Référence : Molecules 2024. — PMC11676637 · DOI 10.3390/molecules29245823 Type : étude in vitro · Plante : Origan vulgaire · Propriété → Antimicrobien Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
La gestion durable de la sécurité des produits agroalimentaires constitue un défi majeur nécessitant des actions de grande ampleur pour garantir la sécurité alimentaire et la santé des consommateurs. La recherche de solutions respectueuses de l’environnement pouvant constituer une alternative aux composés chimiques couramment utilisés dans l’agriculture et les industries alimentaires représente l’un des problèmes les plus importants. Une solution réside dans les extraits végétaux contenant divers composés biologiquement actifs et présentant une activité antimicrobienne. Cette étude vise à déterminer l’activité biologique d’extraits obtenus à partir de feuilles d’Origanum vulgare L. par extraction au CO₂ supercritique (SC-CO₂), dans différentes conditions et avec différentes compositions réactionnelles. Les études in vitro ont révélé une activité antimicrobienne contre certaines bactéries, notamment Salmonella Enteritidis, Listeria monocytogenes et Staphylococcus aureus, ainsi que contre des champignons (Fusarium spp.), dépendant principalement de l’espèce microbienne ; les conditions d’extraction ont néanmoins également influencé ces propriétés. Les observations réalisées par microscopie optique et par fluorescence ont montré des modifications de la viabilité et de la morphologie des cellules fongiques. Aucune libération significative de matériel intracellulaire n’a été observée d’après l’analyse des concentrations en sodium et en potassium par ICP-MS. Les propriétés antibiofilm de l’extrait obtenu à 40 °C ont également été démontrées contre S. aureus, P. aeruginosa et L. monocytogenes, avec une activité plus forte contre les bactéries à Gram positif. La caractérisation phytochimique des extraits a été effectuée au moyen d’un système de chromatographie liquide couplé à un spectromètre de masse Orbitrap (LC/MS), permettant notamment d’identifier des acides phénoliques — protocatéchique, hydroxybenzoïque, caféique et rosmarinique —, des flavonoïdes — lutéoline, naringénine et kaempférol — et des terpénoïdes — acides oléanolique et ursolique.
La gestion durable de la sécurité des produits agroalimentaires constitue aujourd’hui un défi majeur, nécessitant des actions diverses et de grande ampleur afin de garantir la sécurité alimentaire et la santé des consommateurs. Elle implique la nécessité d’appliquer des solutions limitant le développement des micro-organismes pathogènes et leur transfert vers les étapes ultérieures de la chaîne alimentaire. Des mesures doivent être prises dès la culture des plantes au champ, où l’un des principaux problèmes est leur infestation par des champignons pathogènes responsables de plus de 70 % des maladies végétales menaçant la sécurité alimentaire. De plus, de nombreux agents pathogènes fongiques, tels que Fusarium spp., produisent également des mycotoxines qui présentent un risque pour la santé humaine et animale. Aux étapes de la transformation alimentaire, le problème concerne quant à lui les micro-organismes responsables de l’altération des aliments et les bactéries pathogènes telles que Salmonella sp., Listeria monocytogenes et d’autres, qui constituent une menace directe pour la santé des consommateurs. La formation de biofilms est particulièrement problématique, car leur structure complexe et multicouche protège les micro-organismes contre les procédures habituelles de nettoyage et leur permet de survivre dans l’environnement. Cela entraîne une augmentation de la charge microbiologique de l’environnement de transformation des aliments et altère la qualité du produit alimentaire final, provoquant sa détérioration et une réduction de sa durée de conservation, tout en augmentant le risque de propagation de maladies infectieuses d’origine alimentaire.
