Référence : Molecules 2021. — PMC8003693 · DOI 10.3390/molecules26061737 Type : etude experimentale · Plante : Romarin officinal · Propriété → Foie & vésicule Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Rosmarinus officinalis L. est une espèce largement connue pour ses usages médicinaux, également utilisée comme matière première dans les industries alimentaire et cosmétique. L’objectif de la présente étude était d’offrir une nouvelle perspective sur le produit médicinal provenant de cette espèce et de tester son activité hépatoprotectrice. L’échantillon testé consistait en une teinture obtenue à partir de jeunes pousses fraîches. Les composés évalués pour cette activité sont les polyphénols et les terpénoïdes, identifiés et quantifiés par HPLC–UV–MS et GC–MS. L’activité antioxydante a été évaluée in vitro à l’aide des essais DPPH, FRAP et SO. L’activité hépatoprotectrice a été testée chez des rats présentant une hépatotoxicité induite expérimentalement. Dans la composition chimique de la teinture, les diterpènes phénoliques — acide carnosique, carnosol, rosmanol et rosmadial — et l’acide rosmarinique se sont révélés être les composés majoritaires, aux côtés du 1,8-cinéole, du camphène, du linalol, du bornéol et du terpinéol parmi les monoterpènes. In vitro, la teinture testée a démontré une capacité antioxydante significative. Les résultats de l’expérience in vivo ont montré que l’activité hépatoprotectrice repose sur un mécanisme antioxydant. Ainsi, la présente étude offre une nouvelle perspective sur les usages médicinaux de l’espèce, en démontrant la présence de quantités significatives de polyphénols et de terpènes dans la composition de la teinture de jeunes pousses fraîches, laquelle a présenté une activité hépatoprotectrice par l’intermédiaire d’un mécanisme antioxydant.
Parmi les familles de plantes à fleurs les plus importantes, la famille des Lamiaceae est l’une des plus grandes et comprend de nombreuses espèces connues pour leurs activités biologiques ou pour leur utilisation dans différentes branches liées à l’économie. Les espèces appartenant aux genres Salvia, Melissa ou Thymus sont les plus connues et sont largement utilisées sous différentes formes pour le traitement de nombreuses pathologies, mais également pour leurs valeurs nutritionnelles ou économiques.
Rosmarinus est un genre important de la famille des Lamiaceae, comprenant 2 espèces, Rosmarinus eriocalyx Jordan et Fourr. et Rosmarinus officinalis L., qui sont largement réparties dans des habitats d’Afrique australe et septentrionale, d’Asie occidentale, d’Anatolie et du bassin méditerranéen. L’espèce la plus étudiée est Rosmarinus officinalis L., le romarin, une plante cultivée dans le monde entier, connue pour son usage culinaire et pour ses propriétés pharmacologiques qui l’ont rendue célèbre en médecine traditionnelle. Il a été rapporté que ses feuilles présentent des applications thérapeutiques significatives dans la prise en charge d’un large éventail de maladies telles que le diabète sucré, les troubles respiratoires, les problèmes gastriques et les maladies inflammatoires. Elle est également utilisée dans l’industrie alimentaire comme arôme alimentaire et comme conservateur en raison de ses propriétés antioxydantes et antimicrobiennes. R. officinalis est également utilisé comme matière première dans des produits cosmétiques.
Les maladies hépatiques constituent une menace majeure pour la santé publique, indiquant des problèmes du tissu hépatique ou des fonctions du foie, qui peuvent être causés par différents facteurs tels que des virus ou des bactéries, des maladies auto-immunes ou l’action externe de différentes substances chimiques — médicaments ou composés toxiques. De nos jours, la médecine moderne propose des solutions pour le traitement de ces pathologies, mais malgré les progrès réalisés, il existe peu de médicaments efficaces assurant la protection et la régénération des cellules hépatiques. En outre, les traitements existants peuvent provoquer des effets indésirables qui rendent le traitement de ces pathologies encore plus difficile. Il paraît donc important d’identifier de nouvelles solutions pour le traitement des maladies hépatiques et la protection du foie, afin de développer de nouveaux agents présentant une efficacité élevée et un profil de sécurité supérieur. Les mécanismes sous-jacents à l’activité hépatoprotectrice sont fortement liés à la capacité des antioxydants à piéger les espèces réactives de l’oxygène (ROS), produites par la conversion métabolique des xénobiotiques et qui induisent un stress oxydatif ainsi que des lésions du tissu hépatique.
