Référence : Drug Delivery 2018. — PMC6058565 · DOI 10.1080/10717544.2018.1431977 Type : Article de recherche (étude expérimentale in vivo, cicatrisation cutanée chez le chien) · Plante : Millepertuis perforé · Propriété → Peau Accès : ⭐ libre (Open Access CC BY 4.0) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Les composés actifs présents dans Hypericum perforatum L. (Hypericaceae) comprennent l’hyperforine, les hypéricines et les flavonoïdes, dont on suppose qu’ils sont responsables de l’activité de l’extrait dans le traitement des plaies et des cicatrices. La présente étude visait à incorporer un extrait de H. perforatum, standardisé sur une teneur connue en phloroglucinols, naphtodianthrones et composés polyphénoliques, dans un système transdermique efficace de délivrance de médicament capable d’encapsuler à la fois les constituants lipophiles et hydrophiles, sous forme de gels niosomaux pour le traitement des plaies. Un extrait à l’éthanol 80 % (HE) a été préparé à l’échelle pilote à l’aide du DIG-MAZ. Un profil holistique en HPLC-DAD a été établi pour HE, qui a été standardisé pour contenir 3,4 ± 4 de rutine, 1,1 ± 3 d’acide chlorogénique, 0,5 ± 2 de quercitrine, 2,8 ± 2 d’hyperforine, et 0,51 ± 3 % p/p d’hypéricines totales. Les niosomes ont été préparés à l’aide de la technique modifiée d’évaporation en phase inverse (REV). L’effet cicatrisant du gel a été testé sur 16 chiens bâtards adultes. Une diminution significative du nombre de cellules inflammatoires (18,4 ± 5,3) a été enregistrée dans le groupe traité par le gel niosomal à 1,5 % de NaCMC au 7e jour après la blessure. Il a induit une régression marquée de la phase inflammatoire et favorisé le début précoce de la phase proliférative de la cicatrisation. Après 21 jours, il a montré une ré-épithélialisation complète, la formation de nouvelles fibres de matrice et une réduction significative de la taille de la plaie, par rapport au groupe témoin et au groupe traité par crème de Panthénol® à 2 %. Il s’agit de la première étude de H. perforatum dans un système topique niosomal de délivrance de médicament.
Mots-clés : Hypericum perforatum ; niosomes ; in vivo ; standardisation ; plaie.
Hypericum perforatum L. (Hypericaceae), communément appelé millepertuis (St. John’s Wort), est une herbe qui atteint une hauteur de 50 à 60 cm. Elle est originaire d’Europe, d’Asie occidentale et d’Afrique du Nord, et naturalisée dans de nombreuses parties du monde, dont l’Amérique du Nord, l’Australie et le Chili. Bien qu’elle ait été utilisée comme plante médicinale antidépressive, elle a néanmoins été traditionnellement connue comme remède externe pour les plaies, les ulcères, les coups de soleil et les hémorroïdes (OMS, 2002).
Hypericum contient des flavonoïdes, des hyperforines et le produit de dégradation de l’hypéricine, qui lui confère sa couleur rouge (Miraldi et al., 2006). L’hyperforine, hautement lipophile (phloroglucinols), possède des effets antimicrobiens, anti-inflammatoires et antioxydants, et stimule par ailleurs la différenciation des kératinocytes. Les hypéricines lipophiles (naphtodianthrones) présentent également des activités antimicrobiennes et anti-inflammatoires. Les préparations traditionnelles d’Hypericum, composées de constituants variables, ont de forts effets dermatologiques qui favorisent l’activité synergique de l’hyperforine, des hypéricines et des autres composants hydrophiles tels que les flavonoïdes et les composés phénoliques (Wölfle et al., 2014).
Les niosomes sont de nouveaux systèmes de délivrance de médicaments (Moghassemi & Hadjizadeh, 2014). Ils peuvent encapsuler des médicaments lipophiles dans des membranes vésiculaires en bicouche et piéger des médicaments hydrophiles dans des compartiments aqueux. Ils possèdent une capacité de pénétration supérieure à celle des autres préparations couramment utilisées de nos jours comme systèmes transdermiques de délivrance de médicaments (Purasa et al., 2013).
