Référence : International Journal of Molecular Sciences 2024. — PMC11240987 · DOI 10.3390/ijms25137112 Type : Article de recherche originale · Plante : Plantain lancéolé · Propriété → Antimicrobien Accès : ⭐ libre (CC BY 4.0) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
La maladie de Lyme, causée par l’infection à Borrelia burgdorferi sensu lato, est la maladie à transmission vectorielle la plus répandue dans l’hémisphère nord. Malheureusement, le recours à une antibiothérapie ciblée constitue souvent un traitement inefficace. La résistance aux antibiotiques et les symptômes récurrents de la maladie de Lyme sont associés à la formation d’agrégats de B. burgdorferi de type biofilm. Les extraits de plantes pourraient offrir une solution alternative efficace, car beaucoup d’entre eux présentent des activités antibactériennes ou d’inhibition du biofilm. Cette étude démontre le potentiel thérapeutique de Plantago major et Plantago lanceolata comme inhibiteurs de B. burgdorferi. Des extraits hydroalcooliques provenant de trois échantillons différents de chaque plante ont d’abord été caractérisés sur la base de leurs concentrations totales en polyphénols, flavonoïdes, iridoïdes et de leur capacité antioxydante. Les deux plantes contenaient des quantités substantielles des composés phytochimiques cités et ont montré des propriétés antioxydantes considérables. Les principaux constituants non volatils ont ensuite été quantifiés par analyses HPLC-DAD-MS, et les constituants volatils ont été quantifiés par HS-SPME-GC-MS. Les composés non volatils les plus abondants se sont révélés être le plantamajoside et l’actéoside, et les composés volatils les plus abondants étaient le β-caryophyllène, le D-limonène et l’α-caryophyllène. L’activité inhibitrice de B. burgdorferi des extraits a été testée sur une culture de B. burgdorferi en phase stationnaire et sa fraction biofilm. Tous les extraits ont montré une activité antibactérienne, le plus efficace abaissant la viabilité bactérienne résiduelle jusqu’à 15 %. De plus, les extraits préparés à partir des feuilles de chaque plante ont démontré en outre des propriétés d’inhibition du biofilm, réduisant sa formation de 30 %.
Les tiques peuplant les régions géographiques tempérées peuvent être porteuses d’une variété d’agents pathogènes ; parmi ceux-ci, un groupe de bactéries nommé Borrelia burgdorferi sensu lato. Actuellement, le complexe sensu lato comprend au moins vingt espèces proposées ou confirmées dans le monde, dont neuf se sont révélées capables d’infecter l’humain. Parmi celles-ci, quatre espèces, à savoir B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii et B. bavariensis, sont à l’origine de la grande majorité des cas humains de maladie de Lyme. La maladie de Lyme, ou borréliose, est un problème majeur de santé publique. Déjà la maladie à transmission vectorielle la plus fréquente de l’hémisphère nord, ses taux d’infection continuent d’augmenter à l’échelle mondiale. Les manifestations cliniques de la maladie de Lyme sont diverses. Le symptôme le plus courant de l’infection à B. burgdorferi est un érythème migrant au site de la morsure de tique. D’autres symptômes comprennent des maux de tête, une légère raideur de la nuque, une fatigue générale, de la fièvre, des arthralgies, des myalgies et une lymphadénopathie. Bien que la plupart des cas de maladie de Lyme soient traités avec succès par antibiotiques, 10 à 20 % des patients rapportent des symptômes persistants tels que fatigue, troubles cognitifs, douleurs articulaires et musculaires, et/ou dépression, désignés sous le terme de maladie de Lyme post-traitement. La pathogenèse de la maladie de Lyme chronique fait encore l’objet de débats, la discussion se concentrant sur les concepts d’infection persistante et/ou d’auto-immunité. Selon des recherches antérieures, la maladie chronique serait liée au développement de formes bactériennes résistantes. B. burgdorferi sont des bactéries pléomorphes qui peuvent modifier leur morphologie en réponse à des conditions environnementales hostiles, comme l’administration d’antibiotiques. Outre les formes spirochétales typiques, B. burgdorferi peut également former des formes sphériques, des blebs, des granules ou perles se détachant, et des agglomérations de spirochètes en colonies de type biofilm. Il existe des preuves plausibles que le pléomorphisme pourrait aider à échapper au système immunitaire ou à diminuer la sensibilité aux antibiotiques. Par conséquent, il est suggéré que les nouvelles approches thérapeutiques devraient tenir compte de l’efficacité spécifique liée aux formes morphologiques persistantes de la bactérie.
L’ethnomédecine reconnaît depuis longtemps les extraits de plantes comme une source précieuse d’agents antioxydants et antibactériens. Ces propriétés thérapeutiques utiles sont exhibées par une variété de composés phytochimiques, les métabolites secondaires bioactifs. Les recherches menées par notre groupe et par d’autres suggèrent que certains extraits de plantes pourraient également exercer des effets prometteurs dans la lutte contre la maladie de Lyme, en inhibant spécifiquement B. burgdorferi et ses formes latentes. Dans le cadre de nos recherches sur les plantes estoniennes indigènes aux propriétés antioxydantes et/ou antibactériennes connues visant à évaluer leur potentiel comme inhibiteurs de B. burgdorferi, deux espèces du genre Plantago, Plantago major et Plantago lanceolata, ont été étudiées. Les espèces de Plantago sont largement considérées comme des mauvaises herbes, pourtant elles sont utilisées comme plantes médicinales depuis des siècles. P. major et P. lanceolata ont toutes deux une histoire d’applications ethnomédicales variées en raison de leurs propriétés diverses. P. major est l’une des herbes médicinales les plus répandues au monde, et ses feuilles ont été largement utilisées pour favoriser la cicatrisation des plaies. De plus, P. major est utilisé pour traiter les infections cutanées et d’autres maladies infectieuses, ainsi que les troubles digestifs et respiratoires ; pour améliorer la circulation et la reproduction ; pour soulager la douleur et la fièvre ; et pour prévenir le cancer. Les parties aériennes de P. lanceolata seraient dotées d’effets cicatrisants, anti-inflammatoires, antibactériens, diurétiques et anti-asthmatiques. Les feuilles de P. lanceolata ont été utilisées pour traiter l’arthrite, ainsi que les affections de la bouche, de la gorge et des voies respiratoires supérieures. Elles ont également été utilisées par voie topique pour traiter les maladies de la peau.
