Référence : Molecules 2021. — PMC8038090 · DOI 10.3390/molecules26071939 Type : étude in vitro (inhibition de la xanthine oxydase) · Plante : Reine des prés · Propriété → Anti-inflammatoire Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Filipendula ulmaria est une plante couramment utilisée pour traiter plusieurs pathologies, telles que la diarrhée, les ulcères, les douleurs, les maux d’estomac, les fièvres et la goutte. Notre étude s’est concentrée sur l’utilisation de F. ulmaria dans le traitement de la goutte. Nous avons d’abord étudié la composition chimique d’un extrait méthanolique des parties aériennes et démontré son activité inhibitrice de la xanthine oxydase (XO). Nous avons ensuite effectué un fractionnement et évalué par mesure UV les fractions présentant la plus forte activité inhibitrice de la XO. La purification de certaines fractions a permis de déterminer l’activité inhibitrice de composés purs. Nous avons démontré que le spiraeoside, un flavonoïde glycosylé, possède une activité environ 25 fois supérieure à celle de l’allopurinol, utilisé comme référence dans le traitement de la goutte. Afin d’identifier facilement et rapidement des inhibiteurs puissants dans une matrice complexe, nous avons développé une stratégie complémentaire reposant sur une méthode HPLC et une méthode d’analyse dirigée par l’effet (EDA) associant HPTLC et essais biochimiques. La méthode HPLC, capable de déterminer les composés présentant des interactions avec l’enzyme, pourrait constituer une stratégie efficace pour évaluer de puissants inhibiteurs enzymatiques au sein d’un mélange complexe. Cette stratégie pourrait être appliquée à des dosages quantitatifs au moyen d’expériences LC/MS.
Filipendula ulmaria (L.) Maxim. (anciennement appelée Spiraea ulmaria), également connue sous le nom de reine des prés, est une plante herbacée vivace très commune et largement répandue, appartenant à la famille des Rosaceae. Les usages de cette espèce ont été mis en évidence par plusieurs enquêtes ethnopharmacologiques menées en Europe, principalement pour sa saveur sucrée et ses nombreuses activités biologiques. Dans les usages traditionnels, ses feuilles et ses fleurs sont utilisées en décoction pour leur capacité aromatisante ainsi que pour traiter diverses pathologies, telles que les rhumatismes, la goutte, les céphalées ou la pneumonie.
Plusieurs études ont démontré des propriétés antiprolifératives et anti-inflammatoires très prometteuses, principalement dues à sa teneur en dérivés salicylés (acide salicylique, salicylate de méthyle, etc.). En outre, des études phytochimiques ont montré la présence de deux autres classes importantes de composés : les flavonoïdes, tels que les dérivés de la quercétine et du kaempférol (hypéroside, isoquercitrine, rutoside, spiraeoside, astragaline), et les tanins (tellimagrandines I et II, rugosines A, B, D et E).
La plupart des études phytochimiques et biologiques consacrées à F. ulmaria étaient liées à ses usages contre les rhumatismes, mais aucune ne s’était concentrée sur son utilisation contre la goutte. La goutte est une maladie étroitement liée à la formation de cristaux d’urate monosodique dans les tissus, principalement dans les articulations. Ces cristaux d’urate, dus à une concentration élevée d’acide urique dans le sang (hyperuricémie), sont associés à une enzyme de l’organisme humain, la xanthine oxydase (XO). Cette enzyme clé, qui appartient à la superfamille des hydroxylases à molybdène, catalyse l’oxydation de l’hypoxanthine en xanthine, puis en acide urique. Cette transformation produit comme sous-produits une grande quantité d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), telles que H2O2 ou O2−.
Deux stratégies principales sont actuellement utilisées pour traiter la goutte. La première consiste à augmenter l’excrétion de l’acide urique afin d’abaisser son taux sérique et d’empêcher la formation de cristaux d’urate, généralement à l’aide de médicaments tels que le probénécide. La seconde repose sur l’action combinée d’anti-inflammatoires et d’un inhibiteur de la XO, tel que l’allopurinol ou le fébuxostat. La plupart du temps, l’allopurinol constitue le traitement de première intention, mais des études récentes ont associé de fortes doses d’allopurinol à une prévalence de réactions allergiques. De nos jours, la mise au point de nouveaux inhibiteurs de la XO se concentre principalement sur des composés appartenant à la famille des flavonoïdes, et des résultats très prometteurs ont été obtenus avec des composés tels que la quercétine ou des dérivés de la lutéoline.
