Référence : Foods 2022. — PMC8909519 · PMID 35267291 · DOI 10.3390/foods11050658 Type : étude phytochimique · Plante : Lierre terrestre · Propriété → Antioxydant Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Dans la présente étude, du lierre terrestre a été récolté dans différents habitats naturels de Croatie et soumis à une analyse de criblage de sa composition nutritionnelle et bioactive. Afin d’obtenir une récupération maximale des composés phénoliques, différentes techniques d’extraction ont été étudiées : extraction assistée par la chaleur (HAE), extraction assistée par micro-ondes (MAE) et extraction à l’eau subcritique (SWE). Les extraits préparés ont été analysés par des méthodes spectrophotométriques, par LC-MS/MS et par HPLC-PAD. Les résultats des analyses nutritionnelles, réalisées à l’aide des méthodes normalisées de l’AOAC, ont montré la richesse des échantillons en fibres alimentaires insolubles, en protéines, en calcium et en potassium, tandis que la rutine et les acides chlorogénique, cryptochlorogénique, caféique et rosmarinique étaient les composés phénoliques les plus dominants. En outre, l’analyse LC-MS/MS a révélé la présence d’apigénine et de lutéoline sous forme glycosylée. La récupération maximale des composés phénoliques cibles a été obtenue par MAE, tandis que la SWE a conduit à la formation de nouveaux antioxydants, phénomène communément appelé néoformation. De plus, la composition phénolique des extraits préparés a pu être prédite efficacement par spectroscopie NIR associée à une modélisation par ANN.
La Croatie est un pays doté d’une flore vasculaire riche car, malgré sa petite superficie de 56 594 km², elle compte au total 5 536 taxons (4 228 espèces et 1 108 sous-espèces). Du point de vue du nombre de taxons par unité de surface, la Croatie se classe ainsi au troisième rang européen pour la richesse floristique, derrière la Slovénie et l’Albanie. Cette richesse exceptionnelle résulte de la position favorable de la Croatie dans quatre régions biogéographiques européennes (alpine, continentale, méditerranéenne et pannonienne) et à la frontière entre les zones climatiques continentale et méditerranéenne. Elle a été moins affectée par les périodes glaciaires et de nombreuses espèces y ont survécu à l’état de reliques. La grande diversité du relief terrestre (hautes ceintures montagneuses, poljés karstiques, vallées fluviales et littoraux découpés comptant plus de 1 000 îles et îlots) contribue à la préservation de nombreuses espèces végétales et au développement d’espèces endémiques.
La Croatie possède une longue histoire d’utilisation des plantes et, jusqu’à aujourd’hui, nombre d’entre elles ont été intégrées à différents aspects de la vie. Le nombre total de plantes entretenant une relation quelconque avec les êtres humains en Croatie est estimé à 1 144 taxons, principalement utilisés en médecine (25 %) et dans l’alimentation (12 %). Après les Rosaceae et les Asteraceae, la famille des Lamiaceae est la plus riche en espèces médicinales de Croatie, ainsi qu’en plantes aromatiques, très appréciées dans la cuisine traditionnelle croate pour leurs propriétés épicées et aromatiques, telles que les espèces des genres Origanum et Thymus ainsi que Rosmarinus officinalis L. À l’échelle mondiale, la famille des Lamiaceae est la sixième plus grande famille végétale, avec plus de 200 genres et 7 000 espèces, tandis qu’en Croatie elle représente 4 % de la flore vasculaire totale, avec 54 sous-espèces et 172 espèces. Glechoma hederacea L., connu sous le nom de lierre terrestre, est l’une d’entre elles et, bien qu’il soit utilisé depuis des générations en médecine populaire, les données scientifiquement fondées sur son activité biologique et ses compositions nutritionnelle et bioactive demeurent encore insuffisantes. Parmi celles-ci ont été rapportés l’activité antioxydante — supérieure à celle de la vitamine C et du Trolox — ainsi que le potentiel anti-inflammatoire et antimutagène du lierre terrestre, dus à la présence de composés phénoliques. Les composés phénoliques les plus courants chez les plantes sont les flavonoïdes et les acides phénoliques, dont les propriétés antioxydantes proviennent des groupes hydroxyle de la structure cyclique et de leur disposition. Afin de surmonter les limites des techniques classiques d’extraction assistée par la chaleur, notamment la perte et la dégradation des composés phénoliques à des températures élevées, de nombreuses techniques novatrices ont été introduites, telles que l’extraction assistée par micro-ondes et l’extraction à l’eau subcritique. Les micro-ondes sont des ondes électromagnétiques non ionisantes situées entre les rayons X et les rayons infrarouges dans le spectre électromagnétique. Le principe de l’extraction assistée par micro-ondes repose sur un système de chauffage particulier permettant un chauffage interne homogène de l’ensemble du volume de matière, ce qui entraîne une augmentation de la pression à l’intérieur des cellules végétales, suivie de leur rupture et de la libération des composés cibles. L’eau subcritique — eau chaude maintenue à une pression suffisante pour conserver l’état liquide à une température critique située entre le point d’ébullition de l’eau et son point critique — est souvent utilisée pour extraire des composés apolaires ou organiques, car les propriétés de l’eau dans son domaine subcritique correspondent à celles des solvants organiques.
