Référence : ACS Omega 2022. — PMC9088799 · DOI 10.1021/acsomega.1c06335 Type : article de recherche, phytochimie · Plante : Millepertuis perforé · Propriété → Antioxydant Accès : ⭐ libre (CC-BY-NC-ND) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Hypericum perforatum Linn (millepertuis, « St. John’s wort ») est un médicament populaire et répandu en Syrie, utilisé pour un large éventail d’affections, notamment les maladies gastro-intestinales, les maladies cardiaques, les maladies de la peau et les troubles psychologiques. Cette utilisation répandue nous a incités à identifier les principaux composés de cette plante originaire de Syrie qui sont responsables de ses propriétés médicinales, d’autant plus que ses composants diffèrent d’un pays à l’autre selon la nature du sol, le climat et l’altitude. À notre connaissance, il s’agit du premier rapport dans lequel le millepertuis, une plante native de Syrie, est extrait à l’aide de différents solvants et dont les composés les plus importants sont identifiés. Dans cette étude, les parties aériennes séchées, c’est-à-dire les feuilles, la tige, les pétales et les fleurs, ont été extraites à l’aide de différents solvants (eau, éthanol, méthanol et acétone) et de différents protocoles d’extraction. En augmentant la polarité du solvant, des rendements plus élevés ont été obtenus, ce qui indique que ce sont principalement des composés hydrophobes qui ont été extraits. Par conséquent, nous concluons que l’extraction par la méthode de la tisane ou à l’aide d’un mélange d’eau et de solvant organique a produit des rendements plus élevés qu’avec des solvants organiques purs ou une ébullition continue dans l’eau pendant de longues périodes. Les extraits obtenus ont été analysés par chromatographie liquide haute performance équipée d’un détecteur à barrette de diodes (HPLC–DAD), couplée à une spectrophotométrie UV–visible sur spectre complet (200–800 nm). Les spectres HPLC des extraits étaient presque identiques à trois longueurs d’onde (260 nm pour les phloroglucinols (hyperforine et dérivés), 590 nm pour les naphthodianthrones (hypéricines) et 350 nm pour les autres flavonols, flavones et acides caféoylquiniques), avec des différences observées uniquement dans l’intensité des pics. Cela indique que les mêmes composés ont été obtenus avec les différents solvants, mais en quantités différentes. Cinq étalons (acide chlorogénique, quercétine, quercitrine hydrate, hyperoside et hypéricine) ont été utilisés, et une comparaison avec les temps de rétention et les spectres ultraviolets (UV) rapportés dans la littérature a été effectuée pour identifier 10 composés dans ces extraits : hyperforine, adhyperforine, hypéricine, rutine, quercétine, quercitrine, quercitrine hydrate, hyperoside, biapigénine et acide chlorogénique. Bien que la Pharmacopée européenne décrive encore la spectroscopie ultraviolette comme méthode de détermination de la quantité de Hyperici herba, des interférences provenant d’autres métabolites peuvent se produire. La combinaison de HPLC–DAD et de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation (LC-ESI-MS) en mode positif a donc également été utilisée pour confirmer la présence de ces composés dans les extraits, en corrélant les masses connues avec les masses identifiées ou par des schémas de fragmentation caractéristiques. Les teneurs phénoliques totales des extraits ont été déterminées par le dosage de Folin–Ciocalteu, et l’activité antioxydante a été évaluée en tant que capacité de piégeage des radicaux libres à l’aide des dosages au 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH) et à l’acide 2,2′-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS). Les résultats indiquent que les extraits aqueux préparés par la méthode de la tisane ont donné les phénols totaux les plus élevés, tandis que les solvants organiques purs ont donné très peu de phénols. De même, les extraits qui contiennent la plus grande quantité de phénols ont donné des valeurs d’IC50 plus basses, c’est-à-dire une activité antioxydante plus élevée que les autres.
Hypericum perforatum Linn, généralement reconnu sous le nom de millepertuis (St. John’s wort), est une plante à fleurs native d’Asie et d’Europe. Elle appartient à la famille des Hypericaceae, qui contient plus de 1000 espèces et environ 55 genres. Le genre Hypericum comprend plus de 450 espèces réparties dans le monde entier dans les régions tropicales et subtropicales. Cette espèce peut croître dans diverses conditions environnementales et possède une capacité écologique très étendue. On la trouve dans les pâturages, les fourrés, les clairières forestières, divers types de chênaies, les prairies et les zones brûlées. La hauteur de la tige, qui est de couleur rouge et ramifiée dans sa partie supérieure, est d’environ 40–100 cm [figure]. Les tiges peuvent paraître articulées à partir des cicatrices foliaires, bien qu’elle soit ligneuse près de sa base. Les rameaux sont groupés par paires opposées et pivotés à des angles de 90° (croisés), à la base de chaque feuille. Les feuilles sont étroites-oblongues, non dentées, de couleur vert jaunâtre, avec un pétiole peu marqué, longues de 2–4 cm sur la tige principale, de 1–2 cm sur les rameaux, et couvertes de glandes translucides dispersées en forme de points [figure]. Les points sont translucides lorsqu’on les regarde à contre-jour ; cela donne aux feuilles un aspect perforé, comme l’indique le nom latin de la plante. Les fleurs, nombreuses, sont très ramifiées et compactes à arrondies, de couleur jaune vif avec des points noirs, d’une longueur allant jusqu’à 2,5 cm. Chaque fleur possède cinq pétales et sépales, longs de 4–6 mm, en forme de tige étroite à pointe aiguë, et présentant parfois quelques glandes noires. Un total de 50–80 étamines sont groupées en trois ou cinq faisceaux ; ces structures sont séparées, et les stigmates sont réunis en groupes denses en forme de tête [figure]. Le fruit est une capsule à trois loges qui contient de nombreuses graines brutes, rugueuses et réticulées avec des sillons grossiers, d’une longueur de 1 à 1,3 mm [figure].
Différents extraits (extraits alcooliques ou aqueux) des parties aériennes de H. perforatum ont révélé que ses composés naturels bioactifs (phytochimiques) se répartissent en sept groupes : (1) naphthodianthrones — dérivés de l’anthraquinone (par ex. hypéricine, isohypéricine, protohypéricine, pseudohypéricine, protopseudohypéricine, etc.), (2) phloroglucinols (par ex. hyperforine, adhyperforine, hydroperoxycadiforine, etc.), (3) glycosides de flavonols : flavonoïdes — flavonols (par ex. quercétine, kaempférol, etc.), glycosides (par ex. rutine, hyperoside, quercitrine, isoquercitrine, etc.) et flavones (par ex. apigénine, lutéoline, etc.), (4) biflavones (par ex. flavone (I3,II8-biapigénine), amentoflavone (I3′,II8-biapigénine) et catéchines (les flavonoïdes sont souvent associés à des tanins condensés)), (5) phénylpropanes (par ex. acides p-coumarique, chlorogénique, caféique, vanillique, p-hydroxybenzoïque et férulique), (6) proanthocyanidines et tanins (par ex. procyanidine dimérique B2, procyanidines dimériques, trimériques et tétramériques) et (7) xanthones (par ex. 1,3,6,7-tétrahydroxyxanthone et kielcorine C). De plus, des quantités mineures d’autres composants courants comprennent des acides (palmitique, isovalérianique, myristique, stéarique, nicotinique, citrique et malique), la pectine, la choline, des caroténoïdes, le B-sitostérol, des dérivés d’acides aminés (tryptophane, acide γ-aminobutyrique et mélatonine), le nicotinamide, la vitamine C, des sucres (glucose, fructose, saccharose et lactose), des acides gras, la bisanthraquinone, des glycosides et l’hydroperoxycadiforine. Les extraits hydroalcooliques contiennent également des huiles essentielles. Roth (1990) a publié une liste de 29 ingrédients qui représentent environ 65 % des distillats à la vapeur : l’α-pinène et le 2-méthyloctane étaient les ingrédients majeurs. Les huiles essentielles de millepertuis contiennent également des terpènes typiques tels que les monoterpènes α-pinène et p-pinène, le limonène, le B-caryophyllène, le myrcène, le géraniol, le germacrène D, le B-farnésène, l’humulène, et de plus grandes quantités d’alcanols à longue chaîne, d’hydrocarbures et d’alcanols tels que l’undécane, le n-undécane, le n-nonane, le n-tétradécanol, le 2-méthyloctane et le -décane, le 2-méthyl-dodécane, les alcanes en C16 et C29 et les alcanols en C24, C26 et C28, et le 2-méthylbuténol. Bien que les différences chimiques spécifiques entre les plantes cultivées dans différentes régions du monde semblent être héréditaires, la composition des extraits est, selon plusieurs études, également largement influencée par des facteurs environnementaux. L’emplacement de la plante, y compris l’altitude au-dessus du niveau de la mer, le moment de la récolte (à quel mois de l’année ; avant la floraison, en pleine floraison ou aux stades de fructification), les parties récoltées (fleurs, feuilles, clochettes, racine ou tige), la polarité du solvant (méthanol, éthanol, acétone, eau, etc.) utilisé lors de l’extraction, le pH du milieu, la température, la pression et l’exposition à la lumière jouent tous un rôle important dans le type, la nature et la concentration des composés chimiques obtenus lors de l’extraction.