La solution la plus courante pour limiter la propagation des micro-organismes indésirables consiste à utiliser des substances qui inhibent leur croissance ou détruisent leurs cellules, telles que les fongicides employés pendant la culture ou les désinfectants utilisés dans l’industrie alimentaire. Toutefois, en raison de leur nature, ces substances imposent une forte charge à l’environnement. La recherche de solutions respectueuses de l’environnement, capables de remplacer les produits chimiques couramment utilisés dans l’agriculture et l’industrie alimentaire, constitue donc l’un des problèmes les plus urgents et les plus importants. L’utilisation d’extraits végétaux contenant différents composés biologiquement actifs et présentant une activité antimicrobienne, susceptibles d’être employés à diverses étapes de la chaîne alimentaire, représente une alternative prometteuse aux produits chimiques largement utilisés. Les données de la littérature indiquent que de nombreuses plantes médicinales riches en alcaloïdes, flavonoïdes et composés polyphénoliques possèdent des propriétés antiseptiques, antimicrobiennes et désinfectantes sans effets environnementaux toxiques. Il a par exemple été observé que l’ajout d’ingrédients végétaux, tels que l’huile d’arbre à thé ou l’extrait de feuilles de caféier, à des désinfectants pour les mains ou à des sprays désinfectants inhibait efficacement le virus pendant la pandémie de COVID-19. De nombreux travaux ont également démontré l’effet antifongique de différentes huiles essentielles (HE) ou d’extraits obtenus à partir de plantes telles que l’eucalyptus, l’origan, le giroflier, le cannelier, la citronnelle et bien d’autres, qui inhibent significativement la croissance de champignons pathogènes, notamment d’espèces de Fusarium.
Origanum vulgare L., connu sous le nom d’« origan », est une espèce herbacée de la famille des Lamiaceae, souvent utilisée en médecine traditionnelle pour traiter notamment les maladies associées à l’inflammation, l’asthme, l’indigestion, les douleurs abdominales, la bronchite, la toux et la diarrhée. Plusieurs groupes de plantes sont appelés « origan », notamment l’origan turc (Origanum onites), l’origan espagnol (Coridohymus capitatu), l’origan grec (Origanum vulgare) et l’origan mexicain (Lippia graveolens). L’espèce la mieux étudiée est l’origan grec (Origanum vulgare L.), dont de nombreuses études signalent les activités antibactérienne, antioxydante, antifongique et anti-inflammatoire. Celles-ci sont principalement attribuées à sa forte teneur en composés bioactifs tels que les composés phénoliques, les flavonoïdes, les terpénoïdes et les tanins. Par exemple, l’apigénine, un bioflavonoïde présent dans l’origan, est décrite, outre ses propriétés antioxydantes, comme ayant des effets bénéfiques sur le système immunitaire humain, la glycémie et plusieurs cancers. La lutéoline et le kaempférol, des phytonutriments également observés dans l’origan, ont été étudiés pour leurs propriétés antioxydantes, anticancéreuses et anti-inflammatoires.
La vaste activité biologique de l’origan a suscité un vif intérêt pour l’utilisation de plus en plus répandue de cette plante dans diverses industries et pour les possibilités offertes par les technologies d’extraction modernes et respectueuses de l’environnement. L’étape d’extraction étant d’une importance déterminante pour l’obtention des composés recherchés, le choix et l’optimisation de la méthode d’extraction sont essentiels pour obtenir les précieux composés souhaités. Des méthodes telles que l’extraction par micro-ondes (ME), l’extraction assistée par ultrasons (UAE) et l’extraction par fluide supercritique (SFE) sont de plus en plus utilisées. Par rapport aux méthodes d’extraction traditionnelles, telles que la macération ou la distillation, leur principal avantage réside dans le remplacement des solvants organiques par de l’eau, ce qui permet d’extraire les composés bioactifs tout en limitant le rejet de composés nocifs dans l’environnement. Un autre avantage est la configuration d’extraction séquentielle, qui consiste à réutiliser les résidus solides jusqu’à leur épuisement, permettant ainsi une récupération maximale des substances bioactives. L’extraction au dioxyde de carbone supercritique (SC-CO₂) est la méthode la plus couramment utilisée en SFE, car ce composé est ininflammable et peu coûteux, et sa volatilité à la pression atmosphérique permet d’obtenir, après décompression, des extraits exempts de solvants. Comme l’extraction au SC-CO₂ emploie un solvant apolaire, un modificateur polaire, tel que l’éthanol ou le méthanol, est souvent ajouté afin d’améliorer l’extraction des substances polaires. L’extraction de composés par SFE est utilisée dans de nombreux domaines, notamment pour les lipides, les substances bioactives, les huiles essentielles, les antioxydants, la caféine et les colorants.