L’activité hépatoprotectrice figure parmi les activités biologiques rapportées pour les extraits de R. officinalis dans un modèle de toxicité induite par l’azathioprine chez le rat, dans les lésions hépatiques induites par l’acétaminophène, chez des rats traités par la gentamicine, dans les lésions hépatiques induites par l’hypothermie-ischémie chez le rat et dans la maladie alcoolique du foie ; elle est attribuée à la composition de l’huile essentielle et à sa teneur en polyphénols, parmi lesquels l’acide rosmarinique est le plus représentatif. Néanmoins, cette activité biologique est moins documentée et, à notre connaissance, il n’existe aucune preuve claire concernant les composés responsables de cette activité. En outre, il existe également peu de données sur le mécanisme d’action sous-jacent, supposé être lié à la réduction des ROS. D’autre part, l’activité antioxydante in vitro de R. officinalis est largement étudiée et a été rapportée pour de nombreux produits végétaux de l’espèce : parties aériennes fraîches, extraits de fleurs ou huile essentielle. Les composés responsables de cette activité sont les polyphénols, mais également les terpènes de l’huile essentielle.
L’acide rosmarinique (RA) est un composé phénolique isolé pour la première fois à partir de Rosmarinus officinalis L. et possédant des activités pharmacologiques remarquables. Il est couramment présent dans les espèces de Lamiaceae telles que Melissa sp., Salvia sp., Origanum sp. ou Thymus sp. Son importance pharmacologique est principalement due à ses propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires, antimicrobiennes et antidiabétiques. Son activité hépatoprotectrice a également été rapportée et est attribuée à un mécanisme antioxydant. D’autres polyphénols présents dans la composition de l’espèce sont l’acide caféique, l’acide chlorogénique, l’acide p-coumarique, l’acide quinique, le kaempférol, la quercétine, la rutine et l’apigénine. Parmi les terpènes phénoliques, le carnosol et l’acide carnosique sont également signalés dans la composition de l’espèce. L’huile essentielle de R. officinalis est riche d’une grande variété de monoterpènes tels que le bornéol, le camphre, le linalol, les α- et β-pinènes, le camphène et le 1,8-cinéole.
Dans ce contexte, l’objectif principal de la présente étude était d’évaluer l’activité hépatoprotectrice d’une teinture de jeunes pousses fraîches de R. officinalis contre l’hépatotoxicité induite chez le rat par le tétrachlorure de carbone (CCl₄). Les composés analysés en relation avec cette activité sont les composés phénoliques et les terpénoïdes. En outre, la présente étude vise à fournir des précisions importantes sur le mécanisme sous-jacent à cette activité, lequel semble être lié aux propriétés antioxydantes de l’extrait testé. Enfin, la présente étude visait également à démontrer le potentiel significatif des jeunes pousses fraîches comme source importante de composés présentant une activité antihépatotoxique par l’intermédiaire d’un mécanisme antioxydant.
La teinture, obtenue à partir de jeunes pousses fraîches macérées dans de l’éthanol à 90 % v/v, a été analysée du point de vue physicochimique conformément à la Pharmacopée européenne (EPh) et à la Pharmacopée homéopathique allemande (GHPh). La teinture présentait ainsi une couleur brun foncé et se présentait comme un liquide aromatique d’une densité relative de 0,920. La valeur du résidu sec était de 2,38 % et la teneur en éthanol de 55 % vol. L’identification conforme à la GHPh a été réalisée par chromatographie sur couche mince (TLC), mettant en évidence les principaux composés terpénoïdiques.
La teinture a été analysée par HPLC–UV–MS afin d’identifier et de quantifier les composés phénoliques. Les résultats ont été exprimés en μg de polyphénol/g de matière végétale sèche (d.w.) [ ].
Des quantités élevées de polyphénols ont été identifiées dans la composition de la teinture de jeunes pousses fraîches. Les terpènes phénoliques se sont révélés être la classe majoritaire de composés. Parmi ceux-ci, le composé présent à la concentration la plus élevée était l’acide carnosique, suivi du rosmadial, du carnosol et du rosmanol. Parmi les flavones, le lutéoline-glucuronide, la cirsimaritine et l’homoplantaginine étaient également présents en quantités significatives. L’acide rosmarinique est l’acide hydroxycinnamique trouvé dans les quantités les plus élevées. L’acide syringique, un acide hydroxybenzoïque, était un autre composé présent en quantités significatives.
Les composés polyphénoliques de R. officinalis ont été rapportés dans la littérature scientifique, mais la matière première était généralement constituée par les feuilles et non par les jeunes pousses, ce qui souligne davantage encore l’originalité de la présente étude. L’acide carnosique et le carnosol, ainsi que l’acide rosmarinique, sont présents dans la composition de l’espèce, mais leur présence est citée dans la composition des feuilles, lesquelles sont principalement séchées. Le lutéoline-glucuronide est également le composé flavonoïdique le plus souvent cité dans la composition des mêmes parties de l’espèce. La présence de cirsimaritine, de rosmanol, de rosmadial et d’homoplantaginine est également rapportée dans les feuilles. Des différences peuvent être observées dans les quantités de ces composés, qui sont significativement plus élevées dans la composition des jeunes pousses fraîches. De plus, la nouveauté de la présente étude réside néanmoins dans la matière végétale étudiée, constituée de jeunes pousses fraîches qui, à notre connaissance, n’avaient pas été étudiées auparavant. Compte tenu des quantités élevées de ces polyphénols trouvées dans la composition de la teinture testée, une corrélation importante pourrait être établie avec les activités biologiques évaluées.
