibilité des résidus sélectionnés entre les carbones Cα et Cγ (deux torsions par résidu), ainsi que toutes les torsions possibles dans les ligands, ont été définies avec AutoDock Tools version 1.5.6.
L’espace de recherche des interactions possibles entre le ligand et le récepteur au sein de la région d’interaction précédemment décrite a été exploré par l’algorithme génétique lamarckien d’AutoDock (LGA). Les interactions électrostatiques ont été calculées en utilisant la fonction diélectrique de Mehler et Solmajer, tandis que les termes de liaison hydrogène et de Van der Waals ont été calculés en utilisant les paramètres AutoDock.
Les 1250 exécutions LGA ont été réalisées en utilisant les paramètres standards d’AutoDock, sauf pour le nombre d’individus dans la population (100) et le nombre maximal d’évaluations d’énergie (8 × 10⁶). Dans la procédure de regroupement (clustering), une tolérance de moyenne quadratique (RMS) de 1,0–1,5 Å a été utilisée sur les atomes lourds de la région flexible. Les modes de liaison représentatifs sélectionnés étaient les conformations de plus basse énergie appartenant aux clusters les plus peuplés.
Les résultats sont exprimés comme moyenne ± écart-type. Les différences statistiques entre les groupes, en utilisant un niveau de probabilité de p ≤ 0,05, ont été évaluées par analyse de variance à un facteur (ANOVA), disponible dans le logiciel Microsoft Office 2013®. Les corrélations ont été calculées en utilisant une droite de régression entre l’activité antioxydante mesurée avec le test DPPH et l’activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase, avec la teneur phénolique totale dans les fractions collectées.
C. erythraea, lorsqu’elle est préparée en décoction, a la capacité d’inhiber à la fois l’activité de l’AChE et celle de l’HMGR. Elle a également une activité antioxydante due à la présence de molécules de xanthones. Les études d’amarrage nous ont aidés à comprendre au niveau moléculaire et à attribuer quelle activité est due à quel type de composé dans l’extraction aqueuse. Un grand nombre de xanthones sont de bons inhibiteurs de l’AChE, tandis que les sécoiridoïdes comme la gentiopicroside peuvent inhiber l’HMGR. Cette approche top-down nous a aidés à comprendre comment un tel mélange de composés présents dans la décoction peut agir sur différents fronts pour produire les effets ethno-pharmacologiques décrits par les personnes qui consomment cette boisson médicinale.
Encart — Composés, bioactivités et niveau de preuve
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