L’objectif de cette étude était d’examiner de manière exhaustive le lierre terrestre récolté dans divers habitats naturels de la partie continentale de la Croatie afin d’évaluer sa composition nutritionnelle et bioactive, dans la perspective de son éventuelle utilisation ultérieure dans la formulation d’aliments fonctionnels en tant que source de composés naturels précieux. Bien que le lierre terrestre soit une plante médicinale utilisée depuis longtemps en médecine populaire, il a été insuffisamment décrit par des données scientifiquement fondées. Afin d’obtenir une efficacité d’extraction maximale des composés d’intérêt — les polyphénols —, l’extraction classique assistée par la chaleur ainsi que des techniques novatrices, dont l’extraction assistée par micro-ondes et l’extraction à l’eau subcritique, ont été étudiées. Pour rechercher les similitudes ou les différences associées aux habitats naturels et/ou aux techniques d’extraction appliquées, les extraits préparés ont été enregistrés par spectroscopie dans le proche infrarouge (NIR), et les données ont été utilisées pour l’analyse en composantes principales (PCA) et la modélisation par réseaux de neurones artificiels (ANN).
Tous les échantillons de lierre terrestre ont été récoltés dans la partie continentale de la Croatie en avril 2020 : l’échantillon G1 a été récolté à Lobor (comitat de Krapina-Zagorje), l’échantillon G2 à Zagreb (ville de Zagreb), l’échantillon G3 à Bilogora (comitat de Bjelovar-Bilogora), l’échantillon G4 à Sveti Ilija (comitat de Varaždin), l’échantillon G5 à Donja Voća (comitat de Varaždin) et les échantillons G6 et G7 à Sikirevci (comitat de Brod-Posavina) (documents supplémentaires, figures S1 et S2).
L’acide chlorhydrique, les indicateurs vert de bromocrésol et rouge de méthyle, l’acide borique, le réactif de Folin–Ciocalteu et le carbonate de sodium ont été fournis par Kemika (Zagreb, Croatie). Les comprimés de Kjeldahl ont été achetés auprès de CarlRoth (Karsruhe, Allemagne). Un kit intégré de dosage des fibres alimentaires totales a été acheté auprès de Megazyme (Wicklow, Irlande). L’acide gallique (>97 %), l’acide rosmarinique (97 %), l’acide caféique (étalon HPLC), l’acide cryptochlorogénique (>98 %), l’acide chlorogénique (95 %), la rutine trihydratée (>97 %), la lutéoline (>98 %), l’apigénine (>97 %), l’acide (S)-6-méthoxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique (Trolox), le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH) et le sel diammonique de l’acide 2,2′-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis). Le méthanol a été fourni par Panreac (Barcelone, Espagne), et l’acide sulfurique, l’hexane, l’éthanol, l’acide formique et l’acétonitrile par Carlo Erba (Val-de-Reuil, France). L’acétone a été fournie par Gram-mol d.o.o. (Zagreb, Croatie). Tous les produits chimiques utilisés dans les procédures expérimentales étaient de qualité analytique ou de qualité HPLC.
Les parties aériennes récoltées du lierre terrestre ont été séchées à température ambiante pendant 3 jours jusqu’à une teneur en matière sèche supérieure à 90,0 % (tableau 1). Les parties séchées ont été broyées et tamisées, et une fraction granulométrique inférieure à 450 µm a été utilisée pour les expériences et analyses ultérieures.
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La matière sèche, la teneur en protéines brutes, la teneur en huile brute et la teneur en matières minérales brutes ont été déterminées conformément aux méthodes AOAC 930.15, AOAC 976.05, AOAC 920.39 et AOAC 942.05, respectivement. L’analyse de la composition en acides gras, réalisée selon la méthode EN ISO 5509, a été effectuée sur un chromatographe en phase gazeuse Agilent série 6890 équipé d’un détecteur sélectif de masse Agilent Inert (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis). Les teneurs en fibres insolubles et solubles de poids moléculaire élevé ont été déterminées à l’aide du kit Integrated Total Dietary Fiber Assay conformément à la méthode AOAC 2011.25. La teneur en micro- et macroéléments a été analysée au moyen d’un spectromètre de masse à plasma à couplage inductif (Agilent 7500cx, Agilent Technologies, Tokyo, Japon).
Toutes les techniques d’extraction ont été mises en œuvre avec les paramètres optimaux déterminés au moyen de modèles mathématiques et de surfaces de réponse 3D générées dans le logiciel Design Expert (version 12, Minneapolis, MN, États-Unis), en utilisant la méthodologie des surfaces de réponse et un plan composite centré. L’optimisation des paramètres d’extraction a été réalisée sur l’échantillon G3. De l’eau distillée a été utilisée comme solvant pour toutes les techniques d’extraction. L’extraction classique assistée par la chaleur (HAE) a été réalisée dans un bain-marie Inko VKZ ERN (Inkolab d.o.o., Zagreb, Croatie) pendant 10 min à une température de 100 °C et avec un rapport échantillon/solvant de 1 g/100 mL (m/v). L’extraction assistée par micro-ondes (MAE) a été réalisée dans un système avancé de digestion par micro-ondes Ethos Easy (Milestone, Sorisole, Italie) pendant 4,93 min à 90 °C et avec un rapport échantillon/solvant de 1 g/100 mL (m/v). La puissance des micro-ondes a été maintenue à 900 W jusqu’à ce que la température cible soit atteinte. L’extraction à l’eau subcritique (SWE) a été réalisée dans le système décrit par Jokić et al. pendant 5 min à 200 °C et avec un rapport échantillon/solvant de 1 g/100 mL (m/v). Toutes les extractions ont été suivies d’une centrifugation (9 500 tr/min, 20 min) et d’une filtration (papiers-filtres Whatman® 4). Les extractions ont été réalisées en double. Les extraits ont été analysés immédiatement après la fin des extractions.