Compte tenu de ces données, le présent travail visait à étudier l’activité biologique et la composition d’extraits d’O. vulgare obtenus par extraction au dioxyde de carbone supercritique avec du méthanol comme cosolvant, dans différentes conditions d’extraction. La nouveauté de cette recherche réside dans l’approche globale adoptée pour caractériser les extraits d’origan obtenus par extraction au CO₂ supercritique, comprenant une évaluation étendue de leur activité biologique conjointement à celle de leur composition.
Les recherches menées ont montré que les extraits d’origan au SC-CO₂ testés, obtenus à différentes températures — 40 °C, extrait abrégé OR40 ; 50 °C, extrait abrégé OR50 ; et 60 °C, extrait abrégé OR60 — présentaient une activité antagoniste envers certains champignons du genre Fusarium [ ]. La sensibilité la plus faible aux extraits au SC-CO₂ a été observée pour F. culmorum et F. poae, contre lesquels des valeurs de CMI (concentration minimale inhibitrice) et de CMF (concentration minimale fongicide) de 15,0 mg/mL ont été enregistrées pour tous les extraits. Une activité plus forte des extraits testés a été observée contre F. graminearum et F. avenaceum, avec des valeurs de CMI et de CMF de 7,5 mg/mL, indépendamment des conditions d’extraction. Des différences d’activité antagoniste entre les extraits d’origan testés n’ont été observées que contre F. equiseti : pour l’extrait OR60, les valeurs de CMI et de CMF étaient de 1,90 mg/mL, tandis qu’elles atteignaient 7,5 mg/mL pour les extraits OR40 et OR50. Il peut donc être conclu que l’activité fongistatique des extraits d’origan au SC-CO₂ dépendait principalement de l’espèce fongique, tandis que les conditions d’extraction n’influençaient généralement pas les valeurs de CMI et de CMF.
L’activité fongistatique des extraits d’origan au SC-CO₂ testés a également été confirmée par microscopie à fluorescence, en analysant l’effet des extraits sur du mycélium mature. Les analyses microscopiques ont été réalisées sur F. culmorum et F. graminearum en incubant le mycélium avec les extraits au SC-CO₂ pendant 1 et 2 h. Les résultats sont présentés dans [ ]. D’après les images microscopiques obtenues, il peut être affirmé que les extraits d’origan au SC-CO₂ affectent à la fois la structure et la viabilité des hyphes. Les images microscopiques ont montré une désintégration nette des structures situées à l’intérieur des hyphes fongiques ainsi que des modifications morphologiques, notamment un épaississement et un gonflement. Un gonflement caractéristique a été observé dans les hyphes de F. culmorum, tandis que les cellules de F. graminearum étaient principalement déformées par courbure. De plus, les images obtenues par microscopie à fluorescence [ ], après utilisation des colorants diacétate de fluorescéine (FDA) et iodure de propidium (PI), ont révélé une proportion croissante d’hyphes mortes, colorées en rouge, après incubation du mycélium en présence des extraits d’origan au SC-CO₂ testés, par comparaison avec les échantillons témoins, qui présentaient un nombre plus élevé d’hyphes vivantes colorées en vert. Comme lors des analyses précédentes, aucune différence majeure d’activité fongistatique n’a été observée entre les extraits d’origan au SC-CO₂ selon les conditions d’extraction. La sensibilité des champignons était principalement liée à la durée d’incubation en présence des extraits d’O. vulgare L. testés.
Afin de déterminer le mécanisme préliminaire de l’action antifongique, une tentative d’évaluation de l’intégrité membranaire a été réalisée en mesurant la densité optique (DO) à 260 nm et en déterminant l’efflux de certains constituants intracellulaires, le sodium et le potassium, par spectrométrie de masse avec ionisation par plasma à couplage inductif (ICP-MS). Cette étude a été réalisée avec deux extraits, OR40 et OR60, car l’extrait obtenu à 50 °C ne différait pas d’OR40 quant à son activité biologique. Comme l’indiquent les résultats [ ], l’absorbance a légèrement augmenté au cours des 24 h d’incubation. De même, les concentrations de sodium et de potassium ont augmenté respectivement de 5,7 à 27,3 % pour le Na et de 2,0 à 11,5 % pour le K, selon le type d’extrait et l’espèce fongique.