La cicatrisation est la réponse naturelle des tissus lésés, constituée des phases interactives d’inflammation, de prolifération et de remodelage. Plusieurs études ont examiné l’activité cicatrisante des extraits et fractions de H. perforatum ; cependant, aucun de ces travaux n’a établi une empreinte chromatographique holistique de l’extrait d’Hypericum testé, montrant sa teneur en phloroglucinols, naphtodianthrones et composés phénoliques (Öztürk et al., 2007 ; Süntar et al., 2010). Süntar et al. (2010) ont prouvé que les parties aériennes de H. perforatum possédaient des activités cicatrisantes et anti-inflammatoires remarquables en favorisant la migration des fibroblastes et le dépôt de collagène, et que la fraction à l’acétate d’éthyle contenant des flavonoïdes et des naphtodianthrones possédait la plus haute activité. Öztürk et al. (2007) ont supposé que l’activité cicatrisante était due à la migration des fibroblastes et à la stimulation de la synthèse de collagène, émettant l’hypothèse qu’elle ne dépendait pas uniquement de la teneur en hypéricine.
Les formulations pharmaceutiques disponibles de nos jours contiennent l’extrait, qui est généralement standardisé pour n’inclure que l’hyperforine, fournissant une pommade lipophile dans une base huileuse, peu commode et peu efficace. Ainsi, l’objectif de la présente étude était de préparer une formulation de gel topique niosomal capable d’encapsuler à la fois les constituants lipophiles et hydrophiles de l’extrait d’Hypericum, standardisé pour contenir une concentration spécifique en hyperforine, hypéricines et autres composés phénoliques, et d’étudier son effet cicatrisant in vivo sur des chiens.
Les sommités fleuries de H. perforatum ont été récoltées en mai 2010 dans les fermes SEKEM, 3 Cairo-Belbeis Desert Road, Égypte. La plante a été authentifiée par le Dr M. Gebali (Département de taxonomie végétale et de flore égyptienne, National Research Center, Giza, Égypte). Les sommités fleuries ont été séchées dans une étuve à vide à 40 °C. Le nom de la plante a été vérifié à l’aide de The Plant List (http://www.theplantlist.org/). Un spécimen de référence (voucher n° 916) a été déposé à l’herbier du Département de pharmacognosie, Faculté de pharmacie, Université du Caire, Égypte.
L’acétonitrile, le méthanol, l’acide ortho-phosphorique (qualité HPLC), la rutine, l’hyperoside, l’hypéricine et l’hyperforine ont été achetés chez Sigma-Aldrich, Allemagne, pour le profilage phytochimique. La quercétine dihydratée (≥ 98 %) a été obtenue chez Carl Roth (Karlsruhe, Allemagne). L’hydroxyéthylcellulose (HEC), l’hydroxypropylméthylcellulose (HPMC), la carboxyméthylcellulose sodique (NaCMC) et le Pluronic F-127 ont été achetés chez Sigma-Aldrich, Allemagne, pour les formulations. La kétamine HCl 5 % (Rotex medica, Trittau, Allemagne) et la crème de Panthénol® 2 % (Nile Co. for Pharmaceuticals and Chemical Industries, Égypte) ont été obtenues pour les expériences in vivo. La formaline, le xylène, la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, et la coloration au trichrome de Masson ont été fournis par Sigma-Aldrich, Allemagne, pour l’histopathologie. Tous les autres produits chimiques et réactifs étaient de qualité analytique.
Les sommités fleuries séchées de Hypericum perforatum ont été extraites à l’échelle de laboratoire au moyen de l’extraction accélérée par solvant ASE®100 (Dionex). La meilleure méthode d’extraction a été déterminée en choisissant entre le méthanol 80 % et l’éthanol 80 % comme solvants d’extraction, tous deux à température ambiante et à 70 °C. L’herbe a été découpée au mélangeur pendant quelques secondes et la poudre a été introduite dans la cellule d’extraction. Les extraits ont été évaporés sous vide à l’aide de l’évaporateur rotatif à une température n’excédant pas 40 °C. Le poids sec moyen des extraits a été calculé comme la moyenne de trois mesures ± E.S.
Les sommités fleuries séchées ont été extraites à l’échelle pilote à l’aide d’un système d’extraction multifonctionnel DIG-MAZ (Samtech, Autriche) qui combine différentes méthodes d’extraction telles que la percolation, la digestion, la macération et la distillation. L’herbe séchée a été broyée à une taille de particule de 6 mm, une cuve d’extraction de 10 L a été garnie de l’herbe (1,23 kg), et de l’éthanol 80 % a été pompé dans le conteneur à solvant de 60 L à une température constante de 70 °C. Un total de quatre cycles d’extraction a été réalisé en utilisant 15 ; 5 ; 5,1 et 4,2 L de solvant frais pour des durées d’extraction de 90, 40, 40 et 45 min, respectivement. L’extrait (HE) a été concentré sous vide, puis lyophilisé (rendement = 409 g) et conservé à –20 °C, à l’abri de la lumière et sous azote, pour utilisation ultérieure.