La recherche visant à découvrir et confirmer le plein potentiel thérapeutique des extraits de Plantago demeure partiellement non concluante. Plusieurs efforts scientifiques ont été déployés pour évaluer les activités antioxydantes, anti-inflammatoires et cicatrisantes des extraits de Plantago et des composés isolés. Des études antérieures ont confirmé que les espèces de Plantago sont riches en antioxydants naturels, et que leurs extraits méthanoliques et éthanoliques présentent une activité de piégeage des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Cette propriété démontre leur potentiel comme agents contre de nombreuses maladies chroniques, notamment les maladies cardiovasculaires et neurologiques liées à l’âge, car de telles affections sont influencées ou provoquées par le stress oxydatif, autrement dit par l’abondance de ROS et d’autres radicaux libres dans l’organisme. Cependant, les résultats démontrant le potentiel antioxydant des espèces de Plantago sont difficiles à comparer en raison des différents protocoles d’extraction et méthodes d’analyse utilisés. Plusieurs études ont été menées pour confirmer les propriétés anti-inflammatoires des espèces de Plantago, en particulier P. lanceolata. Comme l’inflammation est une composante pathologique de nombreuses maladies auto-immunes, ainsi que du cancer, et comme elle pourrait jouer un rôle important dans la pathogenèse de la maladie de Lyme, la recherche de médicaments anti-inflammatoires efficaces est un domaine important de la découverte de médicaments. Les extraits de P. major et de P. lanceolata ont tous deux démontré des propriétés anti-inflammatoires et immunostimulantes. De plus, les propriétés cicatrisantes des extraits de feuilles de P. major et de P. lanceolata ont été scientifiquement prouvées par plusieurs auteurs. Il existe donc déjà des preuves de plusieurs qualités thérapeutiquement importantes des extraits de P. major et de P. lanceolata. Cependant, les propriétés antibactériennes des espèces de Plantago ne sont pas aussi minutieusement étudiées.
Les principales méthodes analytiques utilisées pour détecter et quantifier les composés phytochimiques dans les extraits de Plantago ont été la HPLC, l’CE, la GC et la MS. La RP-HPLC a été utilisée pour mesurer la teneur en aucubine, les flavonoïdes et les acides phénoliques. L’UPLC-MS/MS a été utilisée pour comparer les profils de phényléthanoïdes glycosides. La CE-MEKC a été utilisée pour quantifier deux iridoïdes glycosides, à savoir l’aucubine et le catalpol, et deux phényléthanoïdes glycosides, à savoir l’actéoside (ou verbascoside) et le plantamajoside. La LC-MS/MS en mode MRM a été utilisée pour mesurer le plantamajoside et l’actéoside. Il a donc été établi que la HPLC-MS/MS est une méthode analytique appropriée pour la détection des composés phytochimiques non volatils des extraits de Plantago. La GC-MS a été précédemment utilisée pour identifier les composés volatils dans les extraits de Plantago. La GC-MS a été employée pour analyser la teneur en triterpènes, lipides et acides aminés de l’extrait méthanolique de feuilles de P. major et pour identifier les divers composés phytochimiques extraits des feuilles de P. major et de P. lanceolata et fractionnés à l’aide de différents solvants. Jusqu’à présent, la détermination des composés volatils des deux espèces de Plantago n’a pas été bien couverte dans les recherches antérieures. Comme démontré par notre groupe, la microextraction en phase solide de l’espace de tête (HS-SPME) couplée à la GC-MS est bien adaptée pour déterminer et comparer la composition des composés volatils dans les matériaux végétaux ; elle a donc également été employée dans cette étude.
Les analyses phytochimiques ont révélé que les principaux composés bioactifs présents dans les parties aériennes des espèces de Plantago sont les phénylpropanoïdes glycosides, les iridoïdes, les triterpènes, les flavonoïdes et les acides phénoliques. Les phényléthanoïdes glycosides, le plus abondamment l’actéoside et le plantamajoside, sont les métabolites clés des espèces de Plantago. Rønsted et al. ont passé en revue les iridoïdes glycosides et les caféoyl phényléthanoïdes glycosides détectés dans les espèces de Plantago. Selon leurs recherches, P. major s’est révélé contenir de l’aucubine, du melittoside, de l’aspéruloside, du melampyroside, du plantarénaloside, de l’ixoroside, du majoroside, du 10-hydroxymajoroside, du 10-acétoxymajoroside, de l’acide géniposidique, du gardoside, de l’actéoside et du plantamajoside. Rønsted et al. ont également rapporté que P. lanceolata s’est révélé contenir de l’aucubine, du catalpol, de l’actéoside, de l’aspéruloside, de la globularine, de l’acide méthyl déacétylaspérulosidique, de l’isoverbascoside, du plantamajoside et du lavandufolioside. Turgumbayeva et al. ont étudié les composés volatils de l’extrait méthanolique de feuilles de P. major et ont trouvé principalement du lupéol, du benzimidazo[2,1-a]isoquinoléine, de l’acide palmitique et de la β-amyrine.
Rahamouz-Haghighi et al. ont fractionné les extraits de feuilles de P. major et de P. lanceolata à l’aide de différents solvants. À l’aide de la GC-MS, ils ont identifié les composés phytochimiques volatils dans ces extraits, dont beaucoup sont connus pour leurs propriétés antibactériennes. De plus, le même article a démontré que les extraits de feuilles de P. major et de P. lanceolata présentaient des effets inhibiteurs variés contre des souches bactériennes à Gram positif et à Gram négatif. Comme les antioxydants naturels, en particulier les polyphénols, se révèlent souvent être des agents antibactériens précieux, il est probable que les composés non volatils présents dans P. major et P. lanceolata puissent également exhiber des propriétés antibactériennes. Jusqu’à présent, aucune étude n’a évalué l’efficacité des extraits de Plantago dans l’inhibition de B. burgdorferi. En ce qui concerne la lutte contre la maladie de Lyme, il serait également important de déterminer si les effets antibactériens sont pareillement manifestes contre le biofilm de B. burgdorferi. Il est déjà connu que les composés phytochimiques peuvent être des agents précieux d’inhibition du biofilm, opérant par des mécanismes différents de ceux des antibiotiques. Cependant, le potentiel des espèces de Plantago dans ce domaine n’a pas encore été exploré. Enfin, il serait très avantageux de pouvoir obtenir un agent naturel inhibant B. burgdorferi à partir de la même région géographique où la maladie de Lyme se présente comme un problème de santé publique de plus en plus envahissant. Compte tenu de ces hypothèses inexplorées, cet article démontre le potentiel des extraits de P. major et de P. lanceolata à inhiber B. burgdorferi et son biofilm, et offre ainsi une nouvelle approche thérapeutique potentielle dans la lutte contre la maladie de Lyme.
Les échantillons de plantes analysés dans cette étude et les noms abrégés respectifs utilisés dans cet article sont donnés dans [ ]. Les noms abrégés ont été attribués sur la base de l’espèce végétale (PM pour P. major et PL pour P. lanceolata) et de la partie de la plante utilisée (F pour les feuilles et H pour l’herbe entière), et la dernière lettre représente le lieu d’origine du matériel végétal.