En outre, des terpénoïdes présents dans l’huile essentielle ont également été trouvés en quantités significatives dans la composition de la teinture testée, ayant été solubilisés par le solvant d’extraction, l’éthanol concentré. Les terpénoïdes ont été évalués par une méthode GC–MS et les principaux constituants identifiés et quantifiés étaient le 1,8-cinéole, le camphène, le linalol, le bornéol et le terpinéol [ ]-gauche. Ces composés avaient également été identifiés précédemment dans la composition de l’huile essentielle appartenant à cette espèce. Les activités antioxydante et hépatoprotectrice de la teinture testée peuvent également être attribuées à la présence d’un pourcentage élevé de 1,8-cinéole (27,5 mg/100 g de teinture), qui s’est révélé être le composé majoritaire dans la composition de la teinture testée [ ]-droite. Une activité hépatoprotectrice a précédemment été rapportée pour ces composés et la quantité élevée trouvée dans la teinture testée pourrait, conjointement avec les composés phénoliques, agir de manière synergique afin d’exercer ces activités biologiques. Les résultats obtenus par l’analyse GC–MS sont présentés dans [ ].
La capacité antioxydante a été évaluée par trois méthodes in vitro : le 2,2-diphényl-picrylhydrazyle (DPPH), le pouvoir antioxydant réducteur ferrique (FRAP) et l’essai de piégeage du radical anion superoxyde (SO), évaluant ainsi la capacité antioxydante de l’échantillon testé par différents mécanismes [ ].
Les teneurs totales en polyphénols, en flavonoïdes et en acides rosmariniques de la teinture de R. officinalis testée pourraient être corrélées aux effets antioxydants, car elles présentaient des quantités significativement importantes en comparaison avec les feuilles séchées ou les extraits.
La teneur significative en composés polyphénoliques de l’extrait testé est étroitement liée à son potentiel antioxydant. Des interactions synergiques, additives ou antagonistes entre ceux-ci peuvent se manifester dans cette activité de neutralisation des radicaux libres. La plupart des études existantes attribuent l’effet antioxydant de l’espèce à sa teneur en huile essentielle, mais puisque des quantités élevées de polyphénols ont été évaluées dans différentes études, il semble qu’ils soient très importants pour l’activité antioxydante des extraits.
L’activité de piégeage du radical DPPH de l’extrait était élevée (IC₅₀ = 31.85 ± 1.81 µg/mL). Des études antérieures ont rapporté l’activité antioxydante par la même méthode, en testant des extraits de fleurs ou de feuilles séchées. D’autres études réalisées sur des plantes fraîches ont montré une valeur d’IC₅₀ significativement plus élevée, indiquant ainsi un effet plus faible des plantes matures entières.
La teinture testée a démontré une très bonne capacité antioxydante de réduction des ions ferriques, avec une valeur de 257.88 ± 1.74 µm TE/g, supérieure aux autres données révélées par d’autres études réalisées sur les feuilles. L’activité antioxydante d’un extrait de R. officinalis évaluée par la méthode FRAP a été déterminée par Gîrd et al. comme étant EC₅₀ = 285.25 ± 0.88 µg/mL, mais l’étude avait été réalisée sur des feuilles séchées.
Dans le cas de l’essai de piégeage du superoxyde (SO), la diminution de l’absorbance à 560 nm en présence de composés antioxydants indiquait la consommation de l’anion superoxyde dans le mélange réactionnel. Les composés phénoliques et terpénoïdiques de la teinture testée ont la capacité de neutraliser les radicaux superoxydes, qui sont extrêmement agressifs dans le tissu hépatique et provoquent des lésions cellulaires significatives. Parallèlement, les radicaux superoxydes peuvent être inhibés par l’enzyme antioxydante endogène superoxyde dismutase (SOD), dont le niveau peut être augmenté par les mêmes composés. De cette manière, les composés testés agissent en synergie et contribuent à relier l’activité antioxydante démontrée par les expériences in vitro à celle testée in vivo. Les résultats des expériences in vitro montrent un bon effet d’élimination des radicaux superoxydes par la teinture de jeunes pousses fraîches de R. officinalis, ce qui concordait avec les résultats in vivo indiquant une augmentation de l’activité de la SOD.