Les niosomes ont été préparés à l’aide de la technique modifiée d’évaporation en phase inverse (REV) (Handa et al., 1987) avec différents rapports de Span 20, 60 et 80, six systèmes niosomaux ayant été préparés (F1–F6) (Tableau 1(A)). L’extrait (HE) a été dispersé dans de l’eau distillée à l’aide d’un sonicateur (Crest Ultrasonic Corp., Model 275 T, Trenton, NJ). Le cholestérol et le Span ont été dissous dans un mélange de chloroforme et de méthanol (2:1) et agités à 800 tr/min à l’aide d’un mélangeur mécanique (Russell Hobbs, Autriche). La solution d’extrait préparée a été ajoutée au solvant et homogénéisée pendant 3 min. La suspension a ensuite été chauffée au bain-marie pendant 10 min à 60 °C pour évaporer les solvants organiques.
Tableau 1(A). Composition des niosomes (toutes les valeurs sont données en rapport de poids)
| Échantillon | Span 20 | Span 60 | Span 80 | Cholestérol | Extrait |
|---|---|---|---|---|---|
| F1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 |
| F2 | 0 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| F3 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| F4 | 0,5 | 0,5 | 0 | 1 | 1 |
| F5 | 0,5 | 0 | 0,5 | 1 | 1 |
| F6 | 0 | 0,5 | 0,5 | 1 | 1 |
La suspension niosomale a été centrifugée à 15 000 tr/min à 4 °C pendant 20 min. Le surnageant a été retiré et le précipité a été lavé trois fois avec un tampon pour éliminer tous les composés libérés. Le précipité a ensuite été dissous dans de l’éthanol 96 % par sonication pendant 30 min (Ruckmani & Sankar, 2010). L’analyse quantitative de la teneur en extrait des niosomes a été mesurée par HPLC-DAD et les hypéricines totales ont été déterminées par spectrophotométrie. L’efficacité d’encapsulation (EE %) a été calculée par le rapport entre la quantité de composé encapsulé dans les culots et la quantité initiale dans l’extrait utilisé (HE).
La taille des vésicules et le potentiel zêta de la formule niosomale optimale présentant la plus haute efficacité d’encapsulation ont été déterminés à l’aide du Malvern Zetasizer à 25 °C (Malvern Instrument Ltd., Worcestershire, Royaume-Uni). Les aspects morphologiques de la formule niosomale optimale ont été évalués par microscopie électronique à transmission (MET) (Jeol-200 CX, Joel).
Les gels ont été préparés en dissolvant le polymère gélifiant dans de l’eau distillée (poids total 50 g) et en agitant à 270 tr/min à l’aide d’un agitateur mécanique (Heidolph RZR 2021). Deux grammes de la formule niosomale optimale ont été dispersés dans 38 g d’eau distillée et ajoutés au gel. De la glycérine (2,5 g) et du propylène glycol (5 g) ont été mélangés et ajoutés au gel comme conservateurs. La carboxyméthylcellulose sodique (NaCMC) à 1,5 % et l’hydroxyéthylcellulose (HEC) à 3 % ont été sélectionnées comme polymères (les résultats de la sélection ne sont pas présentés).
Cette étude a été réalisée à l’aide d’un appareil de test de dissolution USP 1 (Pharma test, Allemagne), avec une légère modification consistant à retirer le panier et à insérer à la place un tamis en acier inoxydable (diamètre de maille = 100 µm). Le poids spécifié du gel niosomal à tester a été placé sur le tamis en acier inoxydable et plongé dans une solution aqueuse de 400 ml placée dans le récipient de l’appareil de test de dissolution USP afin de maintenir des conditions de puits (sink). L’étude de libération a été réalisée à 32 ± 0,5 °C (température de la peau) et l’arbre d’agitation a été mis en rotation à une vitesse de 50 tr/min (Rafiee-Tehrani & Mehramizi, 2000). Des aliquotes du milieu libéré ont été prélevées pour analyse à des intervalles de temps prédéterminés (30, 60, 90, 120, 150 et 180 min) et remplacées par des quantités égales de milieu frais pour maintenir un volume constant. L’absorbance des échantillons collectés a été mesurée par spectrophotométrie à 590 nm, après filtration, en utilisant la solution aqueuse comme blanc. Toutes les expériences ont été réalisées en triple exemplaire.
Le mécanisme de libération a été déterminé. Les données de libération ont été analysées par régression linéaire selon : Cinétique d’ordre zéro : Cₜ = C₀ − k₀t Cinétique de premier ordre : Cₜ = C₀e^(−kt)
Et selon le modèle simplifié de diffusion de Higuchi : Cₜ = kₕ√t
où Cₜ est la quantité totale de médicament (en %) libérée après un temps t, C₀ est la quantité initiale de médicament (en %), k₀ est la constante de vitesse de libération d’ordre zéro (% min⁻¹), k est la constante de vitesse de libération de premier ordre (min⁻¹), et kₕ est la constante de vitesse obtenue selon l’équation de Higuchi (% min⁻⁰·⁵).