L’activité antioxydante et les teneurs totales en polyphénols, flavonoïdes et iridoïdes de chacun des six échantillons de Plantago sont données dans [ ]. Tous les échantillons de Plantago ont montré de fortes capacités antioxydantes, jusqu’à 1,83 ± 0,32 mmol TE/g pour PLFM. Les résultats les plus élevés suivants étaient ceux des extraits de PMFM, PLFJ et PMHK, avec des activités antioxydantes de 1,51 ± 0,04, 1,48 ± 0,34 et 1,20 ± 0,26 mmol TE/g, respectivement. Dans l’étude des activités antioxydantes de 30 extraits de plantes différents d’intérêt industriel publiée par Dudonné et al., les capacités antioxydantes des extraits aqueux allaient de 0,18 à 8,52 mmol TE/g. Bien qu’il y ait eu quelques échantillons avec des capacités antioxydantes supérieures à 4 mmol TE/g, la plupart des plantes étudiées présentaient des propriétés antioxydantes dans la plage de 0,2 à 1,6 mmol TE/g. Ainsi, comme les capacités antioxydantes des échantillons de Plantago de cette étude allaient de 0,6 à 1,8 mmol TE/g, un potentiel antioxydant considérable a été détecté. Dalar et al. ont précédemment constaté que les feuilles de P. lanceolata turques présentaient une teneur antioxydante de 1,6 mmol TE/g, et la plante entière une teneur antioxydante de 0,9 mmol TE/g, ce qui est comparable à nos résultats. Dalar et al. ont également rapporté que « les valeurs ORAC de la feuille de P. lanceolata étaient supérieures à celles de l’églantier (1085 ± 24,32 μmol TE/g), de la cannelle (1069 ± 5,47 μmol TE/g), de l’origan (1233 ± 41,36 μmol TE/g) et de la noix de muscade (1187 ± 8,74 μmol TE/g) – des herbes connues pour leurs fortes capacités antioxydantes et leurs bienfaits pour la santé ».
La teneur en polyphénols des extraits préparés à partir de matériaux végétaux récoltés par nous-mêmes était considérablement plus élevée que celle des extraits préparés à partir de matériaux végétaux achetés (PMFK, PMHK, PLHS), PLFM contenant le plus grand nombre de polyphénols (55,5 ± 4,8 mg GAE/g), suivi de PLFJ et PMFM (45,9 ± 0,8 et 32,7 ± 2,4 mg GAE/g, respectivement). La teneur totale en flavonoïdes suivait une tendance similaire à celle de la teneur totale en polyphénols, PLFJ (14,0 ± 0,7 mg QE/g) et PLFM (12,4 ± 1,2 mg QE/g) montrant les concentrations les plus élevées, suivis de PMFM (8,3 ± 0,2 mg QE/g). De plus, le dosage colorimétrique a confirmé que l’échantillon PLFM contenait la concentration la plus élevée en iridoïdes, à 23,4 ± 4,6 mg AE/g. Pour les autres extraits, la teneur en iridoïdes était considérablement plus faible. La concentration la plus élevée suivante a été trouvée dans l’extrait de PLHS (14,3 ± 1,4 mg AE/g), et celle d’après dans PMHK (11,4 ± 0,9 mg AE/g). Nos résultats confirment les rapports antérieurs selon lesquels les espèces de Plantago contiennent un volume significatif de polyphénols et d’iridoïdes et exercent une activité antioxydante considérable. De plus, une corrélation a été notée entre la teneur en polyphénols et l’activité antioxydante des extraits (R2 de la régression linéaire de 0,797), ce qui s’explique par la capacité antioxydante reconnue des composés phytochimiques polyphénoliques. Globalement, en considérant les valeurs moyennes pour chaque plante dans les résultats des différents tests colorimétriques, la teneur en composés bioactifs semble être plus élevée dans les extraits de P. lanceolata que dans les extraits de P. major.
Les chromatogrammes des six extraits de Plantago sont présentés dans [ ]. Tous les composés quantifiés ont été choisis sur la base des aires de pic relatives (RPA) respectives dans l’expérience HPLC-DAD, étant donné qu’au moins un des extraits présentait un pic avec une RPA égale ou supérieure à 0,2 à ce moment. Sur la base de cette sélection, un total de 40 constituants uniques ont été quantifiés. Outre le temps de rétention sur le chromatogramme, les spectres de fragmentation MS/MS ont été pris en compte pour apparier les constituants phytochimiques de temps de rétention similaire provenant de différents extraits. Seuls les deux pics les plus significatifs sur tous les chromatogrammes — le plantamajoside (Rt = 10,9 min) et l’actéoside (Rt = 11,5 min) — ont été identifiés et quantifiés à l’aide d’étalons de référence [ ]. Tous les autres pics ont été quantifiés à l’aide de l’un des étalons de référence disponibles, en appariant les spectres d’absorption du pic avec l’exemple le plus similaire parmi les composés étalons. Les étalons de référence, ainsi que leurs temps de rétention et courbes de régression respectifs, étaient les suivants : acide chlorogénique (Rt = 8,2 min, y = 0,0129x + 0,0227) ; plantamajoside (Rt = 10,9 min, y = 0,0062x + 0,016) ; actéoside (Rt = 11,5 min, y = 0,0073x + 0,0433) ; lutéoline (Rt = 16,4 min, y = 0,0424x + 0,0177) ; apigénine (Rt = 18,3 min, y = 0,0355x + 0,0571). Tous les pics quantifiés, les données d’absorption et de quantification respectives, ainsi que les ions moléculaires correspondants et les schémas de fragmentation MS/MS sont donnés dans [ ].
La concentration combinée la plus élevée de composés phytochimiques a été trouvée dans l’extrait de PLFM, s’élevant à 4694,1 ± 211,3 mg/L (correspondant à 93,9 ± 4,2 mg/g dans le matériel végétal séché à l’air), suivi d’un autre extrait de feuilles de P. lanceolata, PLFJ, à une concentration totale de 4074,8 ± 150,3 mg/L (81,5 ± 3,0 mg/g), puis de l’extrait de feuilles de P. major, PMFM, à 2934,0 ± 103,4 mg/L (58,7 ± 2,1 mg/g). Les extraits PMHK (1572,9 ± 57,9 mg/L, 31,5 ± 1,2 mg/g), PLHS (1268,5 ± 83,1 mg/L, 25,4 ± 1,7 mg/g) et PMFK (1100,0 ± 42,7 mg/L, 22,0 ± 0,9 mg/g) ont montré des concentrations plus faibles de composés phytochimiques non volatils. Ainsi, la teneur phytochimique totale montre une distinction entre le matériel végétal fraîchement récolté et celui acheté, ce dernier contenant des quantités significativement plus faibles de constituants phytochimiques. Parmi tous les composés quantifiés, le plantamajoside était celui trouvé à la concentration la plus élevée parmi les extraits de P. major, la concentration la plus élevée étant de 1693,0 ± 65,6 mg/L (33,9 ± 1,3 mg/g) dans l’extrait de feuilles de P. major, PMFM. L’actéoside était le composé trouvé à la concentration la plus élevée parmi les extraits de P. lanceolata, la concentration la plus élevée étant de 3309,0 ± 249,8 mg/L (66,2 ± 5,0 mg/g) dans l’extrait de feuilles de P. lanceolata, PLFM, suivi de 1652,6 ± 163,5 mg/L (33,1 ± 3,3 mg/g) dans l’extrait d’herbe de P. lanceolata, PLFJ. En comparant les chromatogrammes et la teneur phytochimique au sein des extraits de la même espèce, il existe des différences nettes tant dans le profil chromatographique que dans les concentrations des constituants. Cependant, la distinction principale serait la différence relative dans la quantité et le contenu des composés phytochimiques entre le matériel récolté par nous-mêmes et le matériel acheté. Concernant la variété des composés quantifiés, l’extrait de P. lanceolata PLFJ se démarque du reste avec 23 composés phytochimiques uniques, suivi de PMFM et PLFM, tous deux à 13 chacun, puis de PMHK à 8, PLHS à 7 et PMFK à 6. Par conséquent, tant la quantité totale que la variété des composés non volatils dans les extraits sont considérablement différentes selon la méthode d’acquisition de la matière première.
