Référence : Molecules 2022. — PMC9784123 · DOI 10.3390/molecules27248752 Type : étude expérimentale (analyse phytochimique HPLC-DAD + essais fonctionnels ex vivo sur aorte de rat) · Plante : Vergerette du Canada · Propriété → Circulation & cœur Accès : ⭐ libre → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Mentha suaveolens (MS), Conyza canadensis (CC), Teucrium polium (TP) et Salvia verbenaca (SV) sont utilisées au Maroc pour traiter l’hypertension. Notre objectif était de caractériser la composition et la vasoréactivité d’extraits de MS, CC, TP et SV. Les compositions chimiques des extraits aqueux de MS, SV et TP, et d’un extrait hydrométhanolique de CC, ont été identifiées par HPLC-DAD. L’effet vasoréactif a été testé sur des anneaux d’aorte thoracique de rates Wistar (âgées de 8 à 14 semaines) pré-contractés avec 10 µM de noradrénaline, en l’absence ou en présence de L-NAME 100 µM, d’indométacine 10 µM ou d’atropine 6 µM, afin d’inhiber respectivement la synthase du monoxyde d’azote, la cyclo-oxygénase ou les récepteurs muscariniques. Le L-NAME et l’atropine ont diminué l’effet vasorelaxant provoqué par les faibles concentrations de MS. L’atropine et l’indométacine ont diminué l’effet vasorelaxant des faibles concentrations de SV. Les concentrations élevées de MS ou de SV, ainsi que l’effet de SV et de TP, n’ont été modifiés par aucun antagoniste. L’activation des récepteurs muscariniques et le NO ou la voie de la cyclo-oxygénase sous-tendent respectivement l’effet vasorelaxant de MS et de SV. Aucun de ces mécanismes ne sous-tend l’effet vasorelaxant de CC et de TP. Ces effets vasorelaxants pourraient justifier l’usage des tisanes de ces plantes comme antihypertenseurs en médecine populaire.
Une alimentation à base de végétaux a été suggérée comme ayant un effet protecteur sur le système cardiovasculaire, plusieurs études montrant un bénéfice potentiel en lien avec l’hypertension. Les polyphénols sont l’un des constituants végétaux les plus étudiés dans ce contexte, et les données appuient leur activité antihypertensive, notamment en favorisant une vasorelaxation dépendante et indépendante de l’endothélium et en améliorant le profil lipidique, les défenses antioxydantes et la fonction mitochondriale. Outre leur usage en médecine populaire, les plantes constituent une matrice utile pour l’identification de composés phytochimiques ultérieurement optimisés par l’industrie pharmaceutique. Compte tenu de sa diversité géographique et climatique, le Maroc offre un vaste trésor botanique, constituant une source importante de plantes potentiellement thérapeutiques pour le traitement des maladies cardiovasculaires. Parmi les plantes médicinales qui poussent à l’état sauvage au Maroc et sont couramment utilisées en médecine populaire pour des affections cardiovasculaires telles que l’hypertension figurent Mentha suaveolens Ehrh. (MS), Conyza canadensis L. Cronquist (CC), Salvia verbenaca L. (SV) et Teucrium polium L. (TP).
MS est une herbe vivace qui pousse à l’état sauvage dans les zones humides du Maroc. Elle appartient à la famille des Lamiacées, atteint jusqu’à 100 cm de hauteur et dégage une odeur douceâtre. Il a été rapporté que MS possède une activité hypotensive. Administrés en bolus IV, des extraits méthanolique (20–200 mg/kg) et dichlorométhanolique (1,1–10 mg/kg) de MS ont réduit la pression artérielle et la fréquence cardiaque de rats normotendus anesthésiés à l’uréthane, et l’extrait dichlorométhanolique a également prévenu l’hypertension induite par la noradrénaline. De plus, la rotundifolone, un constituant majeur de l’huile essentielle de Mentha villosa, provoque une hypotension chez le rat par une stimulation non spécifique des récepteurs muscariniques et une vasodilatation. La composition chimique de l’huile essentielle de MS africaine a révélé sa richesse en oxydes de pipériténone, menthone, pulégone, germacrène D et bornéol.