H. perforatum L. (millepertuis) est utilisé comme plante médicinale traditionnelle dans le monde entier et a été accepté dans la Pharmacopée européenne 6. Il est employé dans de nombreux pays du monde pour la production de produits pharmaceutiques d’origine végétale, en raison de sa grande diversité d’ingrédients, tels que les hypéricines et les hyperforines, qui possèdent des effets pharmaceutiques considérables. Les usages traditionnels ont inclus l’application topique ou orale pour le traitement du diabète, des contusions, des rhumatismes, des brûlures, du paludisme, des plaies cutanées, des troubles biliaires, des migraines, de l’eczéma, du rhume, de l’ulcère gastrique, de la ménorragie, de la diarrhée, de l’énurésie, des entorses, de la bronchite et des maladies urogénitales, de l’indigestion, des hémorroïdes, des morsures de serpent, des foulures, de l’hystérie, de la névralgie et des troubles psychiatriques, en particulier la dépression. Comme détaillé ci-dessus, les extraits de millepertuis contiennent divers polyphénols, considérés comme la principale source d’activité antioxydante et, par conséquent, comme un agent potentiel de prévention du cancer. Les consommateurs préfèrent les antioxydants naturels en raison de leur toxicité potentielle supposée plus faible que celle des antioxydants synthétiques. Les composés phytochimiques comme les huiles essentielles du millepertuis présentent des effets pharmacologiques, tels que des activités anti-inflammatoire, antivirale, antibactérienne, antidiabétique, antifongique, cholagogue et cholérétique, analgésique, anticholinestérasique, antioxydante, antidépressive, antiulcéreuse, anticonvulsivante et cytotoxique.
L’hypéricine, en tant qu’agent photosensibilisant majeur, a été utilisée in vitro et in vivo en thérapie photodynamique du cancer, notamment pour le carcinome épidermoïde, la leucémie humaine et le carcinome nasopharyngé, ou pour des infections virales telles que le virus Sindbis, les virus de l’herpès simplex de types II et I, la stomatite vésiculeuse, le virus de la grippe, le VIH-I et le cytomégalovirus murin. L’hyperforine supprime la prolifération des lymphocytes T alloréactifs, inhibe la prolifération des cellules mononucléées du sang périphérique, inhibe la croissance du carcinome mammaire MT-450 chez des rats Wistar immunocompétents, et active l’apoptose médiée par les mitochondries lorsqu’elle est ajoutée aux cellules MT-450. Les flavonoïdes ont montré une activité contre le cancer et le virus de la grippe.
La chromatographie liquide haute performance (HPLC), reliée à des détecteurs UV, est une technique de routine dans la plupart des laboratoires pour la séparation et la détection chimiques. La HPLC est également la technologie de séparation privilégiée pour l’isolement des composants non volatils, souvent polaires et instables, présents dans les produits naturels. Dans la littérature, de nombreuses méthodes HPLC ont été rapportées pour l’identification des principaux composants tels que les phloroglucinols, les naphthodianthrones, les flavonoïdes, les acides phénoliques, les biflavones, les aurones et les xanthones du millepertuis (voir Tableau S1 dans les informations complémentaires).
Dans cette étude, les parties aériennes (feuilles, tiges, pétales et fleurs) de millepertuis récoltées en Syrie ont été nettoyées, séchées et extraites à l’aide de huit procédures d’extraction différentes : eau (ébullition dans l’eau pendant presque 3 h (eau I) ou par la méthode de la tisane (eau II)), éthanol, méthanol et acétone (100 et 70 %). Une nouvelle méthode HPLC, simple, efficace, précise et reproductible, a été mise au point pour l’isolement et l’identification des principaux constituants chimiques. Les diagrammes HPLC des huit extraits contenaient les mêmes pics et ne variaient que par l’intensité de ces pics. L’analyse HPLC–DAD-ESI-MS a été réalisée en mode d’ionisation positive afin d’obtenir les données de masse exactes dans l’expérience de balayage MS complet et d’identifier les constituants. Les composés qui ont été identifiés dans ces extraits, soit par UV, par HPLC, soit par analyse HPLC-MS, étaient l’acide chlorogénique, l’hypéricine, l’hyperforine, l’hyperoside, la quercétine, la quercitrine hydrate, la rutine, la biapigénine, la quercitrine et l’adhyperforine. L’effet antioxydant et l’activité de piégeage des radicaux libres des extraits de millepertuis ont été déterminés de deux manières : premièrement sur la base de la capacité des composés à transformer le radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH) (de couleur violette) en sa forme réduite DPPH-H (de couleur jaune), et deuxièmement par leur capacité à agir comme piégeur de radicaux donneur d’électrons inhibant la formation des radicaux ABTS•+ de couleur verte. Les phénols totaux des extraits (eau I, eau II, EtOH 100 % et MeOH 100 %) ont été quantifiés, et il a été constaté que l’activité antioxydante augmentait avec l’augmentation des phénols totaux.
Les parties aériennes (feuilles, tige, pétales et fleurs) de H. perforatum L. (millepertuis) ont été collectées en juillet–août 2018 dans la plaine du Ghab en Syrie (Google Maps : 35.586856, 36.355724 et 180–200 m au-dessus du niveau de la mer) et récoltées pendant la saison de floraison. L’hypéricine et la quercétine ont été achetées chez Cayman Pharma (Neratovice, République tchèque) ; l’hyperoside a été acheté chez Roth (Karlsruhe, Allemagne) ; la quercitrine hydrate, l’acide chlorogénique, le 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle (DPPH), le persulfate de potassium et l’acide 2,2′-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Darmstadt, Allemagne) ; le papier filtre Whatman 90 mm a été acheté chez GE Healthcare Life Sciences (Fribourg, Allemagne) ; un filtre à seringue en nylon de 0,22 μm, un Sartolab Vakuumfilter 180C5, un polyéthersulfone de 0,22 μm, 500 mL, un filtre à seringue de 25 mm, un filtre RC de 0,45 μm avec préfiltre GF et un filtre PTFE de 0,45 μm ont été achetés chez Sartorius (Goettingen, Allemagne) ; et un préfiltre de 0,45 μm a été acheté chez Wicom (Heppenheim, Allemagne). L’éthanol, le méthanol et l’acétone étaient de qualité HPLC de chez Roth (Karlsruhe, Allemagne) ; l’acétonitrile a été obtenu chez VWR (Hanovre, Allemagne), et l’eau a été purifiée à l’aide d’un système QM de chez Sartorius (Goettingen, Allemagne).