Les deux composés phytochimiques trouvés aux concentrations les plus élevées, le plantamajoside et l’actéoside, ont tous deux démontré des propriétés bénéfiques. Le plantamajoside a été rapporté comme exhibant des activités antibactériennes, antiallergiques, anti-inflammatoires, antioxydantes et inhibitrices d’enzymes. L’actéoside a montré exercer des effets antioxydants, anti-inflammatoires, antimicrobiens et anticancéreux. Bien que tout effet spécifique démontré dans notre travail par l’extrait entier soit certainement synergique et dérivé de l’ensemble du contenu phytochimique, comme ces deux phénylpropanoïdes glycosides constituent une part significative de l’ensemble du contenu phytochimique non volatil, il serait raisonnable de supposer que les effets bénéfiques sont largement liés aux propriétés bénéfiques de ces deux composés phytochimiques. Cette hypothèse est discutée plus en détail dans [ ].
Tous les composés phytochimiques volatils comprenant plus de 1,0 % de la teneur volatile totale détectée dans les échantillons de Plantago sont donnés dans [ ]. La plupart des composés quantifiés dans cette étude ont également été trouvés dans un article publié précédemment, où l’huile essentielle de P. lanceolata a été isolée par une procédure d’hydrodistillation. Nos résultats HS-SPME-GC-MS démontrent que le composé phytochimique volatil en excès dans tous les extraits analysés est le β-caryophyllène, avec la concentration la plus élevée apparente dans l’échantillon de feuilles de P. major, PMFM, à 38,9 %, et dans tous les autres échantillons, au-delà de 20 %. Hormis la concentration remarquablement élevée dans PMFM, il n’y a pas de différence substantielle dans la concentration en β-caryophyllène entre les autres échantillons. Le β-caryophyllène est rapporté comme exhibant plusieurs activités biologiques, notamment antioxydante et anti-inflammatoire. Le D-limonène est présent dans un échantillon de feuilles de P. major, PMFK, et deux échantillons de feuilles de P. lanceolata, PLFM et PLFJ, comme le composé volatil à la deuxième concentration la plus élevée, à 6,0 %, 10,3 % et 11,6 %, respectivement, et comme le composé volatil à la troisième concentration la plus élevée dans deux échantillons de feuilles de P. major, PMFM et PMFK, à 6,9 % et 6,0 %, respectivement. Le D-limonène s’est précédemment révélé exhiber des effets antioxydants et anti-inflammatoires. L’α-caryophyllène a été trouvé à la deuxième concentration la plus élevée dans les trois échantillons de P. major, PMFM, PMFK et PMHK, à 9,1 %, 6,0 % et 6,1 %, respectivement, et à la troisième concentration la plus élevée dans deux échantillons de P. lanceolata, PLFJ et PLHS, à 5,5 % et 5,6 %, respectivement. L’α-caryophyllène est supposé exhiber des effets antibactériens. L’anéthole a été trouvé à la deuxième concentration la plus élevée dans l’échantillon de P. major PMHK (à égalité avec la carvone), et les échantillons de P. lanceolata, PLFM et PLHS, à 4,0 %, 6,0 % et 7,4 %, respectivement. L’anéthole a démontré exercer des propriétés antimicrobiennes et antioxydantes. Par conséquent, les activités thérapeutiques bénéfiques liées aux principaux composés volatils présents dans les échantillons de P. major et de P. lanceolata ont renforcé l’hypothèse selon laquelle ces plantes sont bien adaptées à de nouvelles approches thérapeutiques.
Les pourcentages de viabilité résiduelle de la culture de B. burgdorferi en phase stationnaire après une semaine d’incubation avec les extraits de Plantago sont présentés dans [ ]. Tous les extraits ont exhibé une activité réductrice de la viabilité de B. burgdorferi. Les extraits qui ont montré les effets inhibiteurs les plus forts contre la bactérie étaient l’extrait de feuilles de P. major, PMFM, et les extraits de feuilles de P. lanceolata, PLFM et PLFJ, à 17,6 ± 15,8 %, 23,6 ± 6,5 % et 14,7 ± 0,5 % de viabilité résiduelle, respectivement. Aucune différence statistiquement significative n’a été notée entre les trois meilleurs inhibiteurs de la culture de B. burgdorferi en phase stationnaire. En comparant les résultats d’efficacité antibactérienne avec la teneur phytochimique des extraits [ ], il est évident que les trois extraits les plus riches en composés phytochimiques (PMFM, PLFJ et PLFM) sont aussi les plus puissants contre B. burgdorferi en phase stationnaire. Tant l’extrait ayant la teneur phytochimique totale la plus élevée et la teneur en actéoside la plus élevée (PLFM) que l’extrait ayant la teneur en plantamajoside la plus élevée (PMFM) figurent parmi les antibactériens les plus efficaces, de même que l’extrait contenant le plus grand nombre de composés phytochimiques non volatils uniques (PLFJ). Pour tester le potentiel antibactérien du plantamajoside et de l’actéoside individuellement, B. burgdorferi en phase stationnaire ont été incubés avec les solutions éthanoliques des étalons de référence à des concentrations comparables aux concentrations les plus élevées auxquelles ces composés ont été déterminés dans le matériel végétal, c’est-à-dire 1750 mg/L (comparable à PMFM) et 3500 mg/L (comparable à PLFM), respectivement. Les résultats, présentés dans [ ], démontrent que les deux composés ont montré une activité antibactérienne (qui était dépendante de la concentration lors de l’abaissement des doses respectives). L’effet inhibiteur du plantamajoside n’était pas au niveau de PMFM. Cependant, il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre l’efficacité antibactérienne de l’actéoside et de PLFM. Étant donné que les deux autres extraits qui figuraient parmi les antibactériens les plus efficaces ne contenaient pas des concentrations aussi élevées d’actéoside, ce composé seul ne pouvait pas être tenu responsable des propriétés inhibitrices de B. burgdorferi des extraits de Plantago. Cela conduirait à la conclusion que les effets inhibiteurs de B. burgdorferi sont exercés le plus avantageusement par l’action synergique d’une variété de composés phytochimiques présents dans les extraits de Plantago. Les extraits les plus efficaces contenaient également les nombres les plus élevés de composés phytochimiques non volatils individuels, PLFJ (23 au total), suivi de PMFM et PLFM (tous deux à 13). Les trois autres extraits, PMFK, PMHK et PLHS, exhibant les nombres et concentrations les plus faibles de composés phytochimiques, exhibent également la moindre activité antibactérienne (sans différences statistiquement significatives entre ces efficacités). Par conséquent, il est d’une importance vitale que toute approche thérapeutique future utilise du matériel végétal fraîchement récolté pour maximiser le potentiel antibactérien de P. major et de P. lanceolata.