CC appartient à la célèbre famille des Astéracées. C’est une plante annuelle, bisannuelle ou vivace qui pousse sur les sols très humides, immergés dans l’eau douce. CC forme rarement des touffes arbustives, s’élevant à 1–2 m de hauteur. Elle pousse spontanément dans plusieurs régions du Maroc, où elle est populaire pour le traitement des symptômes gastro-intestinaux, le plus souvent la diarrhée et la dysenterie, et comme agent diurétique. Les parties aériennes de CC sont surtout riches en limonène. Récemment, il a été rapporté que les extraits à l’acétone et à l’acétate d’éthyle de CC inhibaient la production de monoxyde d’azote (NO) par la lignée de macrophages leucémiques murins RAW 264.7, mais à des niveaux cytotoxiques (10–100 mg/mL).
La composition et les activités biologiques de SV ont été passées en revue récemment. SV est une plante herbacée vivace indigène des pays méditerranéens. Elle atteint 0,6 m et fleurit de juin à septembre, tandis que les graines mûrissent de juillet à octobre. Elle préfère les sols secs ou humides et tolère la sécheresse. SV est utilisée pour plusieurs problèmes de santé, dont l’hypertension, sous forme de décoction/infusion. SV est riche en composés phénoliques, notamment le carnosate de méthyle et l’acide rosmarinique. Son huile essentielle est riche en acides gras et en composés carbonylés.
TP est un arbrisseau vivace, de 20–50 cm de hauteur, que l’on rencontre largement réparti dans les lieux secs et pierreux des collines et des déserts de presque tous les pays méditerranéens, du Sud-Ouest de l’Asie, de l’Europe et de l’Afrique du Nord. Les parties aériennes et les racines de TP ont été utilisées pour le traitement de l’hypertension, de la douleur, de l’inflammation, du diabète, des rhumatismes. Un extrait éthanolique de TP (100–400 mg/kg, IV) a abaissé la pression artérielle élevée, mais pas la fréquence cardiaque, induite par une perfusion d’angiotensine II chez le rat. Les principaux composés trouvés dans l’extrait méthanolique de TP sont l’acide sinapique et l’eugénol, tandis que son huile essentielle est riche en α-pinène, cis-verbénol et myrténal.
Dans cette étude, nous avons cherché à caractériser la composition d’extraits de MS, CC, SV et TP et à tester leur effet fonctionnel en tant qu’extraits vasoactifs à l’aide de l’aorte de rat.
La présence d’acides phénoliques, de flavonoïdes, de tanins et d’alcaloïdes a été recherchée à l’aide de réactions générales. Des composés phénoliques ont été trouvés dans tous les échantillons « [ ] ». En revanche, la présence de tanins n’a été confirmée que dans l’extrait de CC, et les alcaloïdes n’ont été détectés dans aucun extrait « [ ] ». La composition phénolique des extraits a été analysée par HPLC-DAD, et plusieurs acides phénoliques ont été identifiés « [ ] ».
Des différences qualitatives et quantitatives ont été observées entre les quatre extraits végétaux « [ ] ». Les extraits aqueux de MS et de CC contenaient la plus grande quantité des composés phénoliques identifiés (respectivement 25,90 et 11,96 mg/g d’extrait sec). L’acide rosmarinique était le composé majeur identifié dans l’extrait aqueux de MS (19,80 mg/g d’échantillon sec). L’extrait aqueux de SV (Lamiacées) contenait également de l’acide rosmarinique, mais en quantité bien moindre (0,11 mg/g d’échantillon sec). Dans cet extrait, la présence des acides 3-O- et 4-O-caféoylquiniques a également été détectée, le dernier étant le composé le plus abondant « [ ] ».
Concernant l’extrait aqueux de TP, seule la présence des acides 3-O-caféoylquinique et isoférulique a été détectée, le premier étant prédominant « [ ] ».
L’extrait hydrométhanolique de CC présentait une diversité plus élevée, avec sept acides hydroxycinnamiques identifiés « [ ] ». L’acide phénolique prédominant de cet extrait était l’acide 3,5-di-O-caféoylquinique (4,17 mg/g d’échantillon sec), suivi des acides 4,5-di-O-caféoylquinique et 5-O-caféoylquinique (respectivement 3,31 et 2,68 mg/g d’échantillon sec) « [ ] ».