Comme on peut l’observer, la comparaison avec la littérature scientifique est difficile, puisque différentes méthodes d’extraction et différents protocoles expérimentaux ont été utilisés et que différentes matières végétales constituaient le point de départ. Cependant, compte tenu de tout ce qui précède, il apparaît plus clairement que les jeunes pousses fraîches représentent une source importante de polyphénols et de terpènes possédant un potentiel antioxydant prometteur. De plus, ce potentiel antioxydant démontré ici est directement corrélé à l’activité hépatoprotectrice in vivo.
L’effet protecteur de l’extrait de R. officinalis a été étudié à l’aide d’un modèle de toxicité hépatique induite par le tétrachlorure de carbone (CCl₄) (1 mL/kg).
Le modèle d’hépatotoxicité au CCl₄ est largement utilisé pour évaluer les effets hépatoprotecteurs des médicaments et des extraits végétaux. Il a été rapporté que l’une des principales causes des lésions hépatiques induites par le CCl₄ est la peroxydation lipidique, induite et accélérée par les dérivés radicalaires libres du CCl₄. Le CCl₄ exerce son effet hépatotoxique par la liaison covalente de ses métabolites et leur réaction avec l’oxygène, ce qui déclenche la peroxydation lipidique. L’étendue des lésions oxydatives du foie a été étudiée en mesurant le niveau de malondialdéhyde (MDA) et l’activité d’enzymes antioxydantes telles que la glutathion peroxydase (GPx), la catalase (CAT) et la superoxyde dismutase (SOD). Les lésions hépatiques ont été évaluées en mesurant l’activité plasmatique des transaminases, à savoir l’alanine aminotransaminase (ALT), l’aspartate aminotransaminase (AST) et la gamma-glutamyl transférase (GGT), tandis que les albumines reflétaient la fonction hépatique.
Tous les animaux ont survécu jusqu’à la fin de l’étude ; ils n’ont présenté aucun signe clinique et ont conservé un gain de poids corporel ainsi qu’une consommation d’aliments et d’eau similaires à ceux du groupe témoin. Chez les souris recevant du CCl₄ sans traitement, les lésions hépatiques se traduisaient par une augmentation de l’activité des transaminases plasmatiques ALT, AST et GGT [ ], mais les niveaux d’albumine restaient proches des valeurs du groupe témoin, ce qui suggère l’absence d’insuffisance hépatique. Cependant, les protéines totales étaient élevées en raison de la fraction globuline, probablement à la suite de la réaction inflammatoire hépatique. L’administration de la teinture de R. officinalis a révélé un effet protecteur, visible aux doses de 50 et 500 mg/kg de poids corporel. Toutefois, la dose supérieure de 500 mg/kg de poids corporel n’a pas procuré un meilleur effet protecteur ; aucun effet dépendant de la dose n’a donc été constaté. Lors de la comparaison des deux intervalles temporels, l’ASAT et la GGT présentaient une légère tendance à l’augmentation, mais seule la variation de l’ASAT était statistiquement pertinente (p < 0.05), tandis que l’ALAT restait au même niveau. De même, les protéines plasmatiques restaient aux mêmes niveaux. Dans les groupes recevant le traitement, les valeurs restaient également très similaires.
L’effet protecteur de l’extrait de R. officinalis semble s’exercer par un effet antioxydant. Comme prévu, le CCl₄ a induit une inhibition des antioxydants GPx, CAT et SOD ainsi qu’une multiplication par trois des niveaux de MDA. Les doses de 50 et 500 mg/kg de poids corporel de R. officinalis ont partiellement restauré l’activité des enzymes antioxydantes et atténué la peroxydation lipidique. Les valeurs restaient significativement altérées par rapport à celles du groupe témoin. Une fois encore, la dose supérieure de 500 mg/kg n’a pas procuré une meilleure protection que la dose de 50 mg/kg [ ]. Conformément aux niveaux de transaminases, les marqueurs du stress oxydatif n’ont présenté aucune variation significative entre les deux intervalles temporels.