Les effets inhibiteurs de B. burgdorferi des extraits de Plantago ont ensuite été évalués sur la fraction biofilm. Les effets antibactériens spécifiques au biofilm des extraits et des deux composés phytochimiques, le plantamajoside et l’actéoside (à des concentrations comparables aux concentrations respectives les plus élevées trouvées dans les extraits de Plantago), sont présentés dans [ ]. Les inhibiteurs les plus efficaces de la croissance du biofilm étaient les extraits PMFM et PLFM, réduisant tous deux le volume du biofilm jusqu’à 30 %. Ces deux extraits ont également exhibé les effets antibactériens les plus forts sur l’ensemble de la culture en phase stationnaire. Le troisième extrait ayant l’activité antibactérienne la plus forte sur l’ensemble de la culture de B. burgdorferi, PLFJ, n’a pas réduit la formation de biofilm. Il semble que, de manière similaire aux propriétés antibactériennes sur l’ensemble de la culture en phase stationnaire, l’activité spécifique au biofilm soit portée par l’effet combiné du mélange phytochimique de l’extrait brut entier, car le plantamajoside et l’actéoside individuellement n’ont pas réussi à abaisser la teneur en biofilm à un degré similaire à celui des extraits ayant les concentrations les plus élevées de ces composés, c’est-à-dire PMFM et PLFM.
En comparant l’efficacité des extraits sur l’ensemble de la culture en phase stationnaire à leur pouvoir réducteur de biofilm, il est évident que ces deux effets ne sont pas corrélés. Nos résultats concordent avec la notion précédemment démontrée selon laquelle les agents qui réduisent la formation de biofilm n’affectent pas nécessairement la viabilité bactérienne, car ces deux fonctions inhibitrices sont portées par une variété de mécanismes moléculaires différents. Par conséquent, il est d’autant plus remarquable que les extraits ayant la teneur phytochimique la plus élevée parmi les échantillons de P. major et de P. lanceolata, PMFM et PLFM, aient montré un potentiel comme agents réducteurs de biofilm en plus de leur efficacité comme réducteurs de la viabilité bactérienne. Les feuilles de P. major et de P. lanceolata sont donc des sources précieuses pour les recherches futures sur de nouvelles solutions contre la maladie de Lyme chronique. En considérant le potentiel thérapeutique de P. major et de P. lanceolata, nous avons démontré que ces plantes contiennent des composés antibactériens utiles, dont certains aident en outre à l’inhibition de la formation du biofilm de B. burgdorferi.
De l’eau ultrapure (≥18 MΩcm) produite au laboratoire à l’aide d’un système de purification d’eau Milli-Q (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) a été utilisée pour préparer toutes les solutions aqueuses et comme éluant HPLC. L’autre éluant HPLC, l’acétonitrile (≥99,9 %), a été acheté chez Honeywell (Offenbach am Main, Allemagne). L’acide formique (≥99,0 %), utilisé dans les éluants HPLC, a été acheté chez Fisher Chemical (Pardubice, République tchèque). Le solvant d’extraction éthanol (96,7 %) a été obtenu auprès de Magnum Veterinaaria AS, Harjumaa, Estonie. La teneur totale en polyphénols des extraits a été évaluée à l’aide du réactif de Folin–Ciocalteu 2 M, acheté chez Sigma-Aldrich (Buchs, Suisse), et du carbonate de sodium anhydre, acheté chez Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Allemagne). Les solutions étalons utilisées ont été préparées à partir de monohydrate d’acide gallique (Sigma-Aldrich, Pékin, Chine) et d’éthanol à 96,7 % (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne). Pour la détection de la teneur totale en flavonoïdes, du chlorure d’aluminium, obtenu chez Fluka (Buchs, Suisse), a été utilisé. Les solutions étalons ont été préparées à partir de quercétine (≥99,0 %, Lachema/Chemapol, Brno, République tchèque) et de méthanol (≥99,9 %, Honeywell, Charlotte, NC, USA). La teneur totale en iridoïdes a été déterminée à l’aide du réactif de Trim-Hill, préparé à partir d’acide acétique anhydre (≥99,0 %, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne), d’acide chlorhydrique à 37 % (Honeywell/Fluka, Vienne, Autriche) et de sulfate de cuivre pentahydraté (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne). Les solutions étalons ont été préparées à l’aide d’aucubine (≥98 %) achetée chez Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA. Le sel de sodium de fluorescéine (≥98,5 %) et l’AAPH (dichlorhydrate de 2,2′-azobis(2-méthylpropionamidine), 97 %), utilisés dans les études d’antioxydativité, ont été achetés chez Fluka (Buchs, Suisse) et Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Allemagne), respectivement. Les solutions étalons ont été préparées à partir de Trolox (acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique, 97 %), acheté chez Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Allemagne). Les composés étalons utilisés pour la quantification phytochimique, le plantamajoside (99,5 %) et l’actéoside (99,8 %), ont été achetés chez MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA. L’acide chlorogénique (≥95 %), la lutéoline (≥98 %), l’apigénine (≥95 %) et l’étalon interne, le bicalutamide (≥99,8 %), ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Allemagne).