L’objectif de cette étude était de caractériser l’extrait des parties aériennes de F. ulmaria et de déterminer les inhibiteurs potentiels de la XO présents dans cet extrait au moyen de méthodes analytiques rapides et efficaces, telles que la HPLC et l’analyse HPTLC dirigée par l’effet (EDA). Au cours des dernières décennies, la stratégie EDA-HPTLC est devenue l’une des méthodes de criblage les plus efficaces pour identifier des composés bioactifs dans une matrice complexe, en associant chromatographie planaire et analyses chimiques, biologiques ou biochimiques. Cette stratégie récente a été développée spécifiquement pour faciliter le fractionnement bioguidé par des approches biologiques ou chimiques des extraits végétaux.
L’une des méthodes EDA les plus courantes associant HPTLC et essais chimiques consiste à évaluer l’activité antioxydante des extraits végétaux au moyen d’un essai de piégeage des radicaux libres (contre le DDPH*). La compatibilité de la HPTLC avec les essais microbiens et biochimiques permet d’évaluer directement sur des plaques de CCM les activités antifongiques et antibactériennes des composés présents dans des mélanges complexes. Récemment, un effort particulier a été consacré à la détermination des activités inhibitrices envers plusieurs enzymes, telles que la glucosidase, l’amylase et la tyrosinase.
Afin de développer et de valider nos méthodes, nous avons d’abord effectué un fractionnement bioguidé permettant d’identifier les composés actifs par des mesures au spectrophotomètre UV, puis confirmé l’efficacité des méthodes analytiques développées sur l’extrait brut afin d’identifier rapidement les métabolites secondaires présentant une inhibition de la XO.
Le profil phytochimique de l’extrait brut, établi par HPLC-MS, concordait avec les études précédentes. L’extrait contenait principalement des flavonoïdes glycosylés dérivés de la quercétine 24 (rutoside 12, isoquercitrine 14, hypéroside 16, miquélianine 17, spiraeoside 21), du kaempférol 25 (astragaline 18, astragaline-2″-O-gallate 19, kaempférol-4′-O-glucoside 22) et de la rhamnétine (isorhamnétine-O-hexoside 20). La présence de tanins (tellimagrandines I 7 et II 10, rugosines B 5, A 9, D 11 et E 8), de catéchine 6 et d’acides phénoliques (acide gallique 3, acide chlorogénique 4, acide ellagique 13 et acide salicylique 23) a également été évaluée. Comme cela avait été décrit précédemment, les composés les plus abondants dans l’extrait semblent être la tellimagrandine II, la rugosine D et le spiraeoside [ ].
Pour confirmer l’activité inhibitrice de la XO de l’extrait brut, nous avons mesuré les valeurs de CI50 au moyen d’une méthode décrite de spectroscopie UV. L’extrait brut a présenté une activité inhibitrice significative, avec une CI50 de 8,3 ± 0,3 µg/mL, comparativement à l’activité de l’allopurinol (CI50 = 2,9 ± 0,1 µg/mL). Afin d’évaluer l’activité potentielle de chaque composé présent dans l’extrait, nous avons effectué un partage liquide/liquide et purifié certains métabolites afin d’évaluer leurs activités inhibitrices de la XO.
Afin d’étudier l’activité inhibitrice de la XO de F. ulmaria, l’extrait des parties aériennes a été soumis à un fractionnement bioguidé. L’extrait méthanolique brut a été soumis successivement à un partage liquide/liquide avec du n-hexane, du dichlorométhane (CH2Cl2), de l’acétate d’éthyle (EtOAc), du n-butanol (n-BuOH) et de l’eau [ ]. Pour chaque fraction, l’activité inhibitrice de la XO a été évaluée et le profil chimique a été identifié.
Alors que les fractions n-hexane, CH2Cl2 et aqueuse n’ont présenté aucune activité, avec une CI50 > 100 µg/mL, les fractions EtOAc et n-BuOH possédaient une bonne activité inhibitrice, avec de faibles valeurs de CI50 (respectivement, CI50 de 2,6 ± 0,1 µg/mL et de 12,3 ± 1,2 µg/mL). La valeur de CI50 de la fraction EtOAc est assez similaire à celle observée pour l’allopurinol.