L’examen histologique a révélé une nécrose et un infiltrat de cellules inflammatoires comme caractéristiques prédominantes dans les groupes recevant du CCl₄ en l’absence de traitement par R. officinalis. Ainsi, autour des espaces portes, la plupart des lobules hépatiques présentaient une nécrose multifocale des hépatocytes entourée d’un infiltrat inflammatoire principalement composé de neutrophiles et de macrophages. Une autre caractéristique importante de la toxicité hépatique était la prolifération de tissu fibreux entre les espaces portes. Dans les groupes recevant le traitement par R. officinalis, nous avons observé une amélioration de la régénération hépatique dépendante de la dose. L’effet principal de l’extrait était la régulation négative de la réaction inflammatoire, mieux manifeste dans le groupe recevant la dose de 50 mg/poids corporel pendant 6 semaines [G]. Bien que l’inflammation n’ait pas été évaluée quantitativement, nous avons constaté une diminution marquée du nombre de neutrophiles et de macrophages. Fait notable, cette amélioration était moins évidente dans le premier groupe (5 mg/poids corporel) et le troisième groupe (500 mg/poids corporel), ce qui suggère qu’à fortes doses l’extrait pourrait exercer un effet toxique sur le foie ou interférer avec les processus de régénération. Le traitement par R. officinalis a également amélioré le processus de régénération, comme l’attestait la présence de figures mitotiques indiquant la restauration de l’architecture et de la fonction hépatiques [C]. Une réduction de la nécrose des hépatocytes et de la fibrose a également été observée, principalement avec la dose de 50 mg/poids corporel. Une fois encore, les bénéfices étaient minimes chez les animaux recevant les doses de 5 et 500 mg/poids corporel [D, H].
L’acétonitrile destiné au gradient HPLC a été fourni par Merck (Darmstadt, Allemagne) et l’eau a été purifiée avec un système Direct-Q UV de Millipore (Darmstadt, Allemagne). La lutéoline a été achetée auprès de Sigma (Darmstadt, Allemagne) et tous les autres produits chimiques utilisés ont été obtenus auprès d’Alfa-Aesar, Karlsruhe, Allemagne.
Le matériel végétal a été récolté dans la culture écologique de PlantExtrakt (Rădaia, comté de Cluj, Roumanie) en septembre 2020. Des spécimens de référence sont déposés dans l’herbier du département de pharmacognosie de la Faculté de pharmacie de Cluj-Napoca (spécimen no 159). La teinture de R. officinalis a été préparée conformément aux spécifications de la Pharmacopée homéopathique allemande (GHPh) et de la Pharmacopée européenne (EPh) relatives à la préparation des teintures (méthode 1.1.5). Les jeunes pousses fraîches ont été extraites par macération à froid avec de l’éthanol à 90 % v/v. Une partie du matériel végétal broyé a été mélangée à 1.4 partie d’éthanol pendant 10 jours. L’extrait a ensuite été filtré. Pour la caractérisation physicochimique de la teinture obtenue, les propriétés organoleptiques, la densité relative, le résidu après évaporation et la teneur en éthanol ont été évalués conformément aux méthodes de l’EPh. Avant son utilisation dans l’expérience animale, la teinture a été évaporée jusqu’à l’élimination complète de l’alcool, puis immédiatement administrée aux animaux.
La densité relative a été déterminée conformément à la Pharmacopée européenne (EPh) à l’aide d’un densimètre numérique Mettler Toledo (Greifensee, Suisse). Le résidu sec a été déterminé conformément à la Pharmacopée européenne (EPh) à l’aide d’une balance analytique Kern (Berlin, Allemagne) et d’une étuve de séchage Memmert (Schwabach, Allemagne). La teneur en éthanol a été évaluée conformément à la Pharmacopée européenne (EPh) à l’aide d’un appareil Neo-Clevenger et d’un densimètre numérique Mettler Toledo.
La teneur phénolique totale (TPC) a été évaluée par une méthode spectrophotométrique utilisant le réactif de Folin–Ciocâlteu, conformément à la Pharmacopée européenne. Les valeurs de TPC ont été calculées à l’aide de la courbe d’étalonnage de l’acide gallique (R² = 0.9931) et exprimées en mg d’équivalents d’acide gallique (GAE)/g de matière végétale fraîche. La détermination quantitative des flavonoïdes (TFC) a été réalisée par une méthode spectrophotométrique utilisant du chlorure d’aluminium. Les valeurs de TFC ont été déterminées à l’aide d’une équation obtenue à partir d’une courbe d’étalonnage du rutoside (R² = 0.9992) et exprimées en mg d’équivalents de rutoside (RE)/g de matière végétale fraîche. La détermination quantitative des acides phénoliques (TPA) a été analysée par une méthode spectrophotométrique conformément à la 10e édition de la Pharmacopée roumaine (monographie Cynarae folium). Les résultats de TPA ont été exprimés en mg d’équivalents d’acide rosmarinique (RAE)/g de matière végétale fraîche, calculés à l’aide d’une courbe d’étalonnage de l’acide rosmarinique (R² = 0.9956). Toutes les expériences ont été réalisées en triple.