La TPC des extraits préparés a été déterminée selon une méthode spectrophotométrique (spectrophotomètre UV-VIS Genesys 10S, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) décrite par Singleton et Rossi, avec quelques modifications. Le mélange réactionnel contenait 7,9 mL d’eau distillée, 100 µL d’extrait dilué, 250 µL de réactif de Folin–Ciocalteu et 1,5 mL d’une solution de carbonate de sodium à 20 % (m/v). Le blanc contenait de l’eau à la place de l’extrait. L’absorbance du mélange réactionnel a été mesurée à 765 nm après 2 h, tandis que des solutions d’acide gallique (25–200 µg/mL) ont été utilisées pour établir une courbe d’étalonnage standard. Les résultats ont été exprimés en mg d’équivalents d’acide gallique/g de poids sec de l’échantillon (mg GAE/g dw). Les mesures ont été réalisées en triple.
La capacité antioxydante des extraits préparés a été déterminée à l’aide des tests de décoloration du radical DPPH et du cation radicalaire ABTS. Le mélange réactionnel du test DPPH contenait 3,9 mL d’une solution méthanolique de DPPH à 0,094 mM et 100 µL d’extrait dilué. Le blanc contenait du méthanol à la place de l’extrait. L’absorbance du mélange réactionnel a été mesurée à 515 nm après 30 min. Pour le test ABTS, une solution aqueuse d’ABTS à 7 mM et une solution aqueuse de peroxodisulfate de potassium à 140 mM ont été mélangées de manière à obtenir une concentration finale de peroxodisulfate de potassium de 2,45 mM, puis laissées à réagir pendant 16 h. Avant l’analyse, l’absorbance de la solution du radical ABTS a été ajustée à 0,700 à 734 nm par dilution dans l’éthanol. Le mélange réactionnel était constitué de 40 μL d’extrait dilué et de 4,0 mL de solution du radical ABTS. Le blanc contenait de l’éthanol à la place de l’extrait. Pour les deux tests, la courbe d’étalonnage standard a été établie à l’aide de solutions de Trolox (25–200 µg/mL), et les résultats ont été exprimés en mmol d’équivalents Trolox/g de poids sec de l’échantillon (mmol Trolox/g dw). Les mesures ont été réalisées en triple.
L’analyse HPLC a été réalisée sur un système chromatographique Agilent série 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis) doté d’une colonne chromatographique Zorbax Extend C18 (4,6 mm × 250 mm, diamètre interne de 5 μm) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis) couplée à un détecteur à réseau de photodiodes (PAD) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis). La phase mobile comprenait deux composants : (A) une solution d’acide formique à 1 % (v/v) dans l’eau et (B) une solution d’acide formique à 1 % (v/v) dans l’acétonitrile. L’élution a été réalisée en augmentant le taux du composant B au cours du temps comme suit : 0 min — 7 % B ; 5 min — 7 % B ; 45 min — 40 % B ; 47 min — 70 % ; 52 min — 70 % B, à un débit de 1 mL/min. Le volume d’injection était de 5 μL et la température de la colonne de 25 °C. Les chromatogrammes ont été enregistrés à 320 et 350 nm. L’analyse de tous les échantillons a été réalisée en double. Avant l’analyse, tous les échantillons ont été filtrés à travers un filtre à membrane de 0,45 µm (Nylon Membranes, Supelco, Bellefonte, PA, États-Unis).
Les chromatogrammes obtenus à partir des extraits ont révélé plusieurs pics qui n’ont pas pu être identifiés en raison de l’absence d’étalons HPLC appropriés. Afin de les identifier, des extraits représentatifs de lierre terrestre (échantillon G5-MAE et SWE) ont été soumis à un fractionnement à l’aide d’un collecteur de fractions à échelle analytique Agilent 1260 Infinity II (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis), couplé au système chromatographique Agilent série 1200 susmentionné. Les fractions recueillies en fonction des pics (documents supplémentaires, fractions F1, F2, F3 et F4 sur la figure S3a,b) ont été analysées par LC-MS/MS, comme décrit dans la section suivante.