Les échantillons de plantes ont été nommés PMFM, PMFK, PMHK, PLFM, PLFJ et PLHS (abréviations expliquées ci-dessous), choisis pour représenter trois échantillons de P. major et de P. lanceolata chacun, les deux sélections contenant deux échantillons de feuilles et un d’herbe (la partie aérienne entière de la plante). Le matériel végétal des échantillons PMFM, PLFM et PLFJ a été récolté dans des jardins privés en juillet 2022. Pour les échantillons PMFM et PLFM, les feuilles de P. major et les feuilles de P. lanceolata, respectivement, ont été obtenues à Matsalu, Estonie. L’échantillon PLFJ, feuilles de P. lanceolata, a été obtenu à Jälgimäe, Estonie. L’identification des échantillons de plantes de PMFM, PLFM et PLFJ a été effectuée par Toomas Kukk, et des spécimens de référence (TAA0166882–TAA0166884) ont été déposés dans l’Herbier de l’Institut des services agricoles et environnementaux (TAA) de l’Université estonienne des sciences de la vie. Le matériel végétal des échantillons PMFK et PMHK a été acheté auprès de Kubja Ürditalu, Estonie, sous forme de feuilles et d’herbes de P. major, respectivement. L’échantillon PLHS, herbe de P. lanceolata, a été acheté auprès de Salus, Allemagne. Le matériel végétal récolté par nous-mêmes a été séché à l’air à température ambiante. Les échantillons achetés avaient été préalablement séchés. La teneur en humidité de tous les échantillons a été mesurée à l’aide d’un analyseur d’humidité Ohaus (Parsippany, NJ, USA) et déterminée comme suit : PMFM — 7,50 % ; PMFK — 6,89 % ; PMHK — 5,68 % ; PLFM — 6,48 % ; PLFJ — 7,16 % ; PLHS — 6,07 %. Tout le matériel végétal étudié a été conservé à température ambiante dans un espace sombre avant la procédure d’extraction.
Les plantes séchées ont été finement broyées à l’aide d’un moulin à café Bomann KSW 445 CB (Jinhua, Chine). L’extraction a été réalisée en utilisant de l’éthanol à 60 % comme solvant ; le rapport poudre de plante/solvant était de 1:20 (p/v). La procédure d’extraction consistait en 30 min d’agitation à l’aide d’un agitateur orbital DOS-20M (Riga, Lettonie) à 250 tr/min (avec un changement de direction après 99 tr), puis une sonication à 640 W (350 kHz) dans un bain SonorexTM Digital 10P (Bandelin, Berlin, Allemagne) pendant 30 min à 35 °C. L’extrait a ensuite été filtré sous vide à travers un filtre SartoriusTM 3 h (70 mm, 65 g/m3) (Sartorius, Aubagne, France). Les extraits ont été centrifugés avant toute utilisation expérimentale et conservés dans un réfrigérateur sombre à 4 °C entre les expériences.
Les concentrations totales des groupes de composés bioactifs dans les plantes ont été quantifiées via des tests colorimétriques : les polyphénols via Folin–Ciocalteu, les flavonoïdes via AlCl3, et les iridoïdes via la méthode de Trim–Hill. Toutes les analyses colorimétriques ont été menées sur le spectrophotomètre UV-Vis Varian Cary 50 Bio (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), soit à l’aide de cuves en plastique de 1,5 mL (NovaNatura, Casaleggio Novara, Italie) dans les analyses de polyphénols et de flavonoïdes, soit à l’aide de cuves en quartz de 0,7 mL (Hellma, Müllheim, Allemagne) dans les analyses d’iridoïdes. La teneur totale en polyphénols des extraits a été déterminée à l’aide de solutions de calibration de 10, 25, 50, 75 et 100 mg/L d’acide gallique dans l’éthanol, préparées à partir d’une solution mère de 5 g/L. Les solutions de calibration pour la quantification des teneurs en flavonoïdes ont été préparées à des concentrations de 2, 5, 10, 20 et 40 mg/L de quercétine dans le méthanol, préparées à partir d’une solution mère de 2 g/L. Les solutions de calibration pour les mesures de teneur en iridoïdes ont été préparées à des concentrations de 100, 200, 400, 800 et 1000 mg/L d’aucubine dans l’éthanol à 60 % à partir d’une solution mère de 1 g/L. Tous les échantillons ont été mesurés en triplicata, et les résultats ont été donnés en mg d’équivalents moyens d’acide gallique, de quercétine ou d’aucubine par g de matériel végétal séché (mg GAE/QE/AE par g) ± écart-type [ ], calculés sur la base du rapport matériel végétal (g)/solvant (mL) utilisé pour l’extraction (1:20).
L’activité antioxydante de tous les extraits a été évaluée à l’aide de la méthode ORACFL (capacité d’absorption des radicaux oxygène) avec des modifications mineures telles que décrites par Naguib. La solution mère de fluorescéine 24,25 mM, la solution mère de Trolox 30 mM et la solution d’AAPH 600 mM ont toutes été préparées quotidiennement dans un tampon phosphate 100 mM (pH = 7,4). Le volume total du mélange réactionnel était de 3 mL ; le mélange était composé de 2,7 mL de fluorescéine 0,5 nM (diluée dans le tampon phosphate) et de 100 µL de dilution d’échantillon ou de Trolox, qui a été incubé à 37 °C pendant 3 min ; puis 200 µL d’AAPH 600 mM ont été ajoutés. Les échantillons ont été mesurés avec un spectrophotomètre à fluorescence Hitachi F-7000 (Chiyoda, Tokyo, Japon) à λex/em 495/520 nm, fentes de 5 nm, et le balayage temporel a été enregistré pendant 3000 s une fois par seconde. Les solutions de calibration ont été préparées à partir d’une solution de Trolox 300 µM diluée à des concentrations finales de 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 et 10 µM dans le mélange réactionnel, et la calibration a été donnée comme le changement d’aire sous la courbe par rapport à 0 µM de Trolox (échantillon blanc). Tous les extraits ajoutés au mélange réactionnel avaient été préalablement dilués 500 fois dans le tampon phosphate. En raison des effets de matrice apparents dans les échantillons dilués d’extraits d’éthanol à 60 %, les échantillons de calibration ont été préparés dans l’éthanol à 60 % dilué 500 fois dans le tampon phosphate. Tous les échantillons ont été mesurés en triplicata et les résultats donnés en mg d’équivalents moyens de Trolox par g de matériel végétal séché (mg TE/g) ± écart-type [ ], calculés sur la base du rapport matériel végétal (g)/solvant (mL) utilisé pour l’extraction (1:20).