Les quatre extraits ont provoqué une relaxation marquée de l’aorte thoracique de rat précontractée avec de la noradrénaline « [ ] », sans différence d’effet maximal entre les quatre extraits « [ ] ». Les profils de l’effet relaxant différaient entre les extraits testés. CC et TP ont provoqué une relaxation simple, concentration-dépendante, de l’aorte thoracique de rat « [ ] », tandis que l’effet relaxant de MS et de SV présentait un profil en deux étapes « [ ] ». Cela s’est traduit par une CE50 plus élevée pour MS et SV comparativement à la CE50 de CC et de TP (MS 5,22 ± 1,96 mg/mL ; SV 4,96 ± 0,82 mg/mL ; CC 0,30 ± 0,13 mg/mL ; TP 1,30 ± 0,35 mg/mL ; p < 0,05).
L’incubation des anneaux d’aorte thoracique de rat avec du L-NAME 100 µM ou de l’atropine 6 µM a presque aboli l’effet vasorelaxant provoqué par les plus faibles concentrations d’extrait de MS testées, mais n’a eu aucun effet sur la vasorelaxation induite par les plus fortes concentrations « [ ] ». L’indométacine 10 µM n’a pas modifié la vasorelaxation induite par MS (quelle que soit la concentration) dans l’aorte thoracique de rat « [ ] ».
L’effet vasorelaxant induit par les plus faibles concentrations d’extrait de SV testées a été diminué par l’atropine 6 µM et l’indométacine 10 µM, mais pas par le L-NAME 100 µM, bien qu’aucun de ces médicaments n’ait modifié l’effet des plus fortes concentrations testées « [ ] ».
Les courbes concentration-réponse de l’effet vasorelaxant de CC ou de TP n’ont été modifiées par aucun des antagonistes testés « [ ] ».
Notre étude montre que les extraits aqueux de MS, SV et TP et l’extrait hydrométhanolique de CC ont provoqué une relaxation marquée de l’aorte thoracique de rat. Le profil de l’effet vasorelaxant différait entre les quatre plantes ; alors que CC et TP ont provoqué une relaxation concentration-réponse typique de l’aorte thoracique de rat, MS et SV ont montré une vasorelaxation concentration-réponse en deux étapes. Les mécanismes sous-tendant cet effet étaient caractéristiques de chaque plante.
L’usage d’extraits végétaux, ainsi que d’autres formes alternatives de traitement médical, pour la prévention et le traitement des maladies a regagné en popularité ces dernières années, car ils contiennent divers constituants bioactifs aux propriétés stimulantes pour la santé. En particulier, ils contiennent des composés polyphénoliques, tels que des flavonoïdes et des tanins. Par conséquent, afin d’établir une relation possible entre les composés présents dans les extraits et leur potentiel biologique, la composition phénolique des extraits a été analysée par HPLC-DAD, et plusieurs acides phénoliques ont été identifiés. Les résultats de l’analyse phytochimique de ces plantes médicinales montrent la présence de polyphénols dans les quatre extraits. De plus, seul l’extrait de CC s’est révélé contenir des tanins, et aucun des extraits ne contenait d’alcaloïdes. De nombreuses études rapportent l’impact bénéfique de la consommation de polyphénols dans la réduction du risque de certaines maladies chroniques telles que les maladies cardiovasculaires.
L’acide rosmarinique était le composé majeur identifié dans l’extrait aqueux de MS, ce qui est en accord avec d’autres espèces de Lamiacées. Comme cet acide phénolique est considéré comme un marqueur taxonomique de cette famille botanique et que les espèces de Mentha sont des sources prometteuses de ce métabolite, ce résultat n’a pas constitué une surprise. Récemment, Sytar et ses collègues ont caractérisé le profil phénolique de l’extrait méthanolique de feuilles de MS et, en plus d’autres acides hydroxycinnamiques qui n’ont pas été trouvés dans notre extrait, ont décrit la présence d’acide 5-O-caféoylquinique, comme vérifié dans notre échantillon. L’extrait aqueux de SV (autre Lamiacée) contenait également de l’acide rosmarinique, mais en quantité bien moindre, et nous avons également pu détecter la présence des acides 3-O- et 4-O-caféoylquiniques, le dernier étant le composé le plus abondant.