Le système HPLC était constitué d’un chromatographe liquide VWR HITACHI équipé d’une pompe 5160, d’un passeur d’échantillons automatique 5260, d’un détecteur à barrette de diodes 5430, d’un organiseur (support d’éluant) et d’un contrôleur de température pour la colonne et l’échantillonneur (four à colonne 5310) (VWR, HITACHI, MA, Japon). L’absorption a été mesurée dans la plage de 200–800 nm, le détecteur UV–visible fonctionnant à 260 nm pour les hyperforines et à 350 et 590 nm pour les hypéricines. Les données chromatographiques ont été enregistrées et traitées avec le logiciel Agilent Open LAB Control Panel. Pour l’analyse UPLC-ESI-QTOF-MS, un chromatographe liquide haute performance Waters Acquity (UPLC, Waters) couplé à un spectromètre de masse à temps de vol Q-TOF micro (Waters) et équipé d’une ionisation par électronébulisation (ESI) a été utilisé. Les spectres de masse ont été enregistrés en mode ions positifs à une tension capillaire de 3 kV et une température de désolvatation de 230 °C.
Les parties aériennes (feuilles, tige, pétales et fleurs) de millepertuis ont été lavées à l’eau froide pour les débarrasser de la boue et de la terre, séchées, coupées en petits morceaux, puis broyées à l’aide d’un broyeur à billes jusqu’à obtention d’une fine poudre. Un total de 0,360 g de cette poudre a été placé dans un bécher de 1000 mL ; puis 800 mL d’eau distillée y ont été ajoutés. Le bécher a été placé sur une plaque chauffante à température d’ébullition et agité. La concentration a été effectuée pendant environ 4 h jusqu’à ce que le volume de la solution soit réduit à environ 200 mL (eau I). La même quantité de poudre a été placée dans un bécher de 400 mL, et 150 mL d’eau bouillante y ont été ajoutés ; le bécher a été placé sur la plaque chauffante, agité et laissé à température ambiante pendant environ 20 min (eau II). Ensuite, les extraits aqueux ont été filtrés à travers un papier filtre (Whatman, n° 589/2). Le filtrat obtenu a été centrifugé à 24630 g pendant 30 min pour éliminer les particules résiduelles. Le surnageant a été filtré à travers un filtre à seringue en nylon de 0,22 μm. Le filtrat traversant a été recueilli [figure], et le solvant a été évaporé sous azote gazeux à 30 °C pour éviter l’oxydation.
Pour l’extraction à l’éthanol, au méthanol et à l’acétone, le procédé a été modifié comme suit : 2 g de poudre ont été placés dans un bécher et 150 mL de solvant (100 et 70 % pour chaque solvant) y ont été ajoutés. La solution est devenue rouge foncé pour EtOH 70 % et acétone 70 %, rouge clair pour EtOH 100 %, rouge noir pour MeOH 70 %, et rouge pour MeOH 100 % et acétone 100 %. Le bécher a été recouvert de parafilm et agité pendant 5 h à température ambiante (TA). Le surnageant a été décanté et stocké à −80 °C. Un total de 200 mL de solvant a été ajouté au sédiment ; le bécher a été recouvert de parafilm puis agité à TA pendant 17 h. Le surnageant a été décanté, ajouté au surnageant précédent, puis stocké à −80 °C. Un total de 100 mL de solvant a été ajouté au sédiment. Le bécher a ensuite été recouvert de parafilm et agité pendant 3,5 h à TA. La solution est devenue légèrement rougeâtre avec un voile brun clair. Le surnageant a été décanté et ajouté au précédent. Les solutions ont été filtrées d’abord avec un papier filtre (Whatman, n° 589/2) puis avec un filtre à vide Sartolab 180C5 ; un polyéthersulfone (PES) de 0,22 μm a été utilisé pour les extraits éthanoliques et méthanoliques. Pour les extraits acétoniques, un filtre PTFE de 0,45 μm a été utilisé [figure]. Le solvant a été concentré au moyen d’un évaporateur rotatif (température du bain-marie = 37 °C) autant que possible, et le solvant résiduel a été éliminé par lyophilisation.
Cinq composés de référence (étalons) ont été utilisés dans cette étude : acide chlorogénique, quercétine, hyperoside, quercitrine hydrate et hypéricine. Ces substances et différents extraits ont été dissous dans de l’éthanol de qualité HPLC en quantités variables, comme indiqué [tableau], et filtrés à travers un préfiltre de 0,45 μm (Wicom, Allemagne) avant de procéder à l’analyse HPLC.
Pour l’analyse HPLC, un système Chromaster HPLC à détection par barrette de diodes (DAD) muni d’un passeur d’échantillons automatique (5260 Chromaster, VWR HITACHI, Allemagne) a été utilisé. Les composés des extraits ont été identifiés à l’aide d’une colonne Kinetex C18 100 A (Phenomenex, Allemagne, dimensions : 100 mm × 4,6 mm, taille de particule 5 μm) et d’une colonne de garde C18 4 × 3,0 mm (Phenomenex, Allemagne) à température ambiante (25 ± 2 °C). Le solvant A était de l’acide formique à 0,1 %, et le solvant B était de l’acide formique à 0,1 %, 95 % de MeOH et 5 % de H2O. La phase mobile a été préparée fraîchement chaque jour, filtrée à travers un filtre en nylon de 0,45 μm et dégazée après préparation pendant 15 min dans un bain à ultrasons. Le mode gradient présenté dans la Figure S1 (0 min 95 % A, 5 % B ; 82 min 0 % A, 100 % B ; 92 min 0 % A, 100 % B ; 93 min 95 % A, 5 % B ; 100 min 95 % A, 5 % B) a été utilisé avec un débit de 1 mL/min. Des quantités spécifiques de l’extrait séché [tableau] ont été dissoutes dans de l’éthanol de qualité HPLC. Tous les échantillons ont été filtrés à travers un préfiltre de 0,45 μm (Wicom, Allemagne) avant de procéder à l’analyse HPLC. Le volume d’injection était de 10 μL, et chaque solution d’échantillon a été injectée en triple exemplaire à différentes périodes et à différentes concentrations pour toutes les expériences, ce qui indique que la méthode est précise et reproductible. Pour l’identification des composés, des étalons tels que l’acide chlorogénique, l’hyperoside, la quercitrine hydrate, la quercétine et l’hypéricine ont été passés dans les mêmes conditions, en utilisant des dilutions dans de l’éthanol de qualité HPLC [tableau]. La détection a été effectuée à 260, 350 et 590 nm pour tous les échantillons et étalons. Les composés des différents extraits de millepertuis (eau I et II, EtOH 100 %, EtOH 70 %, MeOH 100 %, MeOH 70 %, acétone 100 %, acétone 70 %) ont été identifiés en comparant leurs temps de rétention les uns avec les autres et avec les temps de rétention des étalons, en plus de comparer leurs spectres UV et les données de la littérature.
Les spectres UV de l’hypéricine pure et des extraits de millepertuis ont été acquis avec un détecteur à barrette de diodes Chromaster 5430, et les spectres ont été acquis sur la plage d’absorption de 200–800 nm. L’identification de l’hyperoside, de la quercitrine hydrate, de la quercétine et de l’hypéricine dans les extraits (EtOH, MeOH et acétone ; 100 et 70 %, respectivement) a été effectuée en comparant les courbes issues des maxima d’absorption des extraits à 260 nm à 19,9, 24,36, 29,4 et 81,49 min, respectivement, avec les spectres UV–vis des étalons à la même longueur d’onde et au même temps.