L’étude des profils chimiques des fractions n-BuOH et EtOAc montre une composition relativement similaire, principalement constituée de flavonoïdes et de tanins, mais présents à des concentrations plus élevées dans la fraction EtOAc. Cette différence de composition pourrait expliquer les légères différences d’activité entre ces deux fractions. L’activité inhibitrice pourrait être liée à la présence de composés tels que la tellimagrandine II, le spiraeoside, la quercétine ou le kaempférol, présents en grandes quantités dans la fraction EtOAc.
Compte tenu de l’activité prometteuse de la fraction EtOAc, nous avons décidé de procéder à un fractionnement suivi d’une purification des composés majoritaires de cette fraction. Nous avons d’abord réalisé une chromatographie flash en phase inverse, qui a fourni six sous-fractions. La purification de l’une des fractions au moyen de Biobeads SX-3 (Bio-Rad, Hercules, Californie, États-Unis) a fourni deux composés purs : la rugosine D et la tellimagrandine II.
Afin d’évaluer l’activité inhibitrice de la XO des composés les plus prometteurs de l’extrait brut, nous avons envisagé de mesurer les valeurs de CI50 du kaempférol, de la quercétine, de la rugosine D et du spiraeoside, ainsi que celles de composés présumés inactifs (acide gallique, hypéroside, isoquercitrine et acide salicylique), comparativement à l’allopurinol. Comme nous pouvions nous y attendre, les dérivés phénoliques (acide gallique et acide salicylique) ne sont pas de puissants inhibiteurs de la XO, avec des valeurs de CI50 supérieures à 50 µM [ ]. Toutefois, comme cela avait été décrit précédemment, la rugosine D présente une activité inhibitrice assez forte, avec une CI50 de 35,7 ± 2,1 µM. Les activités inhibitrices de l’acide ellagique et de la tellimagrandine II n’ont pas été évaluées, car l’acide ellagique n’était soluble ni dans l’eau ni dans le DMSO et la tellimagrandine II semblait se décomposer dans la solution.
Les flavonoïdes non glycosylés, tels que la quercétine et le kaempférol, présentent une forte activité inhibitrice de la XO, avec des valeurs de CI50 de respectivement 3,5 ± 0,2 µM et 12,9 ± 0,6 µM, comme cela a été décrit dans des travaux antérieurs. De plus, les flavonoïdes 3-O-glycosylés, tels que l’hypéroside et l’isoquercitrine, possèdent un faible taux d’inhibition, avec une valeur de CI50 supérieure à 50 µM (contre une CI50 de 17,2 ± 0,8 µM pour l’allopurinol), ce qui concorde avec la littérature.
Plus étonnamment, le spiraeoside, dérivé 4′-O-glycosylé de la quercétine, présente une très forte activité inhibitrice, avec une CI50 de 0,66 ± 0,02 µM. Ce composé semble plus efficace que l’allopurinol ou la quercétine eux-mêmes. Une étude récente confirme la forte activité inhibitrice du spiraeoside.
Selon de précédentes études des relations structure-activité portant sur les activités inhibitrices de la XO des flavonoïdes, il a été démontré que la glycosylation en positions 3 et 7 diminue l’affinité de liaison comparativement au flavonoïde natif. Ce phénomène a été observé pour la quercétine, le kaempférol et la naringénine. Les résultats obtenus pour l’hypéroside et l’isoquercitrine, dérivés de la quercétine glycosylés en position 3, concordent avec ces études. Toutefois, le spiraeoside, dérivé 4′-glycosylé de la quercétine, semble présenter une forte affinité pour l’enzyme. La position de substitution sur le dérivé flavonoïdique semble constituer un facteur clé pour la liaison au site actif de la XO, puisque le spiraeoside possède une valeur de CI50 cinq fois inférieure à celle de la quercétine. Les mêmes résultats ont été décrits pour la lutéoline et le lutéoline-4′-O-glucoside. Ces résultats ont également démontré que trois composés présents dans les parties aériennes de F. ulmaria, le kaempférol, la quercétine et le spiraeoside, possèdent une activité inhibitrice de la XO supérieure à celle de l’allopurinol.