Dans l’extrait aqueux de TP, nous n’avons pu détecter que la présence des acides 3-O-caféoylquinique et isoférulique, le premier étant le plus prédominant. Bien qu’il s’agisse d’une espèce de la famille des Lamiacées, l’acide rosmarinique n’a pas été détecté dans notre extrait aqueux, en accord avec ce qui est décrit pour l’extrait éthanolique de cette espèce. Nous n’avons pas d’explication claire à cela, mais cela pourrait être lié aux conditions géographiques particulières du lieu de récolte de la plante et au fait que nous avons utilisé un extrait aqueux plutôt qu’un extrait méthanolique comme habituellement étudié. Ces auteurs ont également identifié la présence des acides 5-O-caféoylquinique, férulique et caféique, qui n’ont pas été détectés dans notre extrait.
L’extrait hydrométhanolique de CC présentait une diversité plus élevée, avec sept acides hydroxycinnamiques identifiés. L’acide phénolique prédominant de cet extrait était l’acide 3,5-di-O-caféoylquinique, suivi des acides 4,5-di-O-caféoylquinique et 5-O-caféoylquinique, ce qui était en accord avec les résultats obtenus par Fraisse et al. pour l’extrait hydroéthanolique. Ces auteurs ont caractérisé les dérivés caféoyl de quelques espèces de la famille des Astéracées, dont CC, et, en plus des composés les plus abondants, ils ont trouvé de faibles teneurs en un autre acide dicaféoylquinique (l’acide 1,5-di-O-caféoylquinique), ce qui est aussi en accord avec nos résultats. À notre connaissance, les acides 3-O-, 4-O- et 3,4-di-O-caféoylquiniques ont été identifiés pour la première fois dans cette espèce. Comme la composition phénolique est influencée par les conditions environnementales (température, humidité et rayonnement UV), par le site de collecte et par le stade de croissance, les différences obtenues dans le profil phénolique ne sont pas une surprise.
De façon intéressante, il a été récemment rapporté que l’acide rosmarinique réduit la pression artérielle dans le modèle d’hypertension induite par l’angiotensine II, un effet qui semble sélectif des animaux hypertendus (mais pas normotendus). Comme ce composé était le principal trouvé dans l’extrait de MS, on pourrait penser qu’il était principalement responsable de l’effet vasorelaxant de l’extrait aqueux de MS. Cependant, l’extrait aqueux de SV a induit une vasorelaxation similaire dans l’aorte thoracique de rat et, bien qu’il contînt également de l’acide rosmarinique, celui-ci était présent en quantité bien moindre. Il est donc possible que l’effet vasorelaxant de l’acide rosmarinique soit suffisamment puissant pour être manifeste même en faible quantité. Comme l’acide rosmarinique était le seul composé identifié dans les extraits de MS et de SV, c’est-à-dire ceux qui présentaient un effet relaxant en deux étapes, il est possible que ce composé contribue à leur puissant effet vasorelaxant. De façon intéressante, dans une étude récente utilisant le même modèle expérimental que celui employé dans la présente étude, il a été rapporté que l’acide rosmarinique atténuait la dysfonction endothéliale induite par le H2O2. Cela concorde avec la vasorelaxation médiée par le NO que nous avons pu observer comme sous-tendant la partie inférieure de la courbe concentration-réponse obtenue pour les extraits aqueux de MS et de SV. De plus, en accord avec cela, on sait que l’apport de polyphénols améliore la fonction endothéliale et a un effet antihypertenseur via la voie NO-cGMP.
Les quatre extraits testés dans cette étude étaient riches en acides caféoylquiniques, qui ont des effets antihypertenseurs via plusieurs mécanismes moléculaires, dont l’activité antioxydante et la production de NO dépendante de l’endothélium. Cependant, à notre connaissance, l’effet particulier des différents acides caféoylquiniques sur la vasoréactivité ou la régulation de la pression artérielle n’a pas été établi. Néanmoins, les résultats obtenus suggèrent qu’au moins en partie, cette classe de composés a un fort effet vasorelaxant.