Les analyses LC-MS/MS de la fraction F1 ont donné l’ion [M − 1]⁻ en mode de balayage négatif à m/z 353, conformément à la formule moléculaire C₁₆H₁₈O₉. Son ion moléculaire [M−]⁻ a produit trois pics à m/z 191, 179 et 173 (documents supplémentaires, figure S4), suggérant, d’après la littérature, la présence d’isomères de l’acide caféoylquinique. Une analyse HPLC-PAD ultérieure avec un étalon HPLC approprié a révélé qu’il s’agissait d’acide cryptochlorogénique. Ensuite, dans le cas de la fraction F2, les analyses LC-MS/MS ont donné l’ion [M − 1]⁻ en mode de balayage négatif à m/z 593, conformément à la formule moléculaire C₂₇H₃₀O₁₅, et son ion moléculaire [M − 1]⁻ a produit un pic à m/z 285 (documents supplémentaires, figure S5), ce qui suggérait, d’après la littérature, qu’il s’agissait de lutéoline-7-O-rutinoside. En l’absence d’un étalon HPLC approprié, l’identification a été confirmée en soumettant la fraction F2 à une hydrolyse acide, qui devait entraîner la libération de la lutéoline de sa forme glycosidique conjuguée. À cette fin, la fraction recueillie a été évaporée à sec sous azote et le résidu sec a été soumis à une hydrolyse acide avec une solution de HCl à 2 M (1 h, 80 °C). L’hydrolysat refroidi a été dilué avec une solution de NaCl (5 M) et de l’eau afin d’obtenir une concentration de NaCl de 2 M dans un volume défini. L’extraction de la lutéoline libérée a été réalisée par extraction liquide-liquide à l’acétate d’éthyle. L’acétate d’éthyle a été complètement évaporé sous azote, tandis que le résidu sec a été remis en suspension dans un volume défini d’éthanol et soumis à une analyse HPLC-PAD. L’hydrolyse acide a entraîné la libération de lutéoline sous forme d’aglycone, confirmant ainsi la présence de lutéoline glycosylée dans l’extrait de lierre terrestre. Les analyses LC-MS/MS de la fraction F3 ont donné l’ion [M + 1]⁺ en mode de balayage positif à m/z 519 (formule moléculaire C₂₄H₂₂O₁₃), et son ion moléculaire [M − 1]⁺ a produit deux pics à m/z 271 et 433 (documents supplémentaires, figure S6), suggérant, d’après la littérature, qu’il s’agissait d’apigénine 7-(6″-malonylglucoside). L’identification a été confirmée en appliquant une hydrolyse acide selon la même procédure que pour la fraction F2. Contrairement aux fractions F1, F2 et F3, la fraction F4 est demeurée non identifiée ; une explication concernant cette fraction, détectée dans l’extrait SWE, est donnée dans la partie discussion (section 3.2).
Tous les composés phénoliques ont été identifiés en comparant leurs temps de rétention et leurs spectres d’absorption caractéristiques (190–400 nm) à ceux d’étalons disponibles dans le commerce. La quantification a été rendue possible par l’établissement de courbes d’étalonnage (2–100 μg/mL). Pour les pics correspondant aux fractions F2 et F3, la quantification a été réalisée à l’aide d’étalons commerciaux de lutéoline et d’apigénine, respectivement.
Le système LC/MS TripleQuad 6460 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis), couplé à une source d’ionisation par électrospray, a été utilisé pour identifier les pics. La séparation par chromatographie liquide a été réalisée sur une colonne Zorbax Eclipse C18 (2,1 mm × 50 mm, diamètre interne de 1,8 μm) à 30 °C. L’élution isocratique a été réalisée avec une phase mobile constituée d’acide formique à 0,1 % (v/v) dans une solution aqueuse d’acétonitrile à 50 % (v/v). Le débit était de 0,4 mL/min et le volume d’injection de 1 μL. Le temps de rétention total était de 5 min. Le spectromètre de masse a été utilisé en modes de balayage MS positif et négatif. Les paramètres de la source d’ions ont été réglés comme suit : température du gaz de 250 °C, débit du gaz de 7 L/min, nébuliseur à 40 psi, température du gaz de gaine de 325 °C, débit du gaz de gaine de 11 L/min, tension capillaire de 3 500 V et tension initiale du fragmenteur de 200 V. Les ions dominants des fractions recueillies ont été sélectionnés pour la fragmentation. La tension du fragmenteur a été optimisée pour les précurseurs ciblés en mode de suivi d’ions sélectionnés (MS 2 SIM). Enfin, pour la fragmentation, le spectromètre de masse a été utilisé en mode ion produit ; l’énergie de collision a été réglée entre 5 et 40 eV. Les spectres MS/MS ont été enregistrés en mode de balayage négatif ou positif, selon la fraction.
Les spectres NIR ont été recueillis dans la plage de 904 à 1 699 nm à l’aide du spectrophotomètre NIR-128-1.7-USB/6.25/50 μm (Control Development, Inc., South Bend, IN, États-Unis), doté d’une source lumineuse halogène (HL-2000) et du logiciel CD Spec32 installé (Control Development, Inc.). Chaque spectre d’absorbance a été enregistré en triple.