L’ordre de libération du médicament à partir de chaque gel a été déterminé en calculant le coefficient de détermination (r²) dans chaque cas. La valeur la plus élevée représente l’ordre de libération du médicament à partir du gel.
Une méthode HPLC analytique a été développée pour l’analyse des extraits et des gels niosomaux. Un HPLC UltiMate® 3000 (Dionex, CA, USA) a été utilisé, équipé d’une pompe quaternaire P680 LPG et d’un détecteur à barrette de photodiodes UVD 340 U, piloté à l’aide du système de gestion de chromatographie CHROMELEON™ (Thermo Fischer Scientific, MA, USA). Tous les échantillons ont été dissous dans du méthanol et filtrés à travers un filtre-seringue (CHROMAFIL RC-45/25 0,45 µm, Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne). Les extraits et les étalons ont été injectés dans une colonne Acclaim® 120 C18, 5 µm, 150 × 4,6 mm. Les phases mobiles utilisées étaient de l’acide ortho-phosphorique à 0,3 % dans l’eau (solvant A) et de l’acétonitrile (solvant B). L’élution en gradient a été réalisée à un débit de 1,0 ml/min (0–12 min, 90:10 à 80:20 A:B ; 12–30 min, 80:20 à 10:90 A:B ; 30–37 min, 10:90 à 5:95 A:B ; 37–40 min, 5:95 à 90:10 A:B ; 40–45 min, 90:10 A:B). Le volume d’injection était de 20 µL et la détection UV a été effectuée à 270 nm. L’analyse quantitative des composés majeurs présents dans les extraits et les gels niosomaux a été réalisée en utilisant des facteurs de réponse relatifs par rapport à la rutine (Isacchi et al., 2007). Une courbe d’étalonnage standard de la rutine a été établie (40–200 µg/mL). Les étalons et les échantillons ont été injectés en triple exemplaire.
Les hypéricines totales dans les extraits et les gels niosomaux ont été déterminées à l’aide d’un spectrophotomètre Shimadzu UV-1601 (EMEA, 2009). Une solution de chaque échantillon a été préparée dans du méthanol à une concentration de 2 µg/mL. La solution de test a été filtrée via un filtre-seringue PTFE 0,45 µm (Sigma-Aldrich), et l’absorbance a été mesurée à λ = 590 nm contre du méthanol comme blanc. Hypéricines totales = A/(C × 870), où A est l’absorbance à 590 nm, C la concentration de la solution de test en g/ml, et 870 l’absorbance spécifique de l’hypéricine.
Les expériences ont été réalisées sur 16 chiens bâtards adultes des deux sexes, pesant de 20 à 25 kg. Les animaux ont été hébergés dans des conditions environnementales standard (23 ± 1 °C, avec 55 ± 5 % d’humidité et un cycle lumière/obscurité de 12 h), et maintenus avec un accès libre à l’eau et trois repas par jour, comprenant des aliments secs (Sportmix-adult®, IL, USA).
Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations des directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (USA). Le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique pour l’utilisation et le soin des animaux, à la Faculté de médecine vétérinaire de l’Université du Caire, Égypte. Toutes les chirurgies ont été réalisées sous anesthésie générale, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. Les chiens ont été anesthésiés par injection intraveineuse de 10 mg/kg de kétamine HCl 5 % (Süntar et al., 2010). Un côté du thorax de chaque chien a été préparé chirurgicalement pour une chirurgie aseptique. Cinq plaies cutanées circulaires de pleine épaisseur, de 2 cm de diamètre chacune, ont été réalisées (Figure 1). Les animaux ont été répartis au hasard en 4 groupes principaux, contenant chacun 4 chiens, représentant 0, 7, 14 et 21 jours après la blessure. Les groupes principaux ont été subdivisés en 4 sous-groupes selon les matériaux de pansement, comme suit : sous-groupe 1 — aucun matériau n’a été utilisé sur la zone lésée, servant de témoin ; sous-groupe 2 — chaque zone lésée a été recouverte de 0,5 g de crème de Panthénol® trois fois par jour ; sous-groupes 3 et 4 — chaque zone lésée a été recouverte de 0,5 g de gel niosomal d’Hypericum à 1,5 % de NaCMC trois fois par jour. Toutes les observations cliniques, mesures et analyses des résultats ont été effectuées par un investigateur qui ignorait l’attribution des groupes et le plan expérimental (en aveugle).