Les solutions étalons de 1 mg/mL d’acide chlorogénique, de lutéoline, d’apigénine, et les solutions de 5 mg/mL de plantamajoside et d’actéoside ont été préparées dans l’éthanol et diluées pour créer des courbes de calibration pour les analyses HPLC-DAD quantitatives. Les courbes de calibration ont été construites sur la base du signal UV à 254 nm (fente 4 nm) à l’aide de l’aire de pic relative (rapport de l’aire de pic d’un composé étalon à l’aire de pic de l’étalon interne bicalutamide). Une solution éthanolique d’étalon interne à 2 g/L a été ajoutée à une concentration finale de 40 mg/L dans tous les échantillons. Les courbes de calibration pour l’acide chlorogénique, la lutéoline, l’apigénine et le plantamajoside ont été construites dans les gammes de concentration de 5 à 250 mg/L. La courbe de calibration pour l’actéoside allait de 10 à 500 mg/L. Les composés phytochimiques sur les chromatogrammes qui n’ont pas été identifiés à l’aide d’un étalon de référence ont été mesurés quantitativement à l’aide de l’une de ces cinq courbes de calibration en appariant le composé avec un étalon de référence sur la base des similitudes dans les spectres d’absorption UV respectifs (mesurés dans la gamme de 200 à 400 nm). Ces sélections et concentrations respectives sont données dans [ ]. Les pics chromatographiques avec une aire de pic relative (RPA) inférieure à 0,2 sur tous les chromatogrammes des différents extraits ont été exclus de [ ]. Tous les constituants chromatographiques quantifiés avaient une RPA de 0,2 pour au moins un des extraits. Lorsqu’un autre extrait montrait un pic non quantifiable (RPA<0,2) avec le même temps de rétention (et le même schéma de fragmentation MS/MS), il était marqué « <LOQ » dans [ ] ; et lorsqu’aucun pic n’était détecté (RPA<0,1), il était marqué « n.d. » dans [ ].
Avant les analyses HPLC-DAD-MS/MS, les extraits de plantes ont été centrifugés ; puis l’échantillon a été dilué deux fois dans l’eau ultrapure et additionné de l’étalon interne bicalutamide à une concentration finale de 40 mg/L. Le volume d’échantillon injecté était de 5 µL. Les analyses HPLC-DAD-MS/MS ont été menées à l’aide d’un instrument Agilent 1260 Infinity II (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) avec une colonne Agilent Poroshell 120 EC-C18 — taille des particules : 2,7 µm ; dimensions 4,6 × 100 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) — thermostatée à 28 °C. La phase mobile était constituée d’eau ultrapure (A) et d’acétonitrile (B), toutes deux acidifiées avec 0,1 % (v/v) d’acide formique. La procédure d’élution était un gradient linéaire augmentant de 5 % à 50 % B (0–20 min), puis de 50 % à 95 % B (20–25 min), isocratique 95 % B (25–30 min), un gradient linéaire diminuant de 95 % à 5 % B (30–30,01 min), et isocratique 5 % B (30,01–35 min). Le débit a été maintenu à 0,6 mL/min. La colonne a été couplée à un DAD Infinity 1260 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), les chromatogrammes ont été enregistrés à la longueur d’onde d’absorbance UV de 254 nm (fente 4 nm), et les spectres DAD ont été enregistrés dans la gamme de 200 à 400 nm. Après l’analyse DAD, l’échantillon a été analysé à l’aide du spectromètre de masse LC/MSD Trap XCT (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) équipé d’une source d’ionisation par électronébulisation. Les spectres de masse ont été enregistrés en mode ions négatifs dans la gamme m/z de 100 à 1000. L’azote a été utilisé comme gaz de nébulisation et de séchage, et l’hélium a servi de gaz de collision. Les schémas de fragmentation MS/MS (générés à l’aide des paramètres MS/MS automatiques du logiciel Bruker Daltonics DataAnalysis 5.0) ont été utilisés pour identifier, à titre provisoire, les composés pour lesquels aucun étalon de référence n’était disponible.
La procédure SPME a été réalisée sur une fibre PDMS/DVB Stabile Flex (revêtement poly-diméthylsiloxane/divinylbenzène d’épaisseur 65 μm, Supelco, Bellefonte, PA, USA) à l’aide d’un support de fibre SPME manuel (Supelco-57330-U). La fibre SPME a été conditionnée selon les instructions du fabricant avant la première utilisation. Une quantité de 50 mg de l’échantillon séché et pulvérisé a été placée dans un flacon en verre de 1,5 mL et fermée. Les flacons ont été thermostatés pendant 15 min à 50–55 °C pour effectuer l’extraction dans l’espace de tête des composés volatils du matériel végétal. La fibre a ensuite été retirée de l’aiguille et insérée dans le port d’injection GC, où les analytes ont été thermiquement désorbés pour l’analyse GC-MS. Les séparations chromatographiques ont été réalisées sur un système GC Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) 7890A équipé d’un liner splitless ultra-inerte (Agilent Technologies, type 5190-2293). Le chromatographe en phase gazeuse a été couplé à un spectromètre de masse Agilent 5975C avec une source d’ionisation électronique et un analyseur de masse quadripolaire. Le débit du gaz vecteur (hélium 6.0, AGA, Tallinn, Estonie) a été maintenu constant à 1,2 mL/min, et les composés ont été séparés dans une colonne capillaire ZB-5plus (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). La température de l’injecteur a été maintenue à 275 °C, l’injection a été réalisée en mode splitless pendant 2 min. Le programme de température de four suivant a été utilisé : la température initiale était de 35 °C ; puis elle a été augmentée à 200 °C (5 °C min−1) puis à 280 °C (20 °C min−1, maintenue pendant 2 min). La durée totale de l’analyse était de 39 min, à partir de l’introduction de la fibre dans le bloc d’injection. L’ionisation de l’analyte a été réalisée en mode d’ionisation électronique en utilisant une énergie d’électrons de 70 eV. Les températures de l’interface, de la source d’ions et de l’analyseur de masse ont été réglées à 280, 230 et 150 °C, respectivement. Le mode balayage dans la gamme de 20–500 m/z a été utilisé pour surveiller tous les analytes. Tous les échantillons ont été analysés trois fois pour confirmation. Tous les composés ont été déterminés par la bibliothèque du National Institute of Standards and Technology 17 (NIST 17), et les logiciels Agilent MassHunter Qualitative, Quantitative et Unknowns Analysis ont été utilisés pour l’analyse des données. L’identification des composés reposait sur l’obtention d’un facteur de correspondance ≥800 dans la bibliothèque MS NIST et d’un facteur de correspondance ≥80 dans le logiciel MassHunter Unknowns Analysis (version 12.0). Pour garantir la confiance dans l’identification, un analyste expérimenté a inspecté visuellement les spectres de masse de tous les composés discutés dans cet article.
Des isolats de faible passage (≤8) de la souche B31 de B. burgdorferi ont été obtenus auprès de l’American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). B. burgdorferi a été cultivé dans un milieu BSK-H avec 6,67 % de sérum de lapin. Tous les milieux de culture ont été stérilisés par filtration à l’aide d’un filtre de 0,2 µm. Les cultures ont été incubées dans des tubes coniques fermés stériles de 50 mL à 33 °C dans 5 % de CO2 sans antibiotiques. Après incubation pendant 7 jours, la culture de B. burgdorferi est entrée en phase stationnaire (~107 spirochètes/mL), suivie du transfert des cultures bactériennes dans des microplaques de culture tissulaire de 96 puits pour le criblage de l’activité inhibitrice de B. burgdorferi des extraits.