Une analyse en composantes principales (PCA) a été employée pour comparer les extraits de lierre terrestre préparés selon différentes méthodes d’extraction à partir des spectres NIR bruts dans les plages de longueurs d’onde 904–928 nm et 1 399–1 699 nm, à l’aide du logiciel Statistica v.10.0 (StatSoft, Tulsa, OK, États-Unis). Des réseaux neuronaux de type perceptron multicouche (MLP) ont été développés dans le logiciel Statistica v.10.0 (StatSoft, Tulsa, États-Unis) pour : (i) la prédiction simultanée de la teneur totale en composés phénoliques (TPC) et de la capacité antioxydante (ABTS et DPPH), et (ii) la prédiction simultanée de la teneur en composés phénoliques individuels sélectionnés (acide chlorogénique, acide cryptochlorogénique, acide caféique, acide rosmarinique et rutine) à partir des spectres NIR d’extraits de lierre terrestre préparés selon différentes techniques d’extraction. Les modèles ANN comportaient une couche d’entrée, une couche cachée et une couche de sortie. Les entrées de la modélisation ANN étaient les coordonnées des cinq premières composantes principales, qui contribuaient à plus de 99 % de la variabilité. La modélisation ANN a été effectuée sur des matrices de données de dimensions : (i) 63 × 8 pour la prédiction simultanée de la teneur totale en composés phénoliques et de la capacité antioxydante, et (ii) 63 × 10 pour la prédiction simultanée de la teneur en composés phénoliques individuels sélectionnés (les 63 lignes représentent les extraits et les 8 ou 10 colonnes correspondent à 5 coordonnées de PCA [facteurs] et à 3 ou 5 colonnes représentant les résultats analysés). Pour la modélisation ANN, les données ont été réparties aléatoirement selon un rapport 70:15:15 entre apprentissage, test et validation. L’apprentissage du modèle a été réalisé à l’aide d’un algorithme de rétropropagation de l’erreur intégré aux réseaux neuronaux automatisés de Statistica v.10.0 (StatSoft, Tulsa, OK, États-Unis). Les performances du modèle ANN proposé ont été estimées à partir des valeurs de R² et de l’erreur quadratique moyenne (RMSE) pour l’apprentissage, le test et la validation, ainsi que du nombre de neurones de la couche cachée.
Une ANOVA à un facteur et le test post hoc de Tukey ont été réalisés dans le logiciel SPSS Statistics 17.0. Les différences ont été considérées comme significatives à p < 0,05.
La caractérisation de la macro- et de la microcomposition des échantillons de lierre terrestre récoltés dans différents habitats naturels est présentée dans les tableaux 1 et 2.
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Les fibres alimentaires insolubles, dont la teneur allait de 32,26 % dw (échantillon G1) à 48,03 % dw (échantillon G4), constituaient le composant le plus représenté de la matière sèche dans tous les échantillons récoltés. La teneur élevée en fibres alimentaires insolubles peut être attribuée à une teneur élevée en cellulose, un polysaccharide structural qui représente environ 50 % de tout le carbone présent dans les plantes. Les fibres alimentaires solubles étaient beaucoup moins représentées : de 4,97 % dw dans l’échantillon G5 à 9,14 % dw dans l’échantillon G7. De plus, tous les échantillons récoltés se sont révélés riches en protéines, particulièrement l’échantillon G5, dont la teneur en protéines (23,12 % dw) se situait presque dans la plage de celle des légumineuses à graines (24,0–26,1 %), considérées comme des sources riches en protéines. Les valeurs de la teneur en matières minérales des échantillons évalués se situaient dans une plage étroite allant de 9,20 % dw dans l’échantillon G6 à 10,98 % dw dans l’échantillon G3. L’huile était le macrocomposant le moins représenté dans tous les échantillons et sa teneur ne dépassait pas 2,80 % dw (échantillon G1). À titre de comparaison, une macrocomposition similaire, comprenant des teneurs en protéines (20,38 %), en matières minérales (15,78 %) et en huile (3,96 %), a été rapportée pour des feuilles de lierre terrestre récoltées en Corée du Sud.
Le profil des acides gras saturés, mono-insaturés et polyinsaturés différait selon l’habitat naturel de la plante. Toutefois, tous les échantillons avaient en commun une prédominance des acides gras insaturés sur les acides gras saturés, avec une abondance des acides oléique (33,85 et 39,01 % fa dans les échantillons G2 et G4), linoléique (19,48 et 32,35 % fa dans les échantillons G3 et G6) et α-linolénique (29,45, 37,92 et 27,15 % fa dans les échantillons G1, G5 et G7, respectivement), tandis que, parmi les acides gras saturés, l’acide palmitique (allant de 7,14 % fa dans l’échantillon G4 à 13,33 % fa dans l’échantillon G3) était dominant, sauf dans l’échantillon G7. L’échantillon G7 présentait la plus grande diversité d’acides gras dans sa composition et il convient de souligner qu’il était le seul échantillon dans lequel l’acide béhénique (6,52 % fa) a été identifié et que, avec les échantillons G1 et G4, il était le seul à contenir de l’acide lignocérique (13,73 % fa), à une teneur significativement (p < 0,05) plus élevée que dans les deux autres échantillons mentionnés (2,46 et 3,22 % fa, respectivement). Les acides palmitique, linoléique et α-linolénique avaient déjà été signalés comme les principaux acides gras des feuilles de différentes plantes de la famille des Lamiaceae. Selon Barros et al., le principal acide gras du lierre terrestre provenant du nord-est du Portugal était l’acide oléique (35,12 %), suivi de l’acide α-linolénique (27,87 %), de l’acide palmitique (12,23 %) et de l’acide linoléique (8,15 %), ce qui concorde bien avec les résultats de la présente étude.