La plaie de chaque groupe a été examinée et la surface de la plaie a été mesurée à l’aide d’une règle graduée (Süntar et al., 2010) le jour de la chirurgie (jour 0) et aux 3e, 5e, 7e, 9e et 14e jours après la chirurgie. Le pourcentage de fermeture de la plaie a ensuite été calculé, selon Ghaisas et al. (2014). Les mesures ont été réalisées trois fois et analysées à l’aide du logiciel SPSS V.17. Les valeurs ont été rapportées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (ES).
% de fermeture de la plaie = (surface de la plaie au jour 0 − surface de la plaie au jour n) / surface de la plaie au jour 0 × 100
où n = nombre de jours (0, 3, 5, 7, 9 et 14).
Des échantillons de tissu de la plaie cutanée aux jours 0 (2 heures après la chirurgie), 7e, 14e et 21e après la blessure ont été fixés dans de la formaline à 10 %, déshydratés, éclaircis au xylène, puis inclus dans de la paraffine (Süntar et al., 2010). Des coupes de tissu de 5 µm d’épaisseur ont été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) ou au trichrome de Masson, puis examinées au microscope optique (Leica Microsystems, Wetzler, Allemagne). Les coupes colorées à l’H&E ont été examinées pour évaluer le nombre de cellules inflammatoires, comprenant les cellules polymorphonucléaires et mononucléaires, l’œdème, l’hémorragie, la nécrose, la prolifération des fibroblastes et l’angiogenèse. Les coupes colorées au trichrome de Masson ont été examinées pour évaluer le tissu de granulation et la formation de la matrice.
Les cellules inflammatoires (polymorphonucléaires et mononucléaires) ont été comptées dans cinq champs consécutifs au grossissement (× 40), à partir de la partie superficielle de la brèche de la plaie au 7e jour après la blessure (Süntar et al., 2010). Les données ont été analysées statistiquement par analyse de variance à un facteur (ANOVA), logiciel SPSS version 17. Les valeurs ont été rapportées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (ES).
Les alcools sont généralement utilisés pour l’extraction d’un large spectre de composés polaires et non polaires. Le méthanol est le solvant le plus couramment utilisé pour l’extraction et l’analyse de H. perforatum à l’échelle de laboratoire (Isacchi et al., 2007 ; Filippini et al., 2010 ; Tawaha et al., 2010). Cependant, comme il est classé comme toxique, l’éthanol est préférable dans les préparations pharmaceutiques. Les efficacités d’extraction de ces deux solvants ont été comparées à température ambiante et à 70 °C à l’aide de l’extraction accélérée par solvant ASE®100 ; les résultats ont révélé que le rendement d’extraction de l’éthanol 80 % à 70 °C était le plus élevé (22 ± 3 % p/p) (Figure 1S). De plus, une étude quantitative comparative des constituants majeurs dans les quatre extraits a montré que l’éthanol 80 % à 70 °C fournissait les quantités les plus élevées de constituants actifs, en valeur relative (Figure 2(A)). Ainsi, l’extraction à l’échelle pilote à l’aide du DIG-MAZ a été réalisée en utilisant l’éthanol 80 % (70 °C) comme solvant d’extraction. Un profil chromatographique HPLC-DAD a été établi pour l’extrait (HE) montrant les constituants majeurs (Figure 2(B)). HE a été standardisé pour contenir 3,4 ± 4 de rutine, 1,1 ± 3 d’acide chlorogénique, 0,5 ± 2 de quercitrine, 2,8 ± 2 % d’hyperforine p/p et 0,51 ± 3 % p/p d’hypéricines totales, tel que déterminé par spectrophotométrie à λ = 590 nm.
L’analyse HPLC et spectrophotométrique des niosomes a révélé que tous les niosomes préparés contenaient des concentrations en principes actifs presque identiques à celles de l’extrait incorporé (HE). L’EE % pour les hypéricines totales, l’hyperforine, la rutine et la quercitrine a été calculé pour les 6 niosomes (Tableau 1(B)). La plus grande quantité d’hyperforine a été encapsulée par le niosome F1, tandis que celle des hypéricines totales et de la quercitrine l’a été par le niosome F5 et celle de la rutine par le niosome F6. Cependant, le niosome F1 (Span 20:cholestérol, 1:1) a montré, en valeur relative, la teneur la plus élevée en hypéricines totales, hyperforine, rutine et quercitrine (0,42 ± 0,1 ; 2,1 ± 0,2 ; 1,2 ± 0,2 et 0,31 ± 0,02 % p/p, respectivement). De plus, 80 % du médicament était encapsulé dans le niosome F1, calculé en hypéricines totales. Ainsi, F1 a été utilisé pour la préparation du gel niosomal.