Pour évaluer l’activité des extraits de Plantago contre B. burgdorferi en phase stationnaire, les sondes ont été ajoutées à 100 µL de la culture de B. burgdorferi âgée de sept jours dans la plaque de 96 puits ; chaque extrait a été ajouté à six puits, 5 µL par puits. L’expérience entière a été répétée en triplicata pour chaque échantillon. Toutes les plaques ont été incubées à 33 °C dans 5 % de CO2 pendant les 7 jours suivants. Des cultures témoins (dans 6 + 6 puits par plaque) ont été incubées parallèlement à celles traitées avec les extraits. L’effet des antibiotiques sur la culture en phase stationnaire a été testé, et une solution d’un mélange d’antibiotiques doxycycline, daptomycine et céfopérazone à une concentration finale de 50 µM a été utilisée comme témoin positif. Les cellules vivantes et mortes ont été évaluées à l’aide du dosage SYBR Green I/iodure de propidium (PI), et le pourcentage de viabilité a été calculé au moyen d’une équation de régression générée. Pour estimer la viabilité résiduelle de B. burgdorferi après incubation avec les extraits, le dosage SYBR Green I/PI a été effectué comme décrit par Feng et al. Brièvement, 5 µL de SYBR Green I (stock 100 ×, Invitrogen, Waltham, MA, USA) et 5 µL d’iodure de propidium (0,5 mM, Sigma, St. Louis, MO, USA) ont été chacun ajoutés à trois puits par extrait. Les plaques ont été incubées à l’obscurité pendant 15 min à 33 °C. Les mesures de fluorescence ont été prises, avec λex à 450 nm, λem à 535 nm (émission verte) et 635 nm (émission rouge) pour les puits contenant respectivement du SYBR Green I et du PI, de la plaque de criblage, à l’aide d’un lecteur de microplaques TECAN Genios Pro (Männedorf, Suisse). De plus, des suspensions de B. burgdorferi à cinq proportions différentes (0:10, 2:8, 5:5, 8:2, 10:0) de cellules vivantes/mortes ont été mélangées et chacune ajoutée à 6 puits de la plaque de 96 puits. Ensuite, les réactifs SYBR Green I et PI ont été chacun ajoutés à trois puits par chacun des cinq échantillons, et les rapports de fluorescence verte/rouge pour chaque échantillon de B. burgdorferi vivant/mort ont été mesurés. À l’aide d’une analyse d’ajustement par les moindres carrés, l’équation de régression et la courbe de régression de la relation entre le pourcentage de bactéries vivantes et les rapports des signaux de fluorescence verte/rouge ont été obtenus. L’équation de régression a été utilisée pour calculer le pourcentage de cellules vivantes dans chaque puits de la plaque de criblage, aboutissant à l’estimation de la viabilité résiduelle.
L’efficacité des extraits sur le biofilm a été déterminée en quantifiant la fraction de biomasse, à l’aide de la coloration au cristal violet telle que précédemment publiée par Woolard et al., avec quelques modifications. Après la période d’incubation, les milieux ont été lentement écartés, laissant derrière eux les biofilms attachés à la surface de la plaque. Les plaques de biofilm ont ensuite été immergées dans du PBS pour éliminer par lavage toute bactérie non adhérente restante, et fixées à la chaleur (pendant 1 h à 60 °C). Les biofilms ont ensuite été colorés avec une solution de cristal violet à 2 % pendant 5 min et lavés deux fois par immersion dans l’eau ultrapure avant que le colorant lié ne soit libéré avec de l’acide acétique glacial à 33 %. La croissance du biofilm a ensuite été quantifiée en mesurant la densité optique du colorant solubilisé à 570 nm à l’aide du lecteur de microplaques TECAN Genios Pro, en normalisant le volume de biofilm dans l’échantillon témoin à 100 %.
L’analyse statistique des résultats d’efficacité antibactérienne a été réalisée à l’aide d’une analyse de variance à un facteur (ANOVA) avec le test de comparaisons multiples de Bonferroni. Toutes les mesures représentent les données d’au moins trois expériences indépendantes, données sous forme de moyenne ± écart-type. Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de GraphPad Prism version 10.2.3.
Trois échantillons de P. major et de P. lanceolata ont été étudiés pour déterminer leur contenu phytochimique, leur potentiel antioxydant et leur effet antibactérien spécifique contre la culture de B. burgdorferi en phase stationnaire et sa fraction biofilm. Il a été démontré que ces plantes contiennent de grandes quantités de polyphénols et exhibent une capacité antioxydante considérable. Plusieurs rapports font état des propriétés bénéfiques tant des principaux composés non volatils (plantamajoside, actéoside) que des composés volatils (β-caryophyllène, D-limonène, α-caryophyllène) trouvés dans les échantillons de Plantago, notamment des effets antioxydants, anti-inflammatoires et antibactériens ; ainsi, ces résultats indiquent le potentiel de ces plantes dans les approches thérapeutiques antibactériennes. Les tests antibactériens spécifiques sur la culture de B. burgdorferi en phase stationnaire ont révélé que la viabilité résiduelle de la bactérie était aussi basse que 15 %, et que le plantamajoside et l’actéoside exhibent également des propriétés inhibitrices de B. burgdorferi. Enfin, l’activité inhibitrice de la formation de biofilm des extraits a été testée. Par rapport à l’échantillon témoin, le volume de biofilm de B. burgdorferi a été réduit de 30 % pour deux extraits, préparés à partir de feuilles de P. major et de P. lanceolata. Par conséquent, il a été démontré que P. major et P. lanceolata, tous deux présents dans plusieurs régions géographiques affectées par la maladie de Lyme, sont des ressources prometteuses pour de nouvelles approches thérapeutiques antibactériennes contre l’agent causal de la maladie, B. burgdorferi. De plus, comme la réduction de la viabilité bactérienne et l’inhibition de la formation de biofilm sont exercées par des mécanismes différents, il est remarquable que les extraits de feuilles de P. major et de P. lanceolata aient exhibé ces deux effets simultanément. Ces résultats initiaux sont prometteurs, mais des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre pleinement les mécanismes moléculaires responsables des propriétés antibactériennes et d’inhibition du biofilm, et pour commencer à développer des stratégies thérapeutiques pratiques.
Activité antioxydante confirmée (jusqu’à 1,83 mmol TE/g pour le plantain lancéolé PLFM, comparable aux herbes réputées antioxydantes) + activité anti-Borrelia (Lyme) : tous les extraits réduisent la viabilité de B. burgdorferi en phase stationnaire jusqu’à ~15 % de viabilité résiduelle, et les extraits de feuilles réduisent la formation de biofilm de 30 %. Composés majeurs : plantamajoside et actéoside (non volatils) ; β-caryophyllène, D-limonène, α-caryophyllène (volatils). Le matériel fraîchement récolté est nettement plus riche que le matériel acheté. Niveau de preuve : étude in vitro (souche B31), preuve de concept ; les auteurs soulignent que des recherches supplémentaires sont nécessaires — pas d’essai clinique.
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