La teneur en macro- et microéléments est présentée dans le tableau 2. La teneur en éléments des plantes peut varier en fonction des caractéristiques géochimiques du sol et de la capacité de la plante à accumuler des éléments particuliers. Selon les présents résultats, s’il est utilisé comme produit médicinal à base de plantes ou comme complément, le lierre terrestre peut servir de source naturelle de potassium (K) et de calcium (Ca), puisque tous les échantillons en présentaient une teneur abondante (14,49 mg/g dw [G1]–29,80 mg/g dw [G4] et 7,78 mg/g dw [G2]–14,89 mg/g dw [G3], respectivement). L’apport en potassium contribue à réduire la pression artérielle et diminue ainsi le risque d’accident vasculaire cérébral et de maladie coronarienne ; il exerce également un effet protecteur contre la perte osseuse liée à l’âge et réduit les calculs rénaux, tandis que le calcium a été qualifié de « super-nutriment » en raison de son rôle dans la réduction du risque d’ostéoporose, d’hypertension et, éventuellement, de cancer du côlon, ainsi que d’autres troubles. De plus, s’il est utilisé sous forme d’infusion, le lierre terrestre peut encore constituer une source riche en K puisqu’il appartient au groupe des éléments hautement extractibles. En outre, pour la plupart des échantillons (G3, G4, G5, G6 et G7), la teneur en macroéléments diminuait dans l’ordre suivant : K > Ca > Mg > P > Al > Fe > Na. Un ordre similaire a été observé dans les échantillons G1 et G2, avec un ordre différent pour Mg, Al et P (G1 : K > Ca > Mg > Al > P > Fe > Na ; G2 : K > Ca > P > Mg > Al > Fe > Na). Parmi les microéléments étudiés, le vanadium (V) et le chrome (Cr) se distinguent par leur teneur, notamment dans les échantillons G1 (3 380 et 3 294 µg/kg dw, respectivement) et G2 (3 793 et 2 873 µg/kg dw, respectivement). Une petite quantité de vanadium, correspondant à un apport quotidien courant de 0,01–0,02 mg par les nutriments et l’eau potable, sous forme de composés d’oxydovanadium (IV) ou (V), ou de manière plus prédominante sous forme de vanadate H₂VO₄⁻, est bénéfique pour la santé, tandis qu’un apport excessif peut être toxique. Les composés du vanadium se sont révélés utiles dans le traitement du diabète, dans les traitements antitumoraux et anticancéreux ainsi que dans la lutte contre les maladies infectieuses. Les plantes médicinales sont connues pour concentrer le Cr et peuvent ainsi, comme le lierre terrestre, servir de compléments alimentaires afin de prévenir une carence en Cr, laquelle peut autrement provoquer divers troubles cardiovasculaires, l’athérosclérose, des maladies endocriniennes, une neuropathie périphérique, etc. Il n’existe aucune norme concernant les teneurs admissibles en métaux dans les matières premières végétales médicinales, et l’Organisation mondiale de la Santé ne mentionne que des teneurs maximales admissibles pour l’arsenic (1,0 mg/kg), le cadmium (0,3 mg/kg) et le plomb (10 mg/kg). Dans la présente étude, les teneurs en ces éléments dans tous les échantillons de lierre terrestre récoltés étaient inférieures aux niveaux admissibles. Quant aux autres microéléments (Cu, Ni, Hg, Mn, Zn, Mo, Co et Sb), leurs teneurs se situaient dans les limites de sécurité et en dessous des valeurs de référence pour les effets toxiques.
La caractérisation du profil phénolique du lierre terrestre comprenait la détermination de la TPC, de la capacité antioxydante par les tests DPPH et ABTS et de la teneur en composés phénoliques individuels de ses extraits. Les résultats sont présentés dans le tableau 3.
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La TPC et la capacité antioxydante les plus élevées de tous les échantillons de lierre terrestre ont été déterminées dans les extraits préparés par SWE, les échantillons G3 et G4 correspondant respectivement au minimum et au maximum des plages de valeurs (60,1–101,7 mg GAE/g dw, 0,280–0,584 mmol Trolox/g dw et 0,349–0,650 mmol Trolox/g dw, respectivement). L’échantillon G3 présentait la TPC la plus faible dans le cas de la HAE (40,6 mg GAE/g dw) et de la MAE (42,9 mg GAE/g dw), tandis que l’échantillon G4 était à nouveau le plus riche en TPC avec les deux techniques d’extraction (87,9 et 95,1 mg GAE/g dw, respectivement). La même observation a été faite pour la capacité antioxydante. Par conséquent, en ce qui concerne la TPC et la capacité antioxydante des extraits obtenus, l’efficacité des techniques d’extraction utilisées peut être classée, pour tous les échantillons, dans l’ordre suivant : SWE > MAE > HAE. Toutefois, la comparaison des chromatogrammes des extraits préparés par MAE (documents supplémentaires, figure S3a), HAE et SWE (documents supplémentaires, figure S3b) a révélé des modifications importantes du profil phénolique. Dans les extraits obtenus par HAE et MAE, les composés phénoliques prédominants étaient les acides phénoliques — acides chlorogénique, cryptochlorogénique, caféique et rosmarinique — ainsi que la rutine, appartenant au groupe des flavonoïdes, tandis que leur teneur dans les extraits SWE était significativement (p < 0,05) plus faible (tableau 3). Un pic dominant (documents supplémentaires, figure S3b, pic indiqué « F4 »), détecté uniquement dans les extraits SWE, a été soumis à une analyse LC-MS/MS (procédure décrite dans les sections 2.2.5 et 2.2.6) et a donné l’ion [M − 1]⁻ à m/z 239 comme pic de base, lequel a produit deux pics à m/z 147 et 193 en MS/MS (documents supplémentaires, figure S7) ; ces données n’ont cependant pas permis une identification concluante, car les informations nécessaires font défaut dans la littérature disponible. Bien que la formule moléculaire et la structure du pic dominant des extraits SWE soient demeurées assez peu claires et inconnues, il est évident que la SWE a entraîné la formation d’un nouvel antioxydant. Ce processus, appelé néoformation, signifie que l’extrait peut contenir des composés qui n’étaient pas présents dans la matrice naturelle avant l’extraction. En raison de la température élevée (200 °C) appliquée pendant la SWE, le nouvel antioxydant pourrait s’être formé en tant que produit de dégradation ayant conservé sa structure phénolique et, par conséquent, sa capacité antioxydante. La seconde possibilité est que le pic « inconnu » provienne des réactions de Maillard et de la caramélisation — processus survenus pendant la SWE — et qu’il possède également une capacité antioxydante élevée.