Tableau 1(B). Efficacité d’encapsulation [EE % ± E.S.]
| Hyperforine | Hypéricine | Rutine | Quercitrine | |
|---|---|---|---|---|
| F1 | 70 ± 1,3 | 74 ± 1,4 | 28 ± 1,2 | 45 ± 0,7 |
| F2 | 55 ± 2,0 | 35 ± 1,7 | 35 ± 1,5 | 75 ± 0,6 |
| F3 | 61 ± 1,4 | 29 ± 0,9 | 13 ± 0,7 | 84 ± 0,9 |
| F4 | 48 ± 1,4 | 88 ± 0,8 | 18 ± 0,9 | 92 ± 1,4 |
| F5 | 40 ± 1,6 | 100 ± 2,1 | 14 ± 0,8 | 93 ± 1,7 |
| F6 | 47 ± 1,3 | 90 ± 1,0 | 41 ± 1,3 | 90 ± 1,3 |
La mesure de la taille des particules a été réalisée pour confirmer que les particules de la formule niosomale optimale (F1) étaient toutes de l’ordre du nanomètre. La Z-moyenne de F1 s’est avérée être de 490,45 ± 27,64 nm, avec un indice de polydispersité de 0,26 ± 0,01. Le potentiel zêta mesuré s’est avéré être de −41,10 ± 0,84. La valeur élevée de potentiel zêta obtenue indiquait une haute stabilité de la dispersion niosomale préparée.
Les micrographies MET de la formule niosomale optimale (F1) sont présentées à la Figure 3. La morphologie a été examinée par MET afin de confirmer la formation de vésicules niosomales à paroi en bicouche. Les micrographies MET obtenues ont montré que les niosomes préparés étaient de taille nanométrique, ce qui confirmait les résultats de la mesure de la taille des particules. Les micrographies ont également confirmé la formation de vésicules niosomales à membranes en bicouche.
Les gels niosomaux ont été préparés en utilisant à la fois le HEC 3 % et le NaCMC 1,5 % comme polymères, en raison du taux élevé de libération du médicament et des caractéristiques physiques et rhéologiques appropriées de leurs hydrogels (résultats non présentés). La libération in vitro du médicament (en hypéricines totales) à partir des deux gels niosomaux a montré des vitesses similaires, ainsi qu’une quantité de médicament libérée après 180 min (85,0 ± 4 % et 78,8 ± 1 % pour le HEC 3 % et le NaCMC 1,5 %, respectivement) (Figure 4). L’analyse cinétique des données de libération du médicament a révélé que la libération d’Hypericum à partir de tous les gels suivait le mécanisme de diffusion de Higuchi. Le gel niosomal préparé avec le NaCMC 1,5 % a été choisi comme système topique de délivrance de médicament pour les essais in vivo, sur la base de ses données de libération de médicament et de sa plus faible teneur en polymère.
Une fermeture significative de la plaie a été enregistrée au jour 14 dans le groupe recevant le gel niosomal à 1,5 % de NaCMC (93,56 ± 5,4 %) par rapport aux groupes témoin et traité par Panthénol® (84,32 ± 3,0 et 88,33 ± 1,9 %, respectivement) (Tableau 1S).
Une diminution significative du nombre de cellules inflammatoires a été enregistrée dans le groupe recevant le gel niosomal à 1,5 % de NaCMC (18,4 ± 5,3) au 7e jour après la blessure. En revanche, une augmentation significative du nombre de cellules inflammatoires a été enregistrée dans les groupes témoin et traité par Panthénol® (68,4 ± 2,2 et 61,2 ± 4,2, respectivement). Ainsi, la formulation topique niosomale a produit une régression marquée de la phase inflammatoire et favorisé le début précoce de la phase proliférative de la cicatrisation, par rapport aux groupes témoin et traité par Panthénol.
La cicatrisation est un processus systématique qui s’explique en termes de quatre phases chevauchantes : hémostase, inflammation, prolifération et maturation. Les plaquettes jouent un rôle crucial dans la formation du caillot lors de l’hémostase, tandis que les cellules inflammatoires nettoient le tissu lésé pendant la phase inflammatoire. L’épithélialisation, la fibroplasie et l’angiogenèse se produisent pendant la phase proliférative, tandis que le tissu de granulation se forme. Le collagène forme des liaisons croisées serrées augmentant la résistance à la traction de la cicatrice pendant la phase de maturation.