Pour l’analyse HPLC-MS, la colonne utilisée en analyse HPLC a été installée dans un autre appareil HPLC auquel un dispositif MS était directement connecté. Pour l’analyse par chromatographie liquide haute performance à détection de masse (HPLC-MS), un Waters Acquity UPLC avec une colonne Kinetex 5 μm C18 (Phenomenex, 100 × 4,6 mm) a été utilisé avec un gradient linéaire de (A) eau avec 0,1 % d’acide formique et (B) 0,1 % d’acide formique, 95 % de MeOH et 5 % de H2O à un débit de 500 μL/min (initial : 95 % A, 5 % B ; 82 min : 0 % A, 100 % B ; 92 min : 0 % A, 100 % B ; 93 min : 95 % A, 5 % B ; 100 min : 95 % A, 5 % B ; durée : 100 min). Le volume d’injection était de 5 μL. Un chromatogramme a été enregistré parallèlement au spectre de masse. Par conséquent, la mesure UV n’a été effectuée qu’à deux longueurs d’onde, à savoir 260 et 350 nm. L’analyse MS a été réalisée sur un Q-Tof Premier (Waters) utilisant l’ionisation par électronébulisation (ions positifs, tension capillaire de 3 kV ; température de désolvatation de 250 °C ; débit de gaz de désolvatation de 650 L/h (azote)).
La teneur phénolique totale des extraits végétaux a été déterminée comme indiqué dans les références avec quelques modifications. L’acide gallique représente l’un des composés phénoliques de H. perforatum L. et a donc été utilisé comme étalon. Un total de 10 mg de l’étalon (acide gallique) a été dissous dans 100 mL d’eau distillée pour donner une concentration de solution de 100 μg/mL.
Des aliquotes de 0,25, 0,5, 1,0, 1,5 et 2,0 mL de la solution d’acide gallique à 0,1 mg/mL ont été placées dans cinq tubes à essai en verre différents de 15 mL. Un total de 2,5 mL d’une dilution au dixième du réactif phénol de Folin–Ciocalteu (1:10 v/v avec de l’eau distillée) et 2,0 mL d’une solution de carbonate de sodium (Na2CO3) à 7,5 % p/v ont été ajoutés à chaque tube. Le volume dans les tubes a été porté à 10 mL avec de l’eau distillée, ce qui a donné des concentrations d’acide gallique allant de 2,5 à 20 μg/mL. Un mélange de réactifs et d’eau a été utilisé comme blanc. Les solutions obtenues ont été placées dans un bain-marie à 45 °C pendant 30 min. Ensuite, l’absorbance à 765 nm a été lue à l’aide d’un spectrophotomètre UV–vis.
Un total de 10 mg de chacun des extraits a été dissous dans 10 mL d’un solvant approprié (eau, éthanol ou éthanol) pour obtenir une solution à 1 mg/mL. De plus, 1 mL de cette solution a ensuite été placé dans un tube à essai en verre de 15 mL, et le développement de la couleur a été effectué de la même manière que pour l’étalon. L’absorbance des solutions d’essai à 765 nm par rapport à un blanc de réactif (solvant approprié) a été mesurée. Tous les essais ont été effectués en triple exemplaire ; les résultats ont été moyennés et exprimés en moyenne ± erreur type de la moyenne. La concentration de phénols dans les échantillons d’essai a été déterminée par extrapolation à partir de la courbe d’étalonnage standard de l’acide gallique et calculée en mg d’équivalents d’acide gallique (GAE) par g d’extrait séché (de) (mg GAE g⁻¹) à l’aide de la formule décrite par [référence], où P = teneur phénolique totale en milligrammes par gramme de matière végétale sèche (mg/g), C = concentration d’acide gallique établie à partir de la courbe d’étalonnage en milligramme par millilitre (mg/mL), V = volume de la solution d’extrait en millilitres (mL) et M = masse de l’extrait en grammes (g).
L’activité antioxydante des extraits à l’eau, à l’éthanol et au méthanol a été mesurée en fonction de leur activité de piégeage du radical libre stable 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle (DPPH). Le DPPH est un radical reconnu et un piégeur (« piège ») pour d’autres radicaux. En raison d’une puissante bande d’absorption autour de 517 nm, les radicaux DPPH ont une couleur violette prononcée en solution, et lorsqu’ils sont neutralisés, ils virent au jaune pâle ou à l’incolore. Par conséquent, le changement d’absorption à 517 nm permet de calculer le nombre de radicaux primaires. Le dosage DPPH a été réalisé comme décrit précédemment, avec quelques modifications. Différentes concentrations (1–500 μg/mL) des extraits et de l’étalon ont été préparées ; puis 1 mL de chaque solution a été ajouté à 3 mL d’une solution éthanolique de radical libre DPPH à 0,004 %. L’absorbance des préparations a été mesurée après environ 30 min d’exposition à la lumière normale à température ambiante à l’aide d’un spectrophotomètre UV–vis à 517 nm. Les résultats ont été comparés à l’absorption correspondante de concentrations d’acide ascorbique étalon (1–500 μg/mL). Enfin, la capacité de piégeage des radicaux libres (RSC) exprimée en pourcentage a été calculée par l’équation suivante [équation]. Les concentrations inhibitrices (IC50) ont été déterminées. La valeur IC50 indique la concentration d’échantillon requise pour piéger 50 % des radicaux libres DPPH.
Nous utilisons la méthode spectrophotométrique pour évaluer la perte de couleur lors de l’ajout d’antioxydants au chromophore bleu-vert ABTS•+ (acide 2,2-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique)). L’ABTS•+ est réduit par les antioxydants en ABTS et perd sa couleur. L’activité antioxydante ABTS a été mesurée comme décrit ailleurs avec quelques modifications mineures. L’ABTS a été préparé à une concentration de 7 mM en utilisant l’eau comme solvant. La solution d’ABTS a été mélangée avec du persulfate de potassium 2,45 mM dans un rapport de 1:1 (v/v). Le mélange a été placé dans l’obscurité à température ambiante pendant 18 h. La solution d’ABTS•+ a été diluée environ 20 fois avec de l’eau (ou de l’éthanol ou du méthanol selon la nature du solvant employé lors de l’extraction) pour atteindre une absorbance de 0,850 ± 0,05 à 734 nm. Un total de 150 μL de cette solution d’ABTS•+ a été ajouté à 50 μL de différentes concentrations d’extraits et incubé pendant 6 min à température ambiante. Pour le contrôle, 50 μL des solvants (eau, éthanol et méthanol) utilisés lors de l’extraction respective ont été utilisés à la place de l’extrait. L’acide ascorbique a été utilisé comme contrôle positif. L’absorbance à 734 nm a été mesurée par spectrophotométrie dans une microplaque de 96 puits. Le pourcentage d’inhibition a été calculé en utilisant la même équation que dans le dosage DPPH, et l’activité de piégeage des radicaux a été exprimée par la valeur IC50.
Les résultats de toutes les expériences (échantillons, étalons et blanc) ont été rapportés en moyenne ± erreur type de trois déterminations distinctes. L’analyse statistique a été réalisée par analyse de variance à l’aide du logiciel statistique Origin.
Les procédés d’extraction eau I et eau II ont donné un solide brun-jaune avec un rendement de 21 % pour l’eau I et de 16 % pour l’eau II. Les solvants organiques ont donné un solide gris-noir avec un rendement de 25,5 % pour l’éthanol 70 % (gris clair), 7 % pour l’éthanol 100 % (gris noir), 22,9 % pour le méthanol 70 % (gris clair), 18 % pour le méthanol 100 % (gris noir), 23,2 % pour l’acétone 70 % (gris clair) et 7 % pour l’acétone 100 % (gris noir). Les rendements résultant du mélange d’eau avec des solvants organiques étaient beaucoup plus élevés que les rendements des solvants organiques purs. De même, l’extraction à l’eau par la méthode de la tisane a donné des rendements plus élevés que l’ébullition dans l’eau pendant une longue période. En augmentant la polarité du solvant, des rendements plus élevés ont été obtenus, ce qui indique que ce sont principalement des composés hydrophobes qui ont été extraits. Par conséquent, nous concluons que l’extraction de la plante à l’eau par la méthode de la tisane ou à l’aide d’un mélange d’eau et de solvant organique produit des rendements plus élevés d’extrait que les solvants organiques purs ou l’ébullition continue dans l’eau pendant de longues périodes.