Cette analyse a été réalisée à l’aide d’un chromatographe liquide HP-1200 équipé d’une pompe quaternaire, d’un passeur automatique d’échantillons, d’un détecteur DAD et d’un détecteur API-électrospray quadripolaire simple MS-6110 (Agilent-Technologies Inc., Santa Clara, CA, États-Unis). Le mode d’ionisation positive a été utilisé pour la détection des composés phénoliques. Différentes tensions de fragmenteur, comprises entre 50 et 100 V, ont été appliquées. La séparation des composés a été effectuée sur une colonne Eclipse XDB-C18 (5 μm ; 4.5 × 150 mm de diamètre interne) (Agilent). La phase mobile était constituée d’eau acidifiée avec 0.1 % d’acide acétique (A) et d’acétonitrile acidifié avec 0.1 % d’acide acétique (B). L’élution a été réalisée selon un gradient linéaire en plusieurs étapes, avec la composition suivante : 5 % de B pendant 2 min ; de 5 % à 90 % de B en 20 min, maintien pendant 4 min à 90 % de B, puis 6 min pour revenir à 5 % de B. Le débit était de 0.5 mL/min et la température du four de 25 ± 0.5 °C. La détection des ions chargés positivement a été réalisée par spectrométrie de masse, en utilisant le mode Scan et les conditions suivantes : température du gaz 3500 °C, débit d’azote 7 L/min, pression du nébuliseur 35 psi, tension capillaire 3000 V, fragmenteur 100 V et m/z 120–1200. L’enregistrement des chromatogrammes a été effectué à λ = 280 et 340 nm. L’acquisition des données a été réalisée avec le logiciel Agilent ChemStation.
Pour cette analyse, un système Dani Master GC–MS équipé d’une colonne SH-Rxi-5 ms de 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm a été utilisé. L’azote a été utilisé comme gaz vecteur, avec un débit de 10 mL/min et le gradient de température présenté dans [ ].
Le détecteur EIS-MS a été utilisé pour identifier les composés de poids moléculaire compris entre 50 et 600 daltons et la source d’ions a fonctionné à 200 °C. Cinq µL de teinture diluée au 1/10 dans de l’éthanol absolu et 0.1 µL de références présentant des concentrations comprises entre 10 et 1280 µg/mL ont été injectés. Les terpénoïdes ont été identifiés sur la base du facteur de correspondance — supérieur à 750 — à l’aide de la base de données de spectres NIST MS 2.2. La teneur en principaux terpènes a été déterminée à l’aide de la méthode de la courbe d’étalonnage.
Le premier essai utilisé était l’essai de décoloration du DPPH, une méthode spectrophotométrique fondée sur la réaction entre le réactif DPPH et les antioxydants. Deux mL de teinture à différentes concentrations ont été ajoutés à 2 mL d’une solution méthanolique de DPPH à une concentration de 0.1 g/L, puis maintenus à 40 °C dans un bain thermostaté pendant 30 min. Les variations d’absorbance ont été mesurées à 517 nm et l’inhibition du radical DPPH a été calculée à l’aide de la formule suivante : capacité de piégeage du DPPH % = (A témoin − A échantillon/A témoin) × 100 ; A témoin est l’absorbance du témoin, composé de la solution de radical DPPH + méthanol — un mélange contenant tous les réactifs à l’exception de la teinture — et A échantillon est l’absorbance du radical DPPH + échantillon de teinture. Le pourcentage de diminution du DPPH a été exprimé en équivalents Trolox (TE, R² = 0.998). L’activité de piégeage du radical DPPH de la teinture a été exprimée sous forme d’IC50 (µg/mL). Les essais ont été réalisés en triple.
La méthode FRAP est une méthode spectrométrique fondée sur le changement de couleur d’un complexe du radical 2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine (TPTZ) avec l’ion Fe³⁺, évalué par la réduction de l’ion ferrique en ion ferreux (Fe²⁺) dans ce complexe. Le réactif FRAP est un mélange de 2.5 mL d’une solution de TPTZ à 10 mm dans du HCl à 40 mM, mélangés avec 2.5 mL d’une solution de chlorure ferrique à 20 mm et 25 mL de tampon acétate à un pH de 3.6. Quatre mL de teinture ont été dilués à 1.8 mL avec de l’eau et mélangés à 6 mL de réactif FRAP. La solution à blanc a été préparée de manière similaire, en utilisant de l’eau à la place de la teinture. La capacité antioxydante a été évaluée en corrélation avec le changement de couleur, en mesurant l’absorbance à 450 nm. Le Trolox a été utilisé comme référence au moyen d’une courbe d’étalonnage (R² = 0.992). Les résultats ont été exprimés en µm d’équivalents Trolox/100 mL d’extrait. Les essais ont été réalisés en triple.