Il est bien documenté que, dans le système vasculaire, la stimulation endothéliale des récepteurs muscariniques M1, M3 et M5 produit un effet vasorelaxant. Néanmoins, étant donné que la vasorelaxation produite par TP et CC sur des segments d’aorte de rat n’a pas été affectée par l’atropine, un antagoniste des récepteurs muscariniques, on peut exclure la possible implication de la stimulation des récepteurs muscariniques à l’acétylcholine dans les réponses vasodilatatrices produites par ces deux extraits dans les conditions expérimentales actuelles. De façon intéressante, la vasorelaxation induite par les plus faibles concentrations (0,001–0,3 mg/mL) de MS et de SV a été nettement bloquée par l’atropine, suggérant l’implication des récepteurs muscariniques. De la même manière que ce qui a été observé pour l’effet vasorelaxant de TP et de CC, les récepteurs muscariniques ne semblent pas contribuer à l’effet vasorelaxant provoqué par les plus fortes concentrations (1–30 mg/mL) de MS et de SV.
L’une des voies par lesquelles l’activation des récepteurs muscariniques provoque la vasorelaxation est la libération de NO. En effet, il est bien établi que l’endothélium vasculaire peut synthétiser et libérer différents facteurs relaxants tels que le NO et d’autres facteurs relaxants dérivés de l’endothélium (EDRF) comme la PGI2 et l’EDHF. L’activation des récepteurs muscariniques endothéliaux libère du NO, le principal EDRF, qui provoque la vasorelaxation par l’activation de la guanylate cyclase et la production de cGMP. Afin d’élucider si l’effet vasorelaxant des extraits végétaux testés était médié par la voie du NO, les anneaux d’aorte de rat isolés ont été incubés en présence de L-NAME, un inhibiteur de la NOS. Dans ces conditions, l’effet vasodilatateur provoqué par les faibles concentrations de MS a été presque aboli, mettant en évidence le rôle du NO dans la vasorelaxation associée. Au contraire, la vasorelaxation provoquée par les fortes concentrations de MS et de SV et par TP n’a pas été modifiée par le L-NAME, suggérant qu’elles sont indépendantes du NO. Inversement, l’indométacine, inhibiteur de la cyclo-oxygénase, n’a inhibé que la vasorelaxation induite par les faibles concentrations de SV, révélant un rôle particulier de la voie de la cyclo-oxygénase dans la vasorelaxation de cet extrait.
Notre étude comporte certaines limites. Premièrement, nous n’avons utilisé que des rates (dans un souci de respect des 3R), et l’existence de différences liées au sexe dans la réactivité vasculaire a été rapportée, les androgènes comme les œstrogènes jouant un rôle. Deuxièmement, notre raisonnement mécanistique repose sur l’approche fonctionnelle ex vivo qui a été définie pour atteindre l’objectif de l’étude, et aucune analyse moléculaire n’a été réalisée afin d’approfondir la caractérisation des mécanismes impliqués dans l’effet vasorelaxant des extraits. Troisièmement, bien que le potentiel biologique des extraits analysés puisse être quelque peu associé aux composés identifiés, nous sommes conscients que les extraits sont des mélanges complexes et que, à ce titre, d’autres composés et/ou métabolites, ainsi que d’éventuelles interactions entre les différents composés, pourraient également contribuer à l’activité relaxante observée. Par conséquent, d’autres explorations scientifiques sont nécessaires pour révéler le composé actif exact responsable de l’activité biologique observée de ces quatre extraits de plantes marocaines. Nous avons décidé de travailler avec les extraits aqueux car les feuilles et fleurs fraîches de ces plantes sont habituellement consommées au Maroc sous forme de tisanes. Cependant, une étude préliminaire (données non présentées) a suggéré que l’effet gastro-intestinal concernant CC était plus marqué lorsqu’un extrait hydrométhanolique était testé.
Tous les composés utilisés pour l’essai fonctionnel ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (États-Unis), à l’exception du NaCl (VWR chemicals, Louvain, Belgique), du KCl, du CaCl2, du glucose, du NaHCO3, de l’acide ascorbique (PanreacQuimica, Castellar del Vallès, Espagne), du NaH2PO4×H2O, du Na2EDTA, de l’acide formique et du méthanol Licrosolv® (MERCK, Darmstadt, Allemagne), des acides 3-O-caféoylquinique, 4-O-caféoylquinique, 1,5-di-O-caféoylquinique, 3,4-di-O-caféoylquinique, 3,5-di-O-caféoylquinique, 4,5-di-O-caféoylquinique et isoférulique (Chengdu Biopurity Phytochemicals Ltd., Chengdu, Chine), et des acides 5-O-caféoylquinique et rosmarinique (Extrasynthèse, Genay, France).