La chromatographie en phase inverse a des applications analytiques et préparatives dans le domaine de la séparation et de la purification phytochimiques, et les principes actifs d’un extrait végétal peuvent être isolés à l’aide d’une procédure d’isolement appropriée. Au cours du processus de mise au point du protocole, de nombreux facteurs ont été modifiés et testés, tels que le type de colonne (nature de la phase stationnaire et taille de ses particules), la phase mobile ou l’élution en gradient (la composition exacte des solvants, sa polarité et les gradients de différents solvants), le débit, la température de la colonne, la pression utilisée (maintien de la vitesse linéaire) et la longueur d’onde. Par la suite, nous avons pu mettre au point le protocole utilisé, grâce auquel des pics bien séparés ont été obtenus sans chevauchement évident entre eux. Les différents extraits ont été mesurés par HPLC dans les mêmes conditions et peuvent ainsi être directement comparés les uns aux autres. Les chromatogrammes de la série de mesures aux trois longueurs d’onde les plus importantes (260, 350 et 590 nm) sont présentés [figure]. Les graphiques respectifs ne montrent aucune différence générale entre les extraits éthanoliques, méthanoliques et acétoniques en ce qui concerne la position des pics obtenus ; seules des différences dans l’intensité des pics ont été observées, car certains solvants extraient certains composés plus efficacement que d’autres. Les extraits éthanoliques, méthanoliques et acétoniques (qu’ils soient à 100 ou 70 %) sont similaires quant aux ingrédients présents mais diffèrent par la concentration de ces ingrédients. En revanche, l’extrait aqueux est complètement différent des extraits éthanoliques, méthanoliques ou acétoniques. Les extraits aqueux obtenus par les procédures d’extraction eau I et eau II étaient identiques, en particulier à 260 et 350 nm, où l’on pouvait s’attendre notamment à des phloroglucinols, des flavonoïdes et des acides phénoliques (les constituants actifs, hyperforine et ses dérivés). Tandis que l’extrait aqueux a moins de pics ou des pics très faibles (les pics sont présents, mais lorsqu’ils sont tracés à la même échelle que les chromatogrammes des extraits organiques, ils ne sont pas visibles en raison de leur faible intensité) à 590 nm du chromatogramme, où l’on pourrait s’attendre par exemple à des naphthodianthrones (l’hypéricine présente un très faible niveau de solubilité dans l’eau pure en raison de son hydrophobicité). De plus, on peut conclure qu’à 100 °C, en particulier, les composés fortement polaires sont pratiquement tous décomposés. Les extraits végétaux sont généralement composés d’un mélange de différents types de composés phytochimiques ou de métabolites spécialisés de polarités différentes ; en chromatographie en phase inverse, les composés polaires bioactifs sont élués avant les composés moins polaires ou apolaires. Cela explique pourquoi, dans l’extrait aqueux, moins de pics apparaissent aux temps de rétention élevés, car les temps de rétention élevés correspondent aux métabolites spécialisés moins polaires ou apolaires. Il est clair que les substances moins polaires ou apolaires sont plus difficiles à extraire à partir de l’eau. Il convient également de noter que certains ingrédients du millepertuis ne sont pas stables à haute température et doivent donc toujours être extraits à basse température. Il est également à noter que les principaux constituants des extraits de millepertuis, en particulier les hypéricines, peuvent être retenus par certaines cartouches du filtre lors du processus de filtration. L’hypéricine et la pseudohypéricine sont pratiquement insolubles dans l’eau à température ambiante et ne peuvent être obtenues qu’avec un rendement inférieur à 40 % à des températures plus élevées. Lorsqu’il est préparé par la méthode de la tisane, l’extrait contient de très faibles quantités d’hyperforine. La concentration d’acide chlorogénique, qui a été détecté dans le millepertuis, est inférieure à 1 %.
Dans cette série de mesures [figures], les extraits, les étalons et les extraits enrichis avec des étalons ont été mesurés dans les mêmes conditions. Les étalons ont été utilisés pour analyser les constituants des extraits de millepertuis et ont été choisis pour couvrir l’ensemble du chromatogramme et les longueurs d’onde les plus importantes et, sur la base de leur stabilité et de leur solubilité, dans les solvants utilisés pour l’extraction. Cinq étalons ont été sélectionnés à cette fin, qui représentent les composés les plus importants et les mieux connus du millepertuis. Il s’agit de la quercétine et de la quercitrine, qui ont été utilisées sous forme d’hydrate, ainsi que de l’hyperoside, de l’acide chlorogénique et de l’hypéricine. Les quatre premiers étalons mentionnés couvrent les deux longueurs d’onde importantes 260 et 350 nm et sont répartis au milieu des chromatogrammes obtenus de l’extrait de millepertuis. L’hypéricine est représentée à un temps de rétention élevé (environ 81,5 min) des chromatogrammes du millepertuis et couvre également une absorbance significative à 590 nm [figure].
Les extraits ont été analysés par ajout de différents étalons [figure]. Si le composé à examiner était déjà présent dans l’extrait, le pic correspondant augmenterait dans le chromatogramme de la quantité d’étalon ajoutée. Cette augmentation du pic fournirait ainsi une bonne indication qu’il s’agit du même composé. En ajoutant à l’échantillon les étalons à confirmer, l’effet des dérives de colonne peut être évité. [La figure] montre quatre chromatogrammes, chacun avec un étalon différent ajouté. En raison de l’ajout de l’étalon respectif, un pic a augmenté dans chaque chromatogramme (indiqué par une flèche) par rapport aux chromatogrammes de l’extrait pur. Ainsi, dans les limites de sa précision analytique, cette méthode indique la présence des quatre composés, hyperoside, quercétine, quercitrine hydrate et hypéricine, dans l’extrait éthanolique. Cela s’applique également aux extraits méthanoliques, acétoniques et aqueux et est également en accord avec la littérature [7].
Cependant, une identification définitive des substances n’est pas possible par cette méthode, car d’autres composants pourraient avoir le même temps de rétention. Cette méthode d’analyse de substances par ajout d’un étalon ne sert donc que d’indication de la présence de certains composés et simplifie la comparaison des chromatogrammes avec les informations de la littérature. Par conséquent, des méthodes d’analyse supplémentaires et plus précises ont été utilisées pour l’analyse finale des substances.
Chaque substance possède un spectre UV caractéristique. Les différentes substances séparées par HPLC peuvent ainsi être identifiées en comparant les spectres UV mesurés avec les spectres correspondants de la littérature ou mesurés pour un étalon. Lors de l’analyse des extraits de millepertuis, il faut garder à l’esprit que des ingrédients tels que la quercétine et d’autres ingrédients probables sont sensibles aux variations de pH, ce qui conduit à la formation de nouvelles substances. Pour cette raison, les spectres UV de certains pics avec des constituants suspectés des échantillons mesurés (EtOH 100 ou 70 %) ont été comparés aux spectres UV des étalons, qui ont été enregistrés dans les mêmes conditions. [La figure] montre les spectres UV des étalons mesurés hyperoside, quercitrine hydrate, quercétine et hypéricine, chacun avec les spectres UV des pics correspondants sélectionnés de l’extrait éthanolique. Les pics sélectionnés sont ceux qui ont connu une augmentation de pic lorsque l’échantillon éthanolique a été enrichi avec les étalons respectifs. Sur [la figure], on peut clairement voir que les spectres UV–vis pour les pics aux temps de rétention de 19,907, 24,364 et 29,404 min sont complètement identiques aux spectres UV-vis obtenus pour les étalons hyperoside, quercitrine hydrate et quercétine, respectivement. [La figure] d montre que le spectre UV de l’étalon hypéricine diffère légèrement en intensité du pic sélectionné de l’échantillon éthanolique au même temps, bien que le pic de l’échantillon soit bien isolé, peut-être en raison de la différence de concentration. Les résultats de ces comparaisons montrent que cette méthode n’est que d’une utilité limitée pour l’identification des analytes. L’analyse UV–vis indique simplement la présence de ces composés. La présence d’autres analytes au même pic dans le chromatogramme peut modifier le spectre UV de manière significative. En outre, d’autres analytes peuvent avoir le même spectre UV au même temps de rétention. Pour cette raison, cette méthode ne convient que pour une orientation rapide et de base lors de l’interprétation des chromatogrammes.