Dans cette étude, l’examen histopathologique de la plaie cutanée au jour 0 n’a montré aucune différence significative entre tous les groupes, les lésions étant caractérisées par de larges brèches avec perte complète des couches cellulaires épidermiques et dermiques et exposition du tissu sous-cutané (Figure 5(A)). Au 7e jour, les groupes témoin et traité par Panthénol ont révélé un œdème étendu, une hémorragie, une nécrose et une infiltration massive de cellules inflammatoires, principalement des leucocytes polymorphonucléaires. En revanche, l’angiogenèse et la prolifération fibroblastique étaient remarquablement présentes dans les groupes traités par le gel niosomal à 1,5 % de NaCMC. La coloration au trichrome de Masson a révélé une séparation des fibroblastes par de rares faisceaux de collagène dans les échantillons témoin et Panthénol. Le groupe traité par Hypericum a montré une augmentation marquée de la densité de collagène avec une accumulation diffuse de faisceaux de collagène colorés en bleu.
Au jour 14, le groupe traité par Panthénol a montré une prolifération et une migration des kératinocytes basaux au bord de la plaie associées à un œdème étendu, ainsi qu’une prolifération fibroblastique avec la formation de fibres de collagène. Les groupes traités par le gel niosomal à 1,5 % de NaCMC ont révélé une cicatrisation améliorée, marquée par un épiderme hyperplasique remarquable aux bords de la plaie et la formation de fibres de collagène bien organisées apparaissant en bleu dans les coupes colorées au trichrome de Masson (Figure 5(B)). Au 21e jour, le groupe témoin a montré une fermeture de la brèche de la plaie avec une différenciation épidermique atténuée, restreinte à la couche basale, et les annexes cutanées n’étaient pas restaurées. Le groupe traité par Panthénol a montré plus ou moins la même situation avec une ré-épithélialisation et une formation de kératine (Figure 5(C)). Les groupes traités par le gel niosomal à 1,5 % de NaCMC ont montré une ré-épithélialisation complète, la formation de nouvelles fibres de matrice et une réduction significative de la taille de la plaie, ainsi qu’une restauration des annexes cutanées et l’apparition de follicules pileux, marquant la fin du processus de cicatrisation (Figure 5(C)).
Hypericum perforatum a été traditionnellement utilisé pour des applications externes et plusieurs études ont rapporté son usage comme antimicrobien, antioxydant, anti-inflammatoire, anticancéreux et pour la cicatrisation (Wölfle et al., 2014). Il est généralement préparé sous forme d’huiles (Oleum Hyperici) (Pharmacopée allemande, 2014) et de teintures. Les préparations à base d’huile ont été largement étudiées, mais la littérature manque de détails sur la teneur en constituants actifs et la formulation des préparations hydroalcooliques (EMEA, 2009). De plus, il existe une grande variabilité dans les concentrations de ces constituants actifs selon l’origine géographique de la plante, la période de récolte et la méthode d’extraction (Isacchi et al., 2007). Par conséquent, afin d’assurer la reproductibilité des expériences in vivo, une description détaillée de la méthode d’extraction doit être fournie et une empreinte chromatographique des extraits utilisés doit être établie. Il a été précédemment rapporté qu’au moins 60 % d’éthanol/H₂O est nécessaire pour obtenir à la fois l’hyperforine très lipophile et les composés polyphénoliques hydrophiles (Wölfle et al., 2014). C’est pourquoi un extrait éthanolique à 80 % a été utilisé dans notre étude après avoir prouvé qu’il produisait un rendement plus élevé à 70 °C qu’à température ambiante, puis l’extrait méthanolique à 80 % (Figure 1S). De plus, une analyse phytochimique quantitative des quatre extraits a révélé que l’extrait éthanolique à 80 % contenait les concentrations les plus élevées de constituants actifs (Figure 2(A)). Il a donc été préparé à l’échelle pilote à l’aide du DIG-MAZ, qui a fourni une méthode d’extraction bien décrite assurant la reproductibilité de l’extrait (HE). Une empreinte chromatographique HPLC-DAD de HE a été établie (Figure 2(B)) et l’extrait a été standardisé pour contenir des concentrations spécifiques des constituants actifs requis : hyperforine, hypéricine et composés polyphénoliques. Plusieurs formulations topiques d’Hypericum ont été développées sous forme de gels, pommades, crèmes et lotions, pour l’inflammation et la dermatite atopique ; elles étaient toutefois standardisées soit sur l’hyperforine et l’hypéricine, soit sur l’hyperforine seule (Schempp et al., 2000 ; Schempp et al., 2003). Un profil chromatographique holistique de l’extrait d’Hypericum a été établi pour la première fois dans une étude in vivo (Figure 2(B)), ce qui assure la reproductibilité des résultats, l’efficacité de l’extrait et une