Une solution de Krebs-Henseleit a été préparée chaque jour d’expérience (mM) : NaCl 118, KCl 4,8, CaCl2 2,5, MgSO4 1,2, NaH2PO4 1,2, glucose 11, NaHCO3 25, Na2EDTA 0,03 et acide citrique 0,3. Les solutions mères d’acétylcholine et de KCl ont été préparées chaque semaine et conservées à 4 °C. Tous les composés ont été dissous dans de l’eau distillée, à l’exception de l’indométacine, qui a été dissoute dans l’éthanol. Des solutions fraîches ont été préparées pour chaque expérience.
Nous avons utilisé les feuilles et les fleurs de MS, CC, SV et TP, récoltées entre mars et juillet 2018 dans leur habitat naturel à Taounate, une province du nord du Maroc. L’authentification des quatre plantes a été réalisée sur la base de leurs caractéristiques macroscopiques et microscopiques. L’identification macroscopique a été effectuée par Khalid Derraz, botaniste à la Faculté des Sciences et Techniques de Fès, Maroc, tandis que l’authentification microscopique a été réalisée par la Professeure Cioanca Oana de l’Université de Médecine et de Pharmacie Grigore T. Popa de Iasi, Roumanie. Les plantes ont été enregistrées dans l’herbier du Département de Biologie de la Faculté des Sciences et Technologies de l’Université Sidi Mohamed Ben Abdellah, Fès, Maroc, sous les numéros MA-FSTF 21 pour MS, MA-FSTF 33 pour CC, MA-FSTF 55 pour TP et MA-FSTS 44 pour SV.
Les parties aériennes de chaque plante étudiée (feuilles et fleurs ensemble) ont été nettoyées, séchées à l’ombre et réduites en poudre à l’aide d’un broyeur électrique (Moulinex® 320). Ensuite, des extraits aqueux des feuilles et fleurs de MS, SV et TP ont été préparés, ainsi qu’un extrait hydrométhanolique des feuilles et fleurs de CC. Les extraits aqueux de MS, SV et TP ont été préparés en macérant 50 g de chaque matériel pulvérisé dans 500 mL d’eau distillée pendant 24 h. L’extrait hydrométhanolique de CC a été préparé en macérant 50 g du matériel séché avec 500 mL d’un mélange eau:méthanol (70:30), pendant 24 h. Les extraits obtenus ont été filtrés, centrifugés, congelés à −20 °C et lyophilisés (le méthanol a été évaporé à sec). Les rendements en pourcentage, rapportés aux matières séchées de départ, étaient de 40 %, 35 % et 45 % pour les extraits aqueux secs de MS, TP et SV, respectivement, et de 28 % pour l’extrait hydrométhanolique sec de CC. Tous les extraits ont été conservés à 4 °C jusqu’aux analyses chimiques et pharmacologiques. Des échantillons de référence (voucher) ont été déposés au Laboratoire de Pharmacologie de la Faculté de Pharmacie de l’Université de Porto (MS2017, CC2017, SV2017 et TP2017).
Un criblage phytochimique a été réalisé pour vérifier la présence d’acides phénoliques, de flavonoïdes, de tanins et d’alcaloïdes, en appliquant des tests standard. Pour rechercher la présence de composés phénoliques, quelques gouttes d’hydroxyde de sodium à 20 % ont été ajoutées à 1 mL de chaque extrait, dans le but d’observer l’intensification de la couleur. La présence de tanins a été confirmée à l’aide de la réaction à la gélatine. Brièvement, une goutte d’acide chlorhydrique a été ajoutée à 1 mL de chaque extrait, suivie de l’ajout de solution de gélatine, goutte à goutte, pour éviter la redissolution du précipité formé.