La méthode HPLC-MS présente une sélectivité et une sensibilité uniques, car elle combine la chromatographie liquide haute performance, qui a une forte capacité de séparation, avec la détection par spectrométrie de masse, qui a une capacité d’analyse structurale inégalée. Cette technique est une méthode analytique rapide, spécifique et délicate, et constitue l’un des procédés les plus efficaces pour la détermination des métabolites ; elle est ainsi devenue un outil clé dans l’exploration métabolique des extraits végétaux.
La mesure des masses des composants élués est précédée de la détection de l’absorption UV à 260 et 350 nm pour l’extrait éthanolique. Les chromatogrammes de l’échantillon [figures] correspondent à la mesure précédente [figures]. Le spectre de masse [figure] de l’extrait éthanolique présente de nombreux pics sur l’ensemble du spectre, en particulier dans la plage entre 50 et 70 min, où il y a une très forte superposition des pics. Pour offrir une meilleure vue d’ensemble, les pics du spectre de masse sont marqués d’un numéro et présentés dans le Tableau S2 avec les temps de rétention et les masses ioniques correspondants. Pour une comparaison claire du chromatogramme avec le spectre de masse respectif, les temps de rétention des chromatogrammes et des spectres de masse sont comparés [figures]. Il convient de noter que tous les pics du spectre de masse ne peuvent pas être analysés, car certains des composés ne peuvent pas être détectés à l’aide d’un détecteur UV. Cependant, la plupart des composés peuvent être détectés par MS. La méthode d’électronébulisation, économe en échantillon, a été utilisée pour l’ionisation de l’échantillon, dans laquelle des ions chargés positivement sont formés, et il y a une fragmentation négligeable des molécules de l’échantillon. La comparaison des pics du chromatogramme avec les pics du spectre de masse montre que les pics du chromatogramme correspondent aux pics du spectre de masse. Dans les tableaux respectifs [figures], cependant, un pic de spectre de masse ne peut pas être attribué à chaque pic de chromatogramme. Cela peut toutefois être démontré par une comparaison visuelle. Dans les deux chromatogrammes de l’extrait éthanolique [figures], on peut voir que presque tous les pics sont assez étroits. Par conséquent, la méthode utilisée pour séparer les ingrédients de l’extrait peut être considérée comme réussie. Les pics qui ne peuvent pas être complètement séparés sont trop similaires dans leur comportement de rétention pour être séparés en une seule étape avec les conditions choisies. Cela nécessite le fractionnement de l’éluat et une séparation HPLC supplémentaire. Compte tenu des faibles concentrations de composés dans les fractions, il faudrait utiliser des appareils HPLC adaptés à de très petites quantités d’échantillon. Lors de l’évaluation du spectre de masse [figure], tous les pics sont plus ou moins superposés. Des groupes distincts n’ont été observés que jusqu’à 45 min. De 45 à environ 72 min, tant de pics ont été enregistrés que seuls les pics saillants peuvent être examinés de plus près.
[La figure] montre les substances identifiées à partir du spectre de masse de l’extrait éthanolique. À l’exception de l’hypéricine, les composés les plus importants et les mieux connus peuvent être identifiés. En mode ESI positif, l’ion moléculaire protoné proéminent [M + H]+ à m/z 355,17 se réfère à l’acide chlorogénique. Le m/z 303,03 a été caractérisé par les pertes du résidu de sucre de la rutine et de l’hyperoside. Le m/z 303,04 indique la quercitrine sans le résidu de sucre, tandis que le m/z 303,05 correspond à la quercétine, et le m/z 539,09 a été déterminé comme étant un ion fragment caractéristique de la biapigénine. Le m/z 551,42 indique l’adhyperforine, et le m/z 537,43 se réfère à l’hyperforine. Cependant, la plupart des composés (Tableau S3) ne peuvent pas être identifiés malgré le très grand nombre de pics. Les raisons possibles pourraient être que tous les pics du spectre de masse ne sont pas pris en compte et que de nombreux pics sont superposés. Cela signifie que la plupart des pics sont encore des composés inconnus parce que (i) certains des composés ne peuvent pas être détectés à l’aide d’un détecteur UV ; (ii) en raison d’interférences, où certains pics peuvent fusionner à partir de plusieurs pics ; (iii) les masses moléculaires peuvent ne pas être présentes dans la bibliothèque de l’appareil. Pour pouvoir analyser ces aspects, des étapes de séparation HPLC supplémentaires de fractions individuelles doivent être effectuées, comme déjà mentionné. Des méthodes supplémentaires sont également nécessaires, dans lesquelles des fragments moléculaires apparaissent lors de la mesure par spectrométrie de masse, afin de permettre une analyse encore plus précise.
La plupart des activités antioxydantes d’origine végétale proviennent de composés phénoliques. Les composés phytochimiques, en particulier les composés phénoliques dans l’extrait végétal, sont les principaux composants bioactifs connus pour leurs bienfaits pour la santé. Les composés phénoliques sont constitués d’un cycle aromatique (acides phénoliques) ou plus (polyphénols) avec des groupes hydroxyle liés à leur structure. Les composés phénoliques agissent comme agents réducteurs, donneurs d’hydrogène et désactivateurs de l’oxygène singulet en raison de leurs propriétés redox. Les antioxydants naturels de la plante présentent un large éventail d’activités biologiques, notamment des actions antibactérienne, anti-inflammatoire, antivirale, antiallergique, antithrombotique et vasodilatatrice. La teneur phénolique des extraits végétaux de millepertuis a été déterminée par spectrophotométrie à l’aide du dosage de Folin–Ciocalteu et exprimée en équivalents d’acide gallique (GAE). Il n’y avait pas de différence significative dans les composés phénoliques résultants pour les différentes méthodes à base d’eau [figure]. Bien que la différence soit minime, nous notons que l’extraction de la plante après l’ajout d’eau bouillante donne un meilleur résultat que le chauffage progressif de l’eau avec la plante. Une différence significative a été observée entre l’extrait méthanolique (93,2 mg GAE/g) et l’extrait éthanolique (64,4 mg GAE/g). La valeur pour les extraits aqueux est beaucoup plus élevée que pour le méthanol et l’éthanol ; cela peut être dû au fait que les extraits méthanoliques et éthanoliques ne se dissolvent pas complètement dans l’eau. Nous notons que la courbe d’étalonnage standard de l’acide gallique (Y = 0,06063X + 0,06734) est linéaire dans la plage de 0–20 μg/mL avec un coefficient de corrélation (r²) de 0,997 (Figure S2). La sélection appropriée du solvant d’extraction n’est pas aussi simple qu’il n’y paraît. L’extraction efficace des composés phénoliques repose sur une sélection de solvant appropriée, des températures élevées et une agitation mécanique. La solubilité dépend de la polarité des composés phénoliques présents dans la plante. Les composés phénoliques ont la capacité de former des liaisons hydrogène avec les molécules d’eau, ils sont donc solubles dans l’eau, un solvant polaire.