L’essai SO a évalué la capacité de la teinture à inhiber la formation du formazan par réduction du radical nitrobleu de tétrazolium (NBT), grâce au piégeage des radicaux superoxydes générés dans le système riboflavine-lumière-NBT. Le pourcentage d’activité de piégeage du radical SO a été calculé à l’aide de la formule suivante : % d’activité de piégeage du radical superoxyde = (A₀ − A₁/A₀) × 100, où A₀ = absorbance du témoin — blanc — et A₁ = absorbance de la teinture. Les radicaux anions superoxydes (SO) ont été générés dans un mélange de 2.0 mL de tampon Tris-HCl (16 mm, pH 8.0), de 2.0 mL de nitrobleu de tétrazolium (NBT, 0.3 mm) et de 2.0 mL de solution de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH, 0.936 mm). Ensuite, 0.1 mL de teinture a été dilué à 100.0 mL avec de l’eau et 1 mL de cette solution a été ajouté à ce mélange. Puis, 2.0 mL de solution de méthosulfate de phénazine (PMS, 0.12 mm) ont été ajoutés à l’ensemble afin d’initier la réaction et le mélange a été incubé à 250 °C pendant 5 min. L’absorbance a été mesurée à 560 nm en utilisant un blanc préparé à partir de 2.0 mL de tampon Tris-HCl, mélangés à 2.0 mL de NBT et 2.0 mL de solution de NADH, 4.0 mL d’eau et 2.0 mL de solution de PMS. Comme référence, 4.0 mL d’une solution de Trolox à 1.152 mg/mL ont été utilisés et les résultats ont été exprimés en µm d’équivalents Trolox/g. Cette solution a été ajoutée à 2.0 mL de tampon Tris-HCl, mélangés à 2.0 mL de solution de NBT, 2.0 mL de solution de NADH et 2 mL de solution de PMS (0.12 mm). Tous les essais ont été réalisés en triple.
Les études in vivo ont été conduites sur des souris Swiss non consanguines âgées de six mois et d’un poids corporel de 30.34 ± 2.87 g. Les animaux provenaient de l’établissement pour animaux de laboratoire de l’Université des sciences agricoles et de médecine vétérinaire de Cluj-Napoca et y ont été maintenus pendant toute l’étude. Ils étaient hébergés dans des conditions conventionnelles standard de laboratoire — température de 25 ± 1 °C, humidité relative de 55 ± 5 % et cycle lumière/obscurité de 12 h — à raison de cinq animaux par cage. Les animaux bénéficiaient d’un enrichissement environnemental et avaient librement accès à de la nourriture standard granulée et à de l’eau.
Les conditions d’hébergement et les procédures étaient conformes à la directive 2010/63/UE et à la législation nationale, loi 43/2014. Le projet a été approuvé par le Comité de bioéthique et d’éthique de la recherche de l’UASVM — accord no 68/30.05.2017 — et par les autorités vétérinaires nationales — autorisation de projet no 73/14.06.2017.
Les études de toxicité ont suivi les Lignes directrices de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) pour les essais de produits chimiques, essai no 425 : toxicité orale aiguë, méthode de l’ajustement des doses. Cinq souris Swiss mâles et cinq femelles ont reçu par voie orale une dose de 2000 mg/poids corporel ; tous les animaux ont survécu et n’ont présenté aucun signe de toxicité. Quatorze jours plus tard, les animaux ont été euthanasiés, puis soumis à un examen macroscopique qui n’a révélé aucune altération des organes internes. En outre, le foie et les reins présentaient une architecture histologique normale.
L’effet hépatoprotecteur a été étudié chez quarante-cinq souris Swiss femelles. Les animaux ont d’abord été répartis en cinq groupes. Cinq animaux ont été affectés au groupe témoin, qui recevait par voie orale un traitement placebo — huile végétale ; ce groupe a été euthanasié à la fin de l’étude et a fourni les valeurs de référence pour la biochimie plasmatique et l’histopathologie. Les quarante animaux restants ont tous été soumis au protocole d’induction d’une insuffisance hépatique ; ils ont reçu du tétrachlorure de carbone (CCl₄) à une dose de 1 mL/kg dilué dans de l’huile végétale. Le CCl₄ a été administré par voie orale trois fois par semaine, les jours 1, 3 et 5, jusqu’à la fin du protocole, à l’aide d’une sonde en plastique lubrifiée. Ces animaux ont été répartis en quatre groupes égaux ; un groupe, le groupe CCl₄, a reçu le traitement placebo et les trois autres groupes ont été traités avec l’extrait de Rosmarinus officinalis aux doses de 5, 50 et 500 mg/kg de poids corporel. L’extrait a été administré les mêmes jours que le CCl₄, quatre heures plus tard. Afin d’éviter toute influence de l’alcool éthylique, l’extrait alcoolique a été maintenu avant son utilisation dans un évaporateur rotatif jusqu’à l’élimination de la totalité de l’alcool, puis reconstitué avec de l’eau distillée et immédiatement administré aux animaux. Chaque groupe de dix souris a ensuite été subdivisé en deux sous-groupes de cinq animaux chacun ; l’un a été euthanasié à quatre semaines et l’autre a été maintenu pendant deux semaines supplémentaires.