L’activité inhibitrice des composés les plus actifs présents dans l’extrait de F. ulmaria ayant été déterminée, nous avons développé des méthodes complémentaires rapides et efficaces, soit pour faciliter le fractionnement bioguidé, soit pour déterminer les composés actifs dans l’extrait brut : une stratégie fondée sur l’évaluation, par analyses HPLC, des interactions entre l’enzyme et les composés présents dans l’extrait, suivie d’un essai de bioautographie HPTLC.
Afin de valider la méthode de bioautographie HPTLC, nous avons d’abord envisagé d’appliquer la stratégie EDA à la fraction EtOAc et aux six sous-fractions obtenues par chromatographie flash, puisque nous avions déjà évalué l’activité inhibitrice de la XO des principaux composés présents dans ces fractions.
Alors que l’analyse spectrophotométrique suit la production d’acide urique à partir de la xanthine, la méthode HPTLC mesure la production de l’anion radicalaire superoxyde formé pendant la régénération d’une enzyme. Au contact de l’anion radicalaire superoxyde, le nitrobleu de tétrazolium (NBT) est transformé en formazan (violet), ce qui entraîne une modification de la couleur du mélange réactionnel. Les inhibiteurs apparaissent sous la forme de taches blanches ou jaunes sur un fond violet.
Afin de comparer le profil phytochimique et l’inhibition de la XO, nous avons préparé deux plaques HPTLC [ ]. La plaque de gauche (NP-PEG) montre que les polyphénols, en particulier les tanins (en bleu pâle ou foncé sur la plaque), sont les principaux constituants des fractions A, B et C, tandis que les fractions D, E et F semblent contenir principalement des flavonoïdes, surtout les fractions E et F. Après comparaison avec les étalons, nous avons démontré que la fraction E contient principalement de la quercétine (tache jaune à Rf 0,9) et que la fraction F contient principalement du kaempférol (tache verte à Rf 0,95).
La comparaison des deux plaques [ ] semble montrer que les polyphénols présents dans les fractions A, B et C ne possèdent pas d’activité inhibitrice de la XO, tandis que les flavonoïdes, composés majoritaires des fractions D, E et F, possèdent de fortes activités inhibitrices. En effet, le spiraeoside (Rf 0,6, fraction D), la quercétine et le kaempférol (fractions E et F) se révèlent être des inhibiteurs assez puissants.
Afin de confirmer les résultats obtenus par HPTLC, nous avons déterminé la CI50 de chaque fraction au moyen d’une méthode UV. Alors que les fractions A, B et C ont présenté une faible activité (CI50 > 100 µg/mL, [ ]), les fractions D et F ont présenté une bonne activité, avec des valeurs de CI50 de respectivement 2,3 ± 0,1 µg/mL et 3,4 ± 1,4 µg/mL. La fraction E était la plus active, avec une CI50 de 1,33 ± 0,03 µg/mL. Nous avons confirmé qu’une bioautographie HPTLC pouvait constituer une méthode rapide et efficace pour évaluer l’activité inhibitrice de la XO d’extraits végétaux, mais également de composés purs.
L’étape suivante de notre étude a consisté à utiliser une bioautographie HPTLC afin d’identifier les inhibiteurs potentiels de la XO présents dans les fractions bioactives.
Afin de trouver les inhibiteurs de la XO les plus actifs et de valider notre méthode, nous avons choisi d’effectuer les analyses HPTLC sur douze composés purs [ ], en particulier des dérivés flavonoïdiques et des tanins. Parmi ces composés, nous avons envisagé de tester l’acide salicylique et l’acide gallique, décrits comme dépourvus d’activité inhibitrice (CI50 > 100 µM), afin de réaliser un « essai négatif ».
Comme indiqué précédemment, cinq composés semblaient ne présenter aucune activité significative [ ] : l’acide gallique et l’acide salicylique, comme nous pouvions nous y attendre, mais aussi le rutoside et l’astragaline, connus pour être de très faibles inhibiteurs. Toutefois, la tellimagrandine II et l’acide ellagique semblent se décomposer sur la plaque, ce qui pourrait expliquer leur faible activité.
Les taches obtenues pour les autres composés devraient indiquer qu’ils présentent des interactions avec l’enzyme. L’intensité des taches de la rugosine D, de la quercétine, du kaempférol et du spiraeoside confirme les fortes interactions de ces composés avec la XO, tandis que l’hypéroside et l’isoquercitrine présentent de faibles interactions.