La MAE a permis la récupération la plus élevée des composés phénoliques cibles — rutine et acides chlorogénique, cryptochlorogénique, caféique et rosmarinique — présents dans tous les échantillons (tableau 3). Si l’on examine une seule technique d’extraction, par exemple la MAE, pour l’ensemble des échantillons, il apparaît clairement que le profil phénolique du lierre terrestre différait selon l’habitat naturel : dans les échantillons G1, G2 et G6, le composé phénolique prédominant était l’acide chlorogénique (6,10, 7,15 et 4,98 mg/g dw, respectivement) ; dans les échantillons G2 et G7, il s’agissait de la rutine (8,83 et 3,87 mg/g dw, respectivement), tandis que dans les échantillons G3, G4 et G5, il s’agissait de l’acide rosmarinique (5,56, 18,69 et 4,14 dw, respectivement). Des résultats similaires, notamment la prédominance de l’acide rosmarinique et la présence des acides caféique et chlorogénique dans le lierre terrestre, ont été rapportés par Chou et al. et Belščak-Cvitanović et al. En outre, l’analyse LC-MS/MS a révélé la présence des flavonoïdes apigénine et lutéoline sous des formes glycosylées (section 2.2.5) : apigénine 7-(6″-malonylglucoside) et lutéoline-7-O-rutinoside, dont les teneurs les plus élevées ont été observées respectivement dans les échantillons G2 (0,90 mg/g dw) et G5 (0,68 mg/g dw). Il convient de souligner l’inadéquation de la SWE pour l’extraction de l’apigénine 7-(6″-malonylglucoside), puisqu’elle n’a été identifiée dans aucun des extraits SWE. Dans le groupe des flavonoïdes, Chou et al. ont rapporté la présence de daidzéine, de génistine et de génistéine dans le lierre terrestre, tandis que Kikuchi et al. ont rapporté plusieurs glycosides phénoliques, tels que l’apigénine 7-O-néohespéridoside, le chrysœriol 7-O-néohespéridoside et le (+)-pinorésinol 4,4′-bis-O-β-d-glucopyranoside dans le lierre terrestre.
Le NIR appartient à la partie du spectre électromagnétique située entre la lumière visible et l’infrarouge moyen (780–2 500 nm), et le principe fondamental de la spectroscopie NIR consiste à irradier l’échantillon avec une lumière NIR et à enregistrer le rayonnement réfléchi ou transmis. Le NIR enregistre les informations relatives aux harmoniques et aux bandes de combinaison de la vibration fondamentale d’une liaison chimique unique dans une molécule. Dans la présente étude, le NIR appliqué couvrait la plage de 904 à 1 699 nm, dans laquelle l’échantillon absorbe la lumière dont les fréquences correspondent aux vibrations caractéristiques générées par les liaisons C-H, O-H, N-H et C=O, et cette plage a suffi à différencier les données des extraits. Comme le montre la figure 1, les spectres NIR des extraits de lierre terrestre récolté dans différents habitats naturels présentaient une grande similitude, mais des différences d’intensité de certaines bandes caractéristiques ont été observées, probablement sous l’influence des variations du profil phénolique selon l’habitat naturel et/ou la technique d’extraction. Des différences significatives entre les spectres NIR des extraits ont été observées de 904 à 928 nm et de 1 399 à 1 699 nm, et ces données ont ensuite été utilisées pour la PCA. Les décalages dans cette plage de longueurs d’onde indiquaient des modifications de la troisième et de la deuxième harmonique des liaisons C-H et O-H, également liées au groupe hydroxyle directement lié à un hydrocarbure aromatique.
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Afin de rechercher les similitudes ou les différences associées aux habitats naturels du lierre terrestre et aux techniques d’extraction appliquées, une PCA a été réalisée sur tous les extraits à l’aide du spectre NIR. La PCA a extrait les informations importantes du spectre NIR obtenu pour les extraits et les a exprimées sous la forme d’un ensemble de nouvelles variables orthogonales — les composantes principales. Un diagramme de dispersion de la première composante principale en fonction de la deuxième composante principale est présenté dans la figure 2, avec les contributions correspondantes.