Les alcaloïdes ont été recherchés à l’aide des tests généraux de précipitation des alcaloïdes avec les réactifs de Dragendorff, de Mayer et de Bertrand, selon une procédure préalablement décrite. Un total de 10 mL d’acide chlorhydrique à 10 % a été ajouté à chaque extrait, et les solutions obtenues ont été alcalinisées avec une solution d’ammonium diluée (1:1) et mélangées à 20 mL d’éther éthylique. Ensuite, une solution de 10 mL d’acide chlorhydrique à 10 % a été mélangée à la phase éthérée, et la solution acide a été répartie dans des tubes à essai pour ajouter les réactifs de Dragendorff, de Mayer et de Bertrand. Cette information a été améliorée dans la présente version.
Un total de 20 μL de chaque extrait a été analysé sur une unité HPLC (Gilson), à l’aide d’une colonne Spherisorb ODS2 (25,0 × 0,46 cm ; taille de particule 5 μm), selon une procédure décrite. Le système de solvants utilisé était un gradient d’eau-acide formique (19:1) (A) et de méthanol (B), débutant avec 5 % de méthanol et utilisant un gradient pour obtenir 15 % de B à 3 min, 25 % de B à 13 min, 30 % de B à 25 min, 35 % de B à 35 min, 45 % de B à 39 min, 45 % de B à 42 min, 50 % de B à 44 min, 55 % de B à 47 min, 70 % de B à 50 min, 75 % de B à 56 min et 80 % de B à 60 min, à un débit de solvant de 0,9 mL/min. La détection a été réalisée avec un détecteur à barrette de diodes Gilson (DAD). Les données ont été traitées avec le logiciel Unipoint System (Gilson Medical Electronics, Villiers le Bel, France). Les composés de chaque extrait ont été identifiés en comparant leurs temps de rétention et leurs spectres UV-vis dans la gamme 200–400 nm avec des standards authentiques, et leur quantification a été réalisée par l’absorbance enregistrée dans les chromatogrammes par rapport à des standards externes. Chaque extrait a été analysé en triple.
Des rates Wistar (âgées de 8 à 14 semaines) ont été utilisées. Les animaux étaient maintenus dans l’animalerie de l’ICBAS-Porto, Portugal (approuvée par l’autorité nationale compétente : 024159/2017-DGAV). Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la Directive UE 2010/63/UE pour les expérimentations animales et rapportées conformément aux lignes directrices ARRIVE. Selon la politique des 3R de Russel et Burch, nous n’avons utilisé que des rates, celles-ci étant issues de la même portée que des rats mâles déjà affectés à une autre étude en cours ; avec cette approche, aucun élevage supplémentaire n’a été réalisé pour les besoins de la présente étude.
Les animaux étaient hébergés dans des cages conventionnelles, dans des conditions standard de température (21 °C), d’humidité (40–60 %) et de cycles alternés de lumière et d’obscurité (12 h/12 h). Ils avaient un accès ad libitum à de l’eau du robinet autoclavée et à un régime standard de laboratoire pour rongeurs (4RF21, Mucedola S.r.l., Milan, Italie). Du matériel d’enrichissement, tel que du matériel de nidification et des tunnels en papier, a été fourni à toutes les cages. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices de l’Union européenne pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (Directive 2010/63/UE et Décision 1999/575/CE) et aux lignes directrices portugaises (Direção-Geral da Alimentação e Veterinária, DGAV, Portugal).