Nous avons démontré qu’une stratégie EDA constitue une méthode rapide et efficace, aussi bien pour effectuer un fractionnement bioguidé que pour évaluer l’activité inhibitrice de la XO des métabolites secondaires.
Pour compléter cette stratégie, nous avons envisagé de développer une méthode HPLC qui permettrait de déterminer, dans des mélanges complexes, les composés capables de se lier aux enzymes.
L’identification, par criblage rapide et sans purification, de composés bioactifs présents dans un mélange complexe constitue une approche difficile. Des techniques reposant sur l’analyse HPLC de l’extrait brut, après détermination du profil phytochimique et après incubation avec l’enzyme recherchée, pourraient permettre d’identifier individuellement les composés actifs du mélange. Sur la base de la méthode décrite par Wang, nous avons incubé l’enzyme avec l’extrait brut et effectué des analyses HPLC du filtrat après centrifugation. La méthode utilisée dans cette étude ne comporte pas d’ultrafiltration de l’enzyme, mais une filtration simple destinée à éliminer l’enzyme du mélange réactionnel. La soustraction des chromatogrammes de l’extrait brut avant et après incubation avec la XO a permis de détecter les composés capables d’interagir avec l’enzyme [ ], puisqu’ils apparaissent sous la forme de pics négatifs. Les composés inactifs n’étaient pas présents dans les spectres soustraits (b). Cette méthode est efficace pour évaluer rapidement les interactions des métabolites secondaires avec l’enzyme. Toutefois, elle ne permet pas de déterminer l’activité inhibitrice des composés présents dans l’extrait brut. En effet, les interactions puissantes de composés avec la XO dans un extrait brut pourraient être liées à leurs valeurs de CI50 et, par conséquent, à leur activité inhibitrice potentielle. Néanmoins, cette méthode est utile pour effectuer un fractionnement bioguidé afin de découvrir des inhibiteurs enzymatiques potentiels.
Les chromatogrammes [ ] ont montré qu’une dizaine de composés semblaient interagir avec la XO, puisque l’aire du pic correspondant était plus faible en présence de l’enzyme. Les résultats les plus marqués ont été obtenus pour des ellagitanins, tels que les rugosines et les tellimagrandines, ainsi que pour l’acide ellagique. La rugosine D et la tellimagrandine II semblent présenter les interactions les plus fortes avec la XO. Ces résultats concordent avec les études précédentes et avec les valeurs de CI50 mesurées pour la rugosine D, la quercétine et le spiraeoside, ce qui montre que les tanins sont d’assez bons inhibiteurs de la XO, en particulier la rugosine D et la tellimagrandine II, qui possèdent des valeurs de CI50 assez similaires.
À partir de la différence d’aire entre le pic de chaque composé en présence et en l’absence de XO, nous avons pu estimer le pourcentage de liaison de chaque composé avec l’enzyme [ ]. La rugosine D et la quercétine semblent se lier à l’enzyme par de fortes interactions, avec respectivement environ 60 % et 50 % de liaison. Pour le rutoside, le pourcentage de liaison est probablement surestimé, car plusieurs composés possèdent vraisemblablement le même temps de rétention. Avec environ 30 % de liaison, la tellimagrandine II et le spiraeoside pourraient être des inhibiteurs potentiels de la XO.
Nous avons démontré que des flavonoïdes tels que la quercétine ou le kaempférol semblent interagir avec l’enzyme. Plus étonnamment, parmi les flavonoïdes glycosylés, seuls le spiraeoside (quercétine-4′-O-glucoside) et le kaempférol-4′-O-glucoside ont présenté des interactions significatives avec l’enzyme, tandis que l’isoquercitrine ou l’hypéroside ne semblaient pas interagir avec la XO. Néanmoins, des études précédentes ont décrit les flavonoïdes alimentaires tels que la quercétine, le kaempférol ou la lutéoline comme de meilleurs inhibiteurs que les flavonoïdes glycosylés tels que l’hypéroside ou l’astragaline.
La méthode HPLC semble efficace pour identifier les composés capables de se lier à une enzyme dans une matrice complexe. Cette stratégie pourrait être utile dans des essais bioanalytiques pour effectuer un fractionnement bioguidé d’une matrice complexe, notamment d’extraits végétaux.