Les propriétés antibactériennes des extraits d’origan au SC-CO₂ testés ont été déterminées contre huit micro-organismes indicateurs appartenant aux groupes des bactéries à Gram positif et à Gram négatif. Les résultats obtenus montrent que les extraits d’O. vulgare au SC-CO₂ présentaient, comparativement à leur activité fongistatique, une activité antagoniste plus élevée contre les bactéries indicatrices sélectionnées, avec des valeurs de CMI et de CMB (concentration minimale bactéricide) comprises entre 0,25 et 1,0 mg/mL [ ]. Une sensibilité légèrement supérieure aux extraits au SC-CO₂ a été observée chez les bactéries à Gram positif, dont la croissance était inhibée de 90 à 100 % à une concentration d’extrait de 0,25 mg/mL pour OR40 et OR50, ou de 0,5 mg/mL pour OR60. Uniquement contre E. faecalis, l’extrait OR60 au SC-CO₂ a présenté une activité antagoniste plus élevée, avec une CMI de 0,25 mg/mL, que contre les autres micro-organismes. L’analyse des propriétés antibactériennes des extraits d’O. vulgare au SC-CO₂ testés contre les bactéries à Gram négatif a montré que, quelles que soient les conditions d’extraction, les valeurs de CMI étaient de 0,5 mg/mL. Des valeurs plus élevées de CMI/CMB, soit 1,0 mg/mL, n’ont été observées que pour l’extrait OR60 contre C. jejuni et P. aeruginosa.
Il convient de souligner que les différences d’activité antibactérienne entre les extraits, exprimées par les valeurs de CMI, sont faibles et que, d’une manière générale, les valeurs de CMI et de CMB ne diffèrent légèrement selon l’extrait que pour quelques micro-organismes. Cela est probablement lié à la composition des extraits décrite à la section 2.4. Comme l’a montré l’analyse de leur composition, les extraits ne différaient pas substantiellement sur le plan qualitatif, à l’exception de plusieurs composés dont l’intensité du signal, en mode positif, était significativement plus élevée dans l’extrait obtenu à 60 °C [ ].
La détermination de l’activité des extraits d’origan au SC-CO₂ testés dans la prévention de la formation du biofilm bactérien et l’élimination du biofilm mature était importante au regard de l’utilisation potentielle de ces composés dans l’industrie alimentaire. Cette étude a été réalisée contre trois bactéries, P. aeruginosa, L. monocytogenes et S. aureus, qui présentent une forte capacité à former des biofilms dans l’environnement de production. Comme aucune différence majeure d’activité antibactérienne n’a été observée entre les différents extraits au SC-CO₂ testés, seul l’extrait OR40, à trois concentrations, a été utilisé dans l’expérience. Les résultats obtenus [ ] permettent de conclure que le type de micro-organisme indicateur et la concentration de l’extrait OR40 avaient une incidence déterminante sur la formation et l’élimination du biofilm bactérien. Le degré d’inhibition du processus de formation du biofilm dépendait significativement de la concentration d’extrait utilisée. Quel que soit le micro-organisme indicateur, le degré d’inhibition augmentait avec la concentration de l’extrait. L’efficacité d’inhibition de la formation du biofilm variait selon le micro-organisme. L’effet le plus faible a été observé pour P. aeruginosa : à une concentration de 2 × CMI, le degré d’inhibition de la formation du biofilm atteignait 34 %. Une efficacité nettement supérieure a été obtenue pour L. monocytogenes et S. aureus. À une concentration de 2 × CMI, l’extrait OR40 inhibait complètement le processus de formation du biofilm par ces deux micro-organismes. En revanche, à une concentration de 0,25 mg/mL correspondant à la CMI et à 0,5 × CMI, la formation du biofilm était inhibée respectivement de 75 % et 57 % pour L. monocytogenes, et de 84 % et 54 % pour S. aureus.