Le jour de l’expérience fonctionnelle, les animaux ont été euthanasiés de façon aléatoire par décapitation à l’aide d’une petite guillotine pour animaux. L’aorte thoracique a été prélevée, débarrassée du tissu conjonctif adhérent et découpée en anneaux de 5 mm de longueur. Ensuite, les anneaux ont été montés dans des cuves à organe remplies de solution de Krebs-Henseleit chauffée (37 °C) et aérée (95 % O2, 5 % CO2), sous une tension de repos de 1,5 g. Chaque anneau aortique a été laissé s’équilibrer pendant 60 min. Après cela, la viabilité de l’endothélium a été confirmée par un effet relaxant de l’acétylcholine 10 µM sur une précontraction induite par la noradrénaline 10 µM. Seuls les anneaux qui présentaient une relaxation supérieure à 50 % de la précontraction induite par la noradrénaline ont été utilisés. Le tissu a ensuite été rincé toutes les 10 min pendant 30 min. Puis le tissu a été contracté avec de la noradrénaline 10 µM, et des courbes concentration-réponse cumulatives ont été obtenues pour chaque extrait en l’absence ou en présence de L-NAME 100 µM (inhibiteur de la synthase du monoxyde d’azote), d’indométacine 10 µM (inhibiteur de la cyclo-oxygénase) ou d’atropine 6 µM (antagoniste des récepteurs muscariniques). Lorsqu’ils étaient utilisés, les antagonistes étaient ajoutés à la cuve à organe 20 min avant la seconde précontraction induite par la noradrénaline. Une seule condition expérimentale (contrôle ou en présence d’un médicament) était testée de façon aléatoire sur chaque anneau aortique. La gamme de concentrations des extraits testés s’est révélée non cytotoxique lors du test MTT réalisé sur des cellules de cancer cutané A375 et des cellules de cancer du sein MCF-7 (données non présentées).
L’unité expérimentale était l’animal individuel. Pour chaque expérience fonctionnelle, la réponse de chaque extrait (en l’absence ou en présence d’un antagoniste) a été calculée en pourcentage de la précontraction stable correspondante induite par la noradrénaline. Les valeurs d’Emax (effet maximal) et de CE50 (concentration de l’extrait provoquant 50 % de la réponse maximale) ont été calculées à l’aide du logiciel GraphPad Prism, version 7.00 pour Windows. Toutes les valeurs ont été exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). L’analyse statistique a été réalisée par ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Tukey pour comparer les valeurs d’Emax ou de CE50 entre les quatre plantes, et par ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett pour comparer l’Emax entre l’effet en présence de chaque antagoniste et l’effet en condition contrôle (sans prétraitement). Une valeur de p inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. La taille de l’échantillon n’a pas été calculée, puisque tous les animaux étaient déjà affectés à une autre étude en cours du groupe de recherche (Réduction) ; seule l’aorte thoracique a été utilisée dans cette étude.
En conclusion, notre étude a montré pour la première fois que les extraits aqueux de feuilles et de fleurs de MS, SV et TP et l’extrait hydrométhanolique de feuilles et de fleurs de CC possèdent un puissant effet vasorelaxant qui pourrait justifier leur usage en médecine populaire pour le traitement et la prévention des maladies cardiovasculaires telles que l’hypertension. Nos résultats suggèrent que l’activation des récepteurs muscariniques et la production de NO contribuent à la vasorelaxation induite par MS, et que l’activation des récepteurs muscariniques et la production de PGI2 contribuent à la vasorelaxation induite par SV, en particulier à faibles concentrations. Inversement, les fortes concentrations de MS et de SV, ainsi que la vasorelaxation provoquée par CC et TP, sont indépendantes des récepteurs muscariniques, de la production de NO et de la voie de la cyclo-oxygénase.
Encart — Mécanisme vasorelaxant et place de la vergerette du Canada. L’étude compare quatre plantes marocaines antihypertensives traditionnelles ; la vergerette du Canada (Conyza canadensis, CC, seule Astéracée du lot) y tient une place parmi d’autres, pas au premier plan. Testée sous forme d’extrait hydrométhanolique (feuilles + fleurs), elle a provoqué une relaxation nette et concentration-dépendante de l’aorte de rat, avec la CE50 la plus basse des quatre plantes (0,30 mg/mL), donc la plus « puissante » en termes de concentration efficace. Sa composition est dominée par les acides dicaféoylquiniques (3,5-di-O-caféoylquinique majoritaire) ; c’est le seul extrait contenant des tanins. Point clé sur le mécanisme : contrairement à la menthe et à la sauge, l’effet vasorelaxant de la vergerette n’est modifié par AUCUN des inhibiteurs testés (atropine, L-NAME, indométacine) — il est donc indépendant des récepteurs muscariniques, du NO et de la cyclo-oxygénase ; le ou les mécanismes réels restent non identifiés par cette étude. Niveau de preuve : étude ex vivo/in vitro sur aorte de rates (un seul sexe, pas d’analyse moléculaire, effectifs non calculés) ; résultats préliminaires soutenant un usage traditionnel, sans transposition clinique humaine.
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