Sur la base de ses usages traditionnels, particulièrement contre la goutte, nous avons étudié le profil chimique de F. ulmaria et évalué aussi bien l’activité inhibitrice de la XO de l’extrait des parties aériennes que celle de certains composés isolés présents dans le mélange. Comme l’extrait méthanolique des parties aériennes de F. ulmaria présentait une forte activité inhibitrice, avec une valeur de CI50 de 8,3 ± 0,3 µg/mL, nous avons effectué un fractionnement de l’extrait brut, puis poursuivi par chromatographie sur gel de silice RP-18 le fractionnement de certaines fractions. Nous avons ensuite déterminé l’activité inhibitrice de la XO en mesurant les valeurs de CI50 de certains métabolites secondaires. Comme cela avait été décrit précédemment, nous avons démontré que des flavonoïdes tels que la quercétine et le kaempférol, des flavonoïdes glycosylés tels que le spiraeoside, et des tanins tels que la rugosine D sont de puissants inhibiteurs de la XO. Nous avons confirmé que la quercétine et le kaempférol présentent une forte activité, tandis que les dérivés 3-O-glycosylés de la quercétine, tels que l’hypéroside et l’isoquercitrine, ne semblaient pas interagir avec l’enzyme. Néanmoins, le spiraeoside, dérivé 4′-O-glycosylé de la quercétine, semble être un puissant inhibiteur. Nous avons supposé que l’activité de F. ulmaria contre la goutte pourrait être due à la présence de spiraeoside, connu comme l’un des principaux constituants des fleurs et des feuilles de F. ulmaria et possédant de fortes activités inhibitrices de la XO.
Afin de faciliter le criblage d’inhibiteurs enzymatiques potentiels, nous avons développé deux méthodes analytiques rapides et efficaces : des analyses HPLC et une bioautographie HPTLC. Afin de faciliter le fractionnement bioguidé de tels inhibiteurs, nous avons développé une méthode HPLC efficace permettant de déterminer les composés présentant des interactions avec la XO. Cette méthode est assez efficace aussi bien pour évaluer les fractions actives dans une stratégie de fractionnement bioguidé que pour déterminer l’activité inhibitrice de composés isolés. La méthode HPLC développée permet d’évaluer les composés présentant des interactions avec une enzyme, et nous avons démontré que le pourcentage de liaison, facilement déterminé, est directement corrélé à l’activité inhibitrice. Cette stratégie pourrait être utile soit pour révéler les composés potentiellement actifs dans une matrice complexe, soit pour évaluer la capacité inhibitrice de composés, puisque cette méthode pourrait être quantitative.
Les parties aériennes de F. ulmaria ont été récoltées à Saint-Genès-Champanelle (France) en juillet 2019 et identifiées par Arnaud Delcoigne, de l’herbier de l’Université Clermont-Auvergne (Clermont-Ferrand, France). Un spécimen de référence a été déposé à l’herbier (CLF121184).
Tous les produits chimiques et réactifs ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Saint-Louis, Missouri, États-Unis). Tous les étalons et produits chimiques de référence ont été achetés auprès d’Extrasynthese (Genay, France), de Sigma-Aldrich ou de Carbosynth (Compton, Royaume-Uni).
Les parties aériennes de F. ulmaria ont été séchées à l’air, à température ambiante et dans l’obscurité, réduites en poudre, puis extraites trois fois avec du méthanol pendant 24 h (75 g de plantes sèches pulvérisées avec 3 × 750 mL de méthanol). Après filtration, l’extrait méthanolique a ensuite été séché sous vide afin d’obtenir un extrait sec jaunâtre (extrait brut, 22,3 g), avec un rendement d’environ 30 %.