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Les deux premières composantes principales expliquaient 99,41 % de la variance totale du jeu de données observé. Les résultats ont montré un regroupement des échantillons en deux groupes distincts selon la technique d’extraction appliquée (HAE, MAE et SWE). Un groupe était formé par les extraits préparés par HAE et MAE, et le second par les extraits préparés par SWE. Les résultats concordent avec l’analyse HPLC des composés phénoliques individuels puisque, dans tous les extraits préparés par HAE et MAE, les mêmes composés phénoliques ont été identifiés et quantifiés comme dominants, tandis que la SWE a produit des extraits au profil phénolique plus diversifié, comme déjà expliqué dans la section précédente. Des résultats similaires ont été rapportés par Valinger et al., qui ont obtenu un regroupement efficace d’extraits de chanvre industriel à partir de spectres combinés UV–vis–NIR en fonction de la concentration du solvant d’extraction.
En outre, l’applicabilité d’un modèle ANN à la prédiction simultanée de la teneur totale en composés phénoliques, de la capacité antioxydante et des composés phénoliques individuels sélectionnés des extraits préparés à partir des spectres NIR a été analysée. Les entrées du modèle ANN ont été choisies parmi les coordonnées des cinq premières composantes obtenues par l’analyse PCA, qui contribuaient à plus de 99 % de la variance totale. Le tableau 4 présente les propriétés de plusieurs réseaux de neurones artificiels développés pour les deux groupes de sorties du modèle analysés.
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Comme les coefficients de détermination aux trois étapes étaient supérieurs à 0,78 et que les erreurs quadratiques moyennes de validation des modèles sélectionnés étaient faibles (RMSE < 0,07), les résultats ont montré que les cinq ANN sélectionnés présentaient une bonne concordance entre les valeurs expérimentales et les valeurs prédites par le modèle aux étapes d’apprentissage, de test et de validation. Le réseau perceptron multicouche MLP 5-8-3 a été retenu comme réseau optimal pour les simulations de prédiction de la TPC, du DPPH et de l’ABTS (R²_apprentissage_ = 0,8862, RMSE_apprentissage_ = 0,0252, R²_test_ = 0,8895, RMSE_test_ = 0,0216, R²_validation_ = 0,8883, RMSE_validation_ = 0,0332). Le réseau sélectionné comportait cinq neurones dans la couche d’entrée, huit neurones dans la couche cachée et trois neurones dans la couche de sortie. En outre, la fonction d’activation cachée était exponentielle et la fonction d’activation de sortie était la tangente hyperbolique. Comme le montrent le tableau 5 et la figure 3a–c, le MPL 5-8-3 sélectionné décrivait avec exactitude les propriétés bioactives analysées des extraits préparés.
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Les résultats (tableau 4) montrent que la meilleure concordance entre les données expérimentales et celles du modèle ANN a été obtenue pour les valeurs de TPC (R²_apprentissage_ = 0,9207, R²_test_ = 0,9079, R²_validation_ = 0,8928). De plus, le MLP 5-8-5 (R²_apprentissage_ = 0,9433, RMSE_apprentissage_ = 0,0189, R²_test_ = 0,8895, RMSE_test_ = 0,0379, R²_validation_ = 0,8884, RMSE_validation_ = 0,05155), avec une fonction logistique comme fonction d’activation cachée, a été choisi avec une fonction d’activation de sortie pour prédire la teneur en composés phénoliques individuels sélectionnés (tableau 5). D’après les résultats (tableau 5, figure 3d–h), le meilleur modèle ANN développé prédisait avec la plus grande précision la teneur en rutine (R²_validation_ = 0,9049), suivie de la teneur en acide caféique (R²_validation_ = 0,8999) et de la teneur en acide chlorogénique (R²_validation_ = 0,8826). Le résultat présenté a montré que la spectroscopie NIR associée à une modélisation ANN peut être utilisée efficacement pour décrire l’extraction des composés phénoliques de matières végétales, comme cela a déjà été décrit dans la littérature. Une analyse rapide et à haut débit, la possibilité de travailler sur site, la spécificité chimique et la préparation minimale des échantillons constituent autant d’avantages du NIR qui présentent un potentiel important pour l’analyse des extraits végétaux.
La composition nutritionnelle et bioactive du lierre terrestre différait selon l’habitat naturel, mais tous les échantillons se sont révélés être de précieuses sources de fibres alimentaires insolubles, de protéines, de calcium et de potassium. Outre l’habitat naturel, la teneur en composés bioactifs des extraits de lierre terrestre était fortement influencée par la technique d’extraction appliquée. L’extraction à l’eau subcritique a entraîné la formation de nouveaux antioxydants et nécessite des recherches supplémentaires, mais, dans la présente étude, l’extraction assistée par micro-ondes a permis la récupération la plus élevée des composés phénoliques cibles. Les résultats obtenus ont montré que le lierre terrestre est une plante dotée d’une composition nutritionnelle et bioactive diversifiée et précieuse, constituant ainsi une source importante de composés naturels susceptibles d’être utilisés dans la formulation d’aliments fonctionnels.