À la fin, le sang a été prélevé dans le sinus rétro-orbitaire sous narcose profonde à l’isoflurane (3 %). Les animaux étaient considérés comme morts lorsque les battements cardiaques et les mouvements respiratoires avaient cessé ; l’irréversibilité du phénomène était assurée par une dislocation cervicale immédiatement suivie du prélèvement des organes internes. Le sang a été recueilli dans des tubes Vacutainer contenant un activateur de coagulation ; après coagulation, il a été centrifugé (1465 g) pendant 15 min. Le sérum a été immédiatement séparé, conservé à −20 °C et décongelé juste avant son utilisation.
Afin d’évaluer les marqueurs du stress oxydatif, l’extraction des protéines totales du tissu hépatique a été réalisée par homogénéisation avec une solution tampon phosphate (à 10 mm, pH 7.4). Les extraits protéiques obtenus ont été analysés afin de déterminer la teneur totale en protéines, l’activité de la catalase (CAT), l’activité de la superoxyde dismutase (SOD), l’activité de la glutathion peroxydase (GPx) et la peroxydation lipidique. L’activité de la CAT, de la XOD et de la GPx a été déterminée à l’aide des kits d’essai correspondants (BioVision, Milpitas, CA, États-Unis), conformément aux spécifications du fabricant. La concentration de dialdéhyde malonique (MDA) a été déterminée par réaction avec l’acide thiobarbiturique (TBA). Les résultats ont été mesurés à l’aide d’un spectrophotomètre METERTECH SP-830 Plus.
La chimie sérique a été mesurée à l’aide de l’analyseur semi-automatique à point final STAT-FAX 1904 Plus de Global Medical Instrumentation Inc. (Ramsey, MN, États-Unis), au moyen de kits spécifiques pour la biochimie plasmatique (Diagnosticum Zrt., Budapest, Hongrie), conformément aux spécifications du fabricant.
Les fragments de tissu ont été fixés pendant 24 h dans du formol à 10 % tamponné au phosphate, pH 7, inclus dans de la paraffine, coupés à une épaisseur de 2–3 μm et colorés à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E). L’examen des lames histopathologiques a été réalisé à l’aide d’un système Olympus de traitement et de récupération d’images et du programme Olympus Cell B d’acquisition et de traitement d’images. L’examen histologique a été réalisé par RM, pathologiste expérimenté ne connaissant pas le traitement reçu par chaque groupe. L’examen histopathologique s’est concentré sur les effets classiques de la toxicité du CCl₄, tels que les lésions circulatoires, inflammatoires, nécrotiques et fibrotiques.
Toutes les données sont rapportées sous forme de moyenne ± SD (n = 5). Afin de supposer une distribution gaussienne, la normalité de la distribution a été vérifiée par le test de normalité de Shapiro–Wilk et une ANOVA à deux facteurs, suivie d’un post-test de Bonferroni réalisé pour les comparaisons par paires. La significativité statistique a été fixée à p < 0.05 — intervalle de confiance de 95 %. Les valeurs statistiques et les figures ont été obtenues avec GraphPad Prism version 5.0 pour Windows, GraphPad Software, San Diego, Californie, États-Unis.
La présente étude a été menée afin d’offrir une nouvelle perspective sur l’espèce R. officinalis. Les analyses réalisées sur une teinture de jeunes pousses fraîches ont mis en évidence la présence de polyphénols et de terpénoïdes en quantités significatives dans les jeunes pousses fraîches de R. officinalis, montrant ainsi que le matériel végétal testé pourrait représenter un produit médicinal important. En outre, ce produit médicinal végétal a été testé afin d’évaluer sa capacité à présenter une activité hépatoprotectrice par l’intermédiaire d’un mécanisme antioxydant. Par conséquent, en raison de sa composition chimique, le produit végétal étudié appartenant au romarin pourrait constituer une matière première importante pour les formulations pharmaceutiques, contribuant à l’amélioration de la santé humaine grâce à ses propriétés antioxydantes et hépatoprotectrices, avec des effets significatifs contre les dommages causés par les radicaux libres, lesquels pourraient être utiles pour protéger le tissu hépatique contre les lésions.
Cette étude expérimentale montre qu’une teinture de jeunes pousses fraîches de Rosmarinus officinalis L., riche notamment en acide carnosique, carnosol, rosmanol, rosmadial, acide rosmarinique et 1,8-cinéole, exerce chez des rats soumis au CCl₄ une activité hépatoprotectrice associée à la restauration partielle des enzymes antioxydantes GPx, CAT et SOD, à l’atténuation de la peroxydation lipidique et à l’amélioration histologique. Le niveau de preuve reste préclinique, fondé sur des essais in vitro et une étude animale.
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