Les analyses HPLC ont été effectuées sur un appareil Agilent 1260 Infinity, muni d’un détecteur DAD équipé d’une colonne Uptisphere C18-3 (250 × 4,6 mm, 5 µm) d’Interchim (Montluçon, France). Les analyses LC-MS ont été réalisées sur une chaîne UHPLC Ultimate 3000 RSLC et un Orbitrap Q-Exactive (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis), avec la colonne mentionnée ci-dessus. Les conditions de fonctionnement de la source étaient les suivantes : tension de pulvérisation de 3 kV ; température du capillaire chauffé de 320 °C ; température du gaz auxiliaire de 400 °C ; débits des gaz de gainage, de balayage et auxiliaire (azote) de respectivement 50, 10 et 2 unités arbitraires ; une cellule de collision s a été utilisée en mode nCE échelonné, avec une tension d’ionisation comprise entre 10 et 50 unités arbitraires. Les données en balayage complet ont été obtenues à une résolution de 70 000, tandis que les données MS2 ont été obtenues à une résolution de 17 500. Les données ont été traitées à l’aide du logiciel Xcalibur (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, États-Unis). L’identification de tous les composés décrits a été réalisée en mode d’ionisation négative.
Pour les deux analyses, la phase mobile était un mélange d’acide formique dans l’eau (0,1 % v/v) (phase A) et d’acide formique dans l’acétonitrile (0,1 % v/v) (phase B). Le gradient de la phase A était de 100 % (0 min), 80 % (10 min), 73 % (35 min), 0 % (40–50 min) et 100 % (51–60 min). Le débit était de 0,8 mL/min et le volume d’injection de 5 µL.
L’extrait méthanolique brut a été dissous dans de l’eau distillée (400 mL pour 10 g), puis extrait trois fois à l’aide de solvants de polarité croissante (n-hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle et butanol) afin d’obtenir cinq fractions. Le rapport entre la phase aqueuse et la phase organique était de 4:1 (v/v).
Une partie de la fraction d’acétate d’éthyle (991 mg sur 1 228 mg) a été soumise à une chromatographie flash afin d’obtenir six fractions (A à F). Un dépôt à sec des fractions polaires sur gel de silice en phase inverse a été préparé et conditionné en tant qu’échantillon. La fraction polaire a ensuite été soumise à une chromatographie flash sur une colonne Chromabond C18 (80 g) (Macherey-Nagel, Hoerdt, France), avec un gradient eau-acétonitrile à 45 mL/min. La détection des composés a été effectuée à 254 nm. La phase mobile était constituée d’un mélange d’eau (phase A) et d’acétonitrile (phase B). Le gradient de la phase A était de 100 % (0–5 min), 0 % (55 min) et 0 % (55–60 min).
La fraction D a ensuite été fractionnée par chromatographie sur colonne Biobeads SX-3 (Bio-Rad, Hercules, Californie, États-Unis) dans le THF afin d’obtenir de la rugosine D (10,4 mg) et de la tellimagrandine II (11,7 mg). La rugosine D et la tellimagrandine II ont été identifiées par RMN au moyen d’un spectromètre Avance III HD 500 MHz (Bruker, Billerica, Massachusetts, États-Unis), avec CD3OD comme solvant.
L’inhibition de la XO a été étudiée selon la procédure décrite par Sowndhararajan et al., avec de légères modifications. Le mélange d’essai contenait 770 µL de PBS à 120 mM, 700 µL d’une solution de xanthine dans le PBS (concentration finale de 56 µM), 490 µL d’extrait végétal dans le PBS (plage de concentrations finales de 10 à 100 µg/mL) et 140 µL d’une solution de XO (concentration finale de 0,01 U/mL dans le PBS). Avant l’ajout de la solution de XO au mélange, tous les composants ont été incubés à 25 °C, dans l’obscurité, pendant 5 min. La réaction a été déclenchée par l’ajout de la solution de XO et l’évolution de l’absorbance, indiquant la formation d’acide urique, a été mesurée à 293 nm pendant 5 min. L’essai d’activité enzymatique sans extrait a été défini comme l’activité relative maximale, et le pourcentage d’inhibition a été calculé selon la méthode de Yan et al. Les valeurs de CI50 ont été déterminées par régression linéaire et sont exprimées en µg/mL d’extrait végétal ± écart-type. Toutes les mesures ont été effectuées en triple (n = 3).
Le matériel comprenait un système HPTLC CAMAG (Muttenz, Suisse), équipé d’un dispositif automatique de dépôt sur plaque de CCM (ATS 4), d’une cuve de développement automatique (ADC2) avec régulation de l’humidité, d’un visualiseur de CCM, du logiciel VisionCATS, d’un dispositif d’immersion de chromatogrammes III et d’un dispositif de chauffage des plaques de CCM III pour la dérivatisation.