meilleure capacité à surveiller la stabilité de l’extrait. L’hyperforine, très lipophile, est connue pour ses activités antimicrobienne, anti-inflammatoire, antioxydante et de stimulation des kératinocytes. L’hypéricine lipophile est connue pour son activité antimicrobienne. Les flavonoïdes et polyphénols hydrophiles sont de puissants antioxydants, et l’acide chlorogénique favorise l’épithélialisation et la prolifération cellulaire (Cecchini et al., 2007 ; Koeberle et al., 2011 ; Rainha et al., 2011 ; Chen et al., 2013). Par conséquent, l’extrait HE a été standardisé pour contenir 3,4 ± 4 ; 1,1 ± 3 ; 0,5 ± 2 et 2,8 ± 2 % p/p de rutine, d’acide chlorogénique, de quercitrine et d’hyperforine, respectivement, et 0,51 ± 3 % p/p d’hypéricines totales. HE a été incorporé pour la première fois dans un système niosomal de délivrance de médicament capable d’encapsuler à la fois les constituants actifs lipophiles et hydrophiles (Tableau 1(B)). Plusieurs systèmes niosomaux ont été préparés, le niosome F1 (Span 20:cholestérol, 1:1) montrant, en valeur relative, la teneur la plus élevée en constituants actifs et 80 % d’encapsulation du médicament calculée en hypéricines totales. Les micrographies MET de la formule niosomale optimale (F1) (Figure 3) ont confirmé la formation de vésicules niosomales à membrane en bicouche. Les gels niosomaux ont été préparés avec différents polymères, le HEC 3 % et le NaCMC 1,5 % ayant été choisis en raison du taux élevé de libération du médicament et des caractères physiques et rhéologiques appropriés de leurs hydrogels. Le gel niosomal préparé avec le NaCMC 1,5 % a été testé dans les expériences de cicatrisation in vivo sur les chiens en raison de son taux de libération du médicament (78,8 ± 1 % après 180 min) et de sa plus faible teneur en polymère. Il a provoqué une diminution significative du nombre de cellules inflammatoires au jour 7 ainsi qu’une fermeture significative de la plaie après 14 jours par rapport aux groupes témoin et traité par Panthénol®. Les groupes traités par le gel niosomal à 1,5 % de NaCMC ont amélioré la cicatrisation, marquée par un épiderme hyperplasique remarquable aux bords de la plaie et la formation de fibres de collagène bien organisées au jour 14 (Figure 5(B)). Il a montré une ré-épithélialisation complète, une réduction significative de la taille de la plaie ainsi qu’une restauration des annexes cutanées et l’apparition de follicules pileux, ce qui a marqué la fin du processus de cicatrisation (Figure 5(C)).
La présente étude a fourni une méthode d’extraction bien décrite à l’échelle pilote de H. perforatum utilisant l’éthanol 80 % à 70 °C. Un profil chromatographique holistique de l’extrait a été établi et standardisé pour la première fois sur ses constituants actifs connus, contribuant à la cicatrisation (phloroglucinols, naphtodianthrones, flavonoïdes et polyphénols). L’extrait standardisé a été incorporé dans un gel topique niosomal capable d’encapsuler des concentrations raisonnables de constituants actifs à la fois lipophiles et hydrophiles. Le gel niosomal à 1,5 % de NaCMC préparé a montré des effets significativement élevés dans le traitement des plaies de 16 chiens bâtards adultes, par rapport au Panthénol, confirmant l’activité synergique des hyperforines, hypéricines, flavonoïdes et composés polyphénoliques. Des études supplémentaires sont nécessaires pour tester la stabilité des gels niosomaux.
Les auteurs remercient le Dr Azza Hassan, Département de pathologie, Faculté de médecine vétérinaire, Université du Caire, pour son aide dans la réalisation de l’étude in vivo. Les auteurs sont également reconnaissants au Dr Herbert Böchzelt, Joanneum Research, Graz, Autriche, pour avoir mis à disposition les installations d’extraction.
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Encart — synthèse : Formulation niosomale (vésicules non ioniques Span 20/cholestérol 1:1, ~490 nm, potentiel zêta −41 mV) chargée d’un extrait hydroéthanolique 80 % de millepertuis, standardisé (rutine, acide chlorogénique, quercitrine, hyperforine, hypéricines totales) et mis en gel à 1,5 % de NaCMC. Effet cutané (cicatrisation) : appliqué sur plaies de pleine épaisseur chez le chien, le gel réduit fortement l’inflammation à J7 (18,4 vs 61–68 cellules), accélère l’angiogenèse et la synthèse de collagène, et donne à J21 une ré-épithélialisation complète avec restauration des annexes et follicules pileux — supérieur au témoin et à la crème Panthénol® 2 %. Niveau de preuve : étude expérimentale in vivo, modèle animal (16 chiens, évaluation en aveugle), sans essai clinique humain ; démonstration d’un principe galénique et d’un effet cicatrisant du complexe hyperforine + hypéricines + flavonoïdes/polyphénols agissant en synergie.
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