Dans le test DPPH, nous avons examiné la capacité des extraits testés de H. perforatum L. à agir comme donneurs d’électrons ou d’atomes d’hydrogène dans la conversion des radicaux DPPH en leur forme réduite DPPH·-H. Dans la présente étude, des extraits aqueux, éthanoliques et méthanoliques ont été étudiés. Tous les extraits ont montré une activité de piégeage des radicaux libres [figure], ce qui signifie que tous les extraits évalués étaient capables de réduire le radical DPPH stable, de couleur violette, en DPPH.-H de couleur jaune [figure]. Les activités antioxydantes des composés phytochimiques présents dans ces extraits dépendent peut-être de facteurs structuraux, tels que le nombre de groupes cétoniques, de groupes carboxyliques libres, de groupes méthoxyle, d’hydroxyle phénolique, d’hydroxyle de flavone et d’autres avantages structuraux. Pour le calcul des valeurs IC50, la fonction théorique suivante a été ajustée aux mesures à l’aide du solveur Microsoft Excel [figure]. A, B et C sont les paramètres de la fonction, x est la concentration et f(x) est l’activité correspondante. Pour les extraits marqués par *, la valeur A a été fixée à la valeur A de la valeur d’acide ascorbique correspondante, car sinon aucun ajustement raisonnable n’est obtenu. Les erreurs des paramètres sont déterminées par l’inverse de la matrice d’information de Fisher. À l’aide du calcul de propagation des erreurs, l’erreur type des valeurs IC50 et l’intervalle de confiance avec α = 0,05 sont calculés. Nous avons constaté que l’IC50 des extraits de H. perforatum L. (millepertuis) est de 51 μg/mL pour l’extrait préparé avec 150 mL d’eau bouillante, de 60 μg/mL pour l’extrait préparé avec 750 mL d’eau froide puis bouilli jusqu’à réduction du volume de la solution à environ 100 mL, de 75 μg/mL pour l’extrait éthanolique et de 67 μg/mL pour l’extrait méthanolique, ce qui indique l’activité antioxydante remarquable des extraits.
Les extraits les plus puissants en termes d’activité antioxydante étaient ceux obtenus par la méthode eau I [figure]. Cela peut s’expliquer par la différence d’activité de piégeage des radicaux libres des extraits en fonction de leur composition chimique et de leur teneur en phénols et flavonoïdes totaux. Généralement, une corrélation positive entre les phénols et l’activité antioxydante a été trouvée, mais la relation n’est pas évidente car elle dépend de la composition complexe de l’échantillon. Le pool de composés phénoliques peut être faible, mais en raison d’une teneur élevée, par exemple, en ascorbate, le statut antioxydant total peut être très élevé. Le type de phénols et la quantité de composés phénoliques individuels présents dans l’extrait affectent les propriétés antioxydantes, et différentes classes de composés à activité antioxydante faible et/ou élevée pourraient être présentes dans l’extrait. Il est important d’analyser chaque classe de composés et de la relier à l’activité antioxydante.
Les données publiées précédemment indiquent qu’il existe des différences significatives dans les résultats des activités de piégeage des extraits de H. perforatum L. (millepertuis), qui sont en partie liées au milieu d’extraction (MeOH, EtOH, eau ou autres solvants) et donc à la teneur des divers composés phénoliques. Les échantillons éthanoliques, qui contenaient la plus faible quantité de phénols, ont montré une activité plus faible (IC50 75 μg/mL) en accord avec plusieurs études qui ont rapporté les relations entre la teneur phénolique et l’activité antioxydante. La corrélation est présentée [figure].
Les solvants utilisés dans le dosage DPPH, le méthanol ou l’éthanol, donnent des résultats incorrects pour les antioxydants polaires (le DPPH est insoluble dans l’eau), de sorte que cette méthode ne fournit pas d’informations utiles sur la réaction réelle de l’antioxydant lorsqu’elle est considérée seule. En revanche, dans le dosage ABTS, le radical est produit dans l’eau juste avant le test par la réaction de l’ABTS avec un agent oxydant, tel que le persulfate de potassium. L’activité antioxydante est spécifiée comme la quantité d’ABTS+• qui est neutralisée après une période de temps déterminée (l’ABTS+• est un radical cation, de sorte que les antioxydants réagissent avec lui par un mécanisme de transfert d’électrons) et comparée à l’activité produite par l’acide ascorbique. Aucune distinction n’est faite entre la cinétique de piégeage des radicaux et la stœchiométrie ; le résultat dépend du temps choisi avant la lecture de l’absorption. L’ABTS est souvent employé dans la recherche en médecine végétale pour mesurer les caractéristiques antioxydantes des agents antioxydants donneurs d’hydrogène et briseurs de chaîne. Cette méthode est utilisable à la fois pour les antioxydants hydrophiles et lipophiles. Pour le calcul des valeurs IC50, la même fonction théorique utilisée précédemment dans la méthode DPPH a été ajustée aux mesures. Les activités de piégeage du radical cation ABTS de divers extraits (eau, éthanol et méthanol) de H. perforatum L. sont illustrées [figure]. Les effets synergiques de ces extraits avec divers solvants sur l’activité de piégeage du cation ABTS ont été calculés [figure]. Les résultats impliquent clairement que les extraits aqueux, éthanoliques et méthanoliques de H. perforatum L. inhibent le radical ABTS ou piègent le radical de manière dose-dépendante. L’activité de piégeage des radicaux des extraits de H. perforatum L. a été estimée en comparant le pourcentage d’inhibition de la formation des radicaux ABTS•+ avec celui de l’acide ascorbique. L’activité était dépendante de la concentration, et l’activité de piégeage maximale a été trouvée dans l’extrait aqueux II (IC50 = 42 μg/mL), suivi de l’extrait aqueux I (IC50 = 51 μg/mL), puis de l’extrait méthanolique (IC50 = 71 μg/mL) et de l’extrait éthanolique (IC50 = 97 μg/mL) [figure]. Tous les extraits obtenus avec différents solvants ont montré des effets de piégeage sur l’ABTS•+ dans la plage des μg/mL. Ce résultat est extrêmement prometteur, car il indique que des procédés d’extraction à moindre coût peuvent être réalisés, car aucun solvant coûteux n’est nécessaire pour obtenir la même quantité de phénols et de substances actives de la plante [figure].
Pour les méthodes techniques expérimentales de récolte, l’analyse statistique a montré que la différence de corrélation entre la méthode d’extraction eau I et la méthode éthanol 70 % est hautement significative avec une p-value de 0,007, tandis que la méthode d’extraction eau II conduit à une récolte sans différence significative avec la méthode éthanol 70 %. Par conséquent, la méthode eau II est recommandée pour l’extraction d’une plus grande quantité de récolte, proche du niveau de la méthode éthanol 70 %, plutôt que la méthode eau I. La corrélation statistique n’a montré aucune signification dans la récolte lors de l’utilisation de 70 et 100 % des solvants méthanol, acétone et éthanol, mais notre recommandation est d’utiliser 70 % de ces solvants, qui donnent une grande quantité de récolte.
Quant aux diagrammes HPLC, comme le montrent les Figures S3–S10, les itérations des huit extraits se sont décalées vers la droite ou vers la gauche, bien que toutes les itérations de tous les extraits aient le même spectre, c’est-à-dire que tous les pics des spectres sont décalés d’environ le même intervalle de temps. De plus, les répétitions des échantillons utilisaient des concentrations différentes, de sorte que l’intensité des pics varie d’un tracé à l’autre selon la concentration prise. Les principales raisons qui affectent le Rt dans notre cas sont que la pompe était ancienne et ne fonctionnait pas toujours avec la même efficacité et que la colonne a été très largement utilisée, également pour d’autres expériences d’autres étudiants au cours du processus de répétition de nos expériences. Cependant, il ressort clairement des tracés de fréquence d’échantillonnage (Figures S3–S10) que le protocole est reproductible et que nous obtiendrons le même spectre et les mêmes pics avec la même différence de temps pour chaque extrait lorsque le balayage est répété.
Pour comparer l’activité de piégeage du DPPH de divers extraits de millepertuis avec l’acide ascorbique comme étalon, le test T apparié a montré que les extraits de millepertuis, c’est-à-dire les extraits aqueux I et II et l’éthanol, ont une faible différence de signification avec l’acide ascorbique dans les mêmes conditions, tandis que l’extrait méthanolique présente une différence significative plus élevée avec l’acide ascorbique à une p-value de 0,134. Cela est probablement dû à la préparation de l’acide ascorbique au cours de cette expérience, apparaissant clairement avec le nombre le plus bas d’activités DPPH enregistrées par rapport aux autres groupes testés ; voir Tableaux S24 et 26 dans les informations complémentaires.