Les échantillons ont été préparés en dissolvant 1 mg de chaque fraction dans 1 mL de méthanol, et 20 µL ont été déposés sous forme de bandes de 8 mm, à 8 mm du bord inférieur de la plaque. La phase mobile était un mélange d’acétate d’éthyle, de dichlorométhane, d’acide formique, d’acide acétique et d’eau (100:25:10:10:11). Les plaques ont été développées sur une distance de 70 mm à partir du bord inférieur, dans une cuve en verre à double compartiment saturée pendant 20 min avec une phase mobile, sous humidité contrôlée (HR : 33 %). Après le développement, les plaques ont été séchées sous un courant d’air froid pendant 10 min.
Après élution, les plaques ont été chauffées à 100 °C pendant 2 min, puis immergées dans une solution de diphénylborinate de 2-aminoéthyle dans l’acétate d’éthyle (30 mM). Après acquisition d’une image à 366 nm et en lumière blanche, les plaques ont été immergées dans une solution de polyéthylène glycol 400 dans l’acétate d’éthyle (5 % v/v), puis une nouvelle image a été acquise à 366 nm et en lumière blanche.
L’essai d’inhibition de la XO a été réalisé selon la méthode développée par Ramallo, avec de légères modifications. Après migration, les plaques ont été immergées dans une solution de PBS à 120 mM contenant de la xanthine oxydase (0,1 U/mL), de l’EDTA (1 mM) et du NBT (1 mM), dans un stérilisateur, à 37 °C et dans l’obscurité pendant 30 min. Les plaques ont ensuite été immergées dans une solution de PBS à 120 mM contenant de la xanthine (1,5 mM), dans un stérilisateur, à 37 °C pendant 30 min dans l’obscurité. Les inhibiteurs apparaissaient sous la forme de taches blanches ou jaunes sur un fond violet.
La mesure de l’interaction avec la XO a été effectuée selon la procédure de Zhang, avec certaines modifications. Le mélange d’essai contenait 10 mL d’extrait brut à 1 mg/mL dans l’eau et 200 µL de xanthine oxydase (concentration finale de 0,1 U/mL), ou 200 µL d’eau. Avant l’analyse HPLC, la solution a été mélangée pendant une heure à température ambiante et dans l’obscurité. Après une heure, le mélange a été centrifugé à 4 500× g tr/min et le surnageant a été filtré à travers un filtre en PTFE de 0,45 µm. Les échantillons ont ensuite été analysés à l’aide d’un appareil Agilent 1260 Infinity (Agilent, Santa Clara, Californie, États-Unis), muni d’un détecteur DAD équipé d’une colonne Uptisphere C18-3 (250 × 4,6 mm, 5 µm) d’Interchim, selon la même méthode que celle mentionnée précédemment. Les inhibiteurs potentiels ont été identifiés après soustraction des chromatogrammes obtenus lors des essais avec et sans XO (pics négatifs).
Étude in vitro portant sur les parties aériennes de Filipendula ulmaria, récoltées en France en juillet 2019. Un extrait méthanolique et ses fractions ont été évalués sur la xanthine oxydase (XO) par spectrophotométrie UV, bioautographie HPTLC et analyse HPLC des interactions enzyme-composés. L’extrait brut présentait une CI50 de 8,3 ± 0,3 µg/mL, contre 2,9 ± 0,1 µg/mL pour l’allopurinol dans cet essai ; les fractions EtOAc et n-BuOH avaient des CI50 de respectivement 2,6 ± 0,1 et 12,3 ± 1,2 µg/mL. Parmi les composés évalués, le spiraeoside présentait une CI50 de 0,66 ± 0,02 µM, la quercétine de 3,5 ± 0,2 µM, le kaempférol de 12,9 ± 0,6 µM, la rugosine D de 35,7 ± 2,1 µM et l’allopurinol de 17,2 ± 0,8 µM ; l’hypéroside et l’isoquercitrine avaient des CI50 supérieures à 50 µM. Les analyses HPLC estimaient une liaison à la XO d’environ 60 % pour la rugosine D, 50 % pour la quercétine et 30 % pour la tellimagrandine II et le spiraeoside. Ces résultats constituent un niveau de preuve exclusivement préclinique in vitro sur l’inhibition de la XO et les interactions avec cette enzyme ; aucune efficacité clinique n’a été évaluée.
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