Il existe une forte corrélation entre l’activité de piégeage du DPPH de l’acide ascorbique et des extraits de millepertuis, comme représenté dans le Tableau S25 des informations complémentaires. Ces corrélations peuvent être classées comme des corrélations très fortes pour les deux extraits aqueux I et II à des valeurs supérieures à 0,85, tandis que la corrélation est modérée entre 0,5 et 0,85 pour les extraits éthanolique et méthanolique. Cela signifie que pour la plus haute activité de piégeage du DPPH, il est préférable d’utiliser l’eau comme solvant d’extraction plutôt que l’éthanol et le méthanol avec la plante millepertuis.
La même comparaison a été effectuée par la méthode ABTS à l’aide du test T sur échantillons appariés ; la différence entre les extraits de millepertuis, c’est-à-dire les extraits aqueux I et II, l’éthanol, le méthanol et l’acide ascorbique, était faible à une p-value allant de 0,001 à 0,007, comme le montrent les Tableaux S27 et 29 des informations complémentaires. Cela signifie que la probabilité mentionnée précédemment concernant la préparation de l’acide ascorbique pour l’extrait méthanolique serait correcte. Pour tester la corrélation entre les extraits de millepertuis, c’est-à-dire les extraits aqueux I et II, l’éthanol, le méthanol et l’étalon d’acide ascorbique par ABTS, le même résultat que celui présenté dans le Tableau S28 des informations complémentaires a été confirmé comme mentionné précédemment pour le DPPH.
Dans la présente étude, les parties aériennes (feuilles, tige, pétales et fleurs) de millepertuis de la plaine d’Al-Ghab en Syrie ont été récoltées, nettoyées à l’eau froide, séchées, broyées et extraites à l’aide de différents solvants tels que l’eau (soit par ébullition dans l’eau pendant environ 3 h (eau I), soit par ajout à de l’eau bouillante pendant 20 min (eau II)), l’éthanol, le méthanol et l’acétone, soit purs, soit mélangés à de l’eau à 70 %. Les résultats indiquent que la préparation de l’extrait par la méthode de la tisane (eau II) et l’utilisation de solvants organiques mélangés à de l’eau ont donné un rendement élevé par rapport à la méthode eau I et aux solvants organiques purs. Un protocole rapide, simple et reproductible de chromatographie liquide haute performance à barrette de diodes (HPLC–DAD) avec détection par absorbance UV a été mis au point pour déterminer les profils phytochimiques présents dans les divers extraits de millepertuis de Syrie. Concernant la présence de composés, aucune différence générale n’a été observée dans les profils HPLC des huit extraits, à l’exception des profils des extraits aqueux à la longueur d’onde de 590 nm. C’est la région d’apparition des hypéricines, qui ne se dissolvent pas facilement dans l’eau, sauf à haute température et en très petites proportions. L’autre différence portait sur l’intensité des pics existants, faisant référence aux concentrations respectives des composés. Cela peut s’expliquer par le fait que différents solvants extraient les composés de la plante dans des proportions différentes. La chromatographie liquide haute performance–spectrométrie de masse (UPLC-MS) en mode d’ionisation positive a été réalisée pour séparer les ions des molécules bioactives [M + H]+ des composés dans les extraits par leur rapport masse/charge (m/z) et pour les détecter qualitativement et quantitativement par leur m/z et leur abondance respectifs. Diverses techniques ont été utilisées pour identifier les composés : (i) comparaison avec cinq substances de référence (acide chlorogénique, quercétine, hyperoside, quercitrine hydrate et hypéricine), (ii) comparaison des temps de rétention des pics dans les diagrammes HPLC avec ceux des étalons et ceux rapportés dans la littérature, (iii) comparaison des spectres d’absorption UV des pics avec les spectres UV des substances de référence et les spectres de la littérature, et (iv) mise en correspondance des ions moléculaires protonés proéminents [M + 1]+ des composés avec les masses moléculaires des composés connus pour être présents dans cette plante. Dix composés — hypéricine, rutine, hyperoside, quercitrine, quercétine, biapigénine, hyperforine, quercitrine hydrate, adhyperforine et acide chlorogénique — ont été identifiés, prouvés et confirmés. Tous les extraits de millepertuis (eau I ou eau II, éthanolique, méthanolique et acétonique) étaient des piégeurs efficaces des radicaux libres stables ABTS•+ et DPPH•, et en particulier, les extraits contenant plus de composés phénoliques étaient des piégeurs plus efficaces. Cette activité antioxydante peut s’expliquer par la présence des composés phytochimiques précédemment identifiés par analyse HPLC, UV–vis et HPLC-MS, car il a été démontré qu’ils ont tous une activité antioxydante.
L’extrait aqueux de cette plante a été utilisé dans notre étude précédente comme agent réducteur des ions argent en argent métallique et comme agent protecteur (agent de coiffage ou stabilisateur) pour protéger les nanoparticules d’argent et empêcher leur agrégation. Cette synthèse de nanoparticules d’argent (AgNP) utilisant l’extrait aqueux de millepertuis de Syrie représente une méthode verte, simple, en une seule étape, qui est économique et respectueuse de l’environnement et fournit des agents de coiffage naturels pour la stabilisation des AgNP, sans nécessiter de température, de pression, d’énergie élevées ni de produits chimiques toxiques. Les composés phénoliques provenant de l’extrait aqueux de millepertuis à la surface des AgNP ont joué un rôle important dans leur activité antioxydante et anticancéreuse, comme le montre l’étude mentionnée ci-dessus. Le présent travail examine la conjugaison des AgNP avec des aptamères sélectifs envers des cellules cancéreuses spécifiques. Ainsi, les composés phénoliques du millepertuis à la surface des nanoparticules d’argent pourraient jouer un rôle important dans la thérapie ciblée.
Encart — constituants majeurs identifiés, méthode et niveau de preuve
Dix composés majeurs ont été identifiés, prouvés et confirmés dans les extraits de millepertuis de Syrie : naphthodianthrone hypéricine ; phloroglucinols hyperforine et adhyperforine ; flavonols/glycosides rutine, hyperoside, quercitrine, quercitrine hydrate et quercétine ; biflavone biapigénine ; acide phénolique acide chlorogénique (< 1 %). Méthode : mise au point d’un protocole HPLC–DAD rapide/reproductible avec détection UV–vis (260/350/590 nm), confirmation par HPLC-ESI-Q-TOF MS en mode positif [M+H]+ (m/z : acide chlorogénique 355,17 ; quercétine/quercitrine/rutine/hyperoside → aglycone 303,03–303,05 ; biapigénine 539,09 ; adhyperforine 551,42 ; hyperforine 537,43), et comparaison à 5 étalons + littérature. Rendement d’extraction supérieur par méthode « tisane » (eau II) et solvants aqueux-organiques. Activité antioxydante (DPPH et ABTS) corrélée à la teneur en phénols totaux (Folin–Ciocalteu) : extraits aqueux les plus actifs (ABTS eau II IC50 = 42 μg/mL ; DPPH eau I IC50 = 51 μg/mL) ; extraits organiques purs plus pauvres en phénols et moins actifs. Niveau de preuve : étude analytique in vitro (phytochimie descriptive + tests antioxydants chimiques), sur un seul site de récolte (plaine du Ghab, Syrie, 2018) ; pas de modèle biologique ni clinique.
Note de fidélité : l’étude mesure une activité antioxydante (DPPH/ABTS) ; l’activité antibactérienne/antimicrobienne n’est mentionnée qu’en passant dans l’introduction, sans expérimentation. Lien de propriété rattaché en conséquence à Antioxydant.
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