L’extrait OR40 au SC-CO₂ a démontré sa capacité à éliminer le biofilm mature avec une efficacité comprise entre 18 % et 52 %, selon sa concentration et le type de micro-organisme testé. Le degré d’élimination du biofilm de P. aeruginosa était significativement plus élevé aux concentrations de 0,5 × CMI et 1,0 × CMI, tandis qu’aucune différence significative n’était observée à la concentration la plus faible. Aucune différence significative n’a été mise en évidence entre les effets de l’extrait sur l’élimination des biofilms matures de S. aureus et de L. monocytogenes, mais l’effet de la concentration la plus élevée était significativement supérieur. Les meilleurs résultats ont été observés à une concentration de 2,0 × CMI pour les biofilms de S. aureus et de L. monocytogenes, dont respectivement 52 % et 44 % ont été éliminés. Les résultats obtenus différaient significativement de ceux observés aux concentrations d’extrait plus faibles pour les biofilms de ces souches bactériennes. Aux deux concentrations inférieures testées, soit 0,5 × CMI et 1,0 × CMI, aucune différence statistiquement significative n’a été constatée : l’efficacité d’élimination du biofilm était respectivement de 31 % et 33 % pour L. monocytogenes, et de 18 % et 21 % pour S. aureus. Le biofilm de P. aeruginosa a présenté la sensibilité la plus faible à l’extrait OR40 au SC-CO₂, puisqu’il n’était éliminé qu’à hauteur de 32 % à une concentration de 2,0 × CMI. Aucune différence significative n’a été observée par rapport à la concentration de 1,0 × CMI, pour laquelle l’élimination du biofilm atteignait 28 %.
L’analyse par chromatographie liquide–spectrométrie de masse (LC–MS) des extraits d’Origanum vulgare obtenus à 40 et 60 °C, en modes d’ionisation négatif et positif, ne montre dans la plupart des cas aucune différence entre leurs compositions [ ]. Une différence statistiquement significative (p < 0,05) entre l’extrait obtenu à 60 °C et celui obtenu à 40 °C n’a été démontrée que pour quelques composés, numérotés 10, 18, 21, 33 et 34 [ ].
L’analyse phytochimique des extraits a été effectuée séparément dans les deux modes d’ionisation afin de fournir des données adaptées à une comparaison semi-quantitative et de mettre en évidence les différences de rendement d’extraction de certains constituants dans les différentes conditions de SC-CO₂.
Les résultats [ ] ont révélé la présence de constituants bien décrits de l’origan, notamment des acides phénoliques — acides protocatéchique (2), hydroxybenzoïque (3), caféique (4) et rosmarinique (12) —, des flavonoïdes — lutéoline (17), naringénine (19) et kaempférol (25) — ainsi que des terpénoïdes — acides oléanolique (35) et ursolique (36). De nombreuses caractéristiques moléculaires non identifiées ont également été observées durant l’analyse de l’extrait. Le composé 7 a été identifié comme un monoterpénoïde, le loliolide, précédemment décrit chez Origanum vulgare. Le composé 8 pourrait être provisoirement identifié comme un dérivé de l’acide protocatéchique sur la base de la présence d’ions de m/z 153,020 et 109,030 dans le spectre de fragmentation. Le composé 16 a été provisoirement identifié comme l’ériodictyol, un flavonoïde précédemment décrit dans d’autres plantes de la famille des Lamiaceae. D’après sa fragmentation, le composé 11 pourrait être un isomère structural du composé 16, puisque des ions-fragments similaires de m/z 269,050, 151,006, 125,027 et 109,031 ont été détectés. Bien qu’ils n’aient pas été identifiés, les composés 28 et 30 sont probablement des isomères structuraux, car ils partagent des ions-fragments similaires de m/z 344,089 et 326,079 pour le composé 28, ou 326,066 pour le composé 30. Une relation semblable existe entre les composés 31 et 32, qui présentent des signaux proches issus d’ions pseudomoléculaires — m/z 293,21205 pour le composé 31 et 293,21210 pour le composé 32 en mode négatif, et m/z 277,21425 pour le composé 31 et 277,21470 pour le composé 32 en mode positif — ainsi que dans leurs spectres de fragmentation. Des listes complètes des ions-fragments ont été incluses dans [ ] afin de permettre une comparaison et une consultation aisées, en particulier pour les constituants non identifiés.
À l’ère des objectifs de développement durable et des préoccupations croissantes concernant l’environnement ainsi que le bien-être humain et animal, une attention de plus en plus importante est accordée à la recherche de solutions respectueuses de l’environnement dans différents domaines, notamment celui des substances antimicrobiennes, qui sont utilisées de manière intensive dans la production végétale et la transformation des aliments. Le présent travail démontre les possibilités d’utilisation des extraits d’O. vulgare au CO₂ comme composés antimicrobiens ou antibiofilm à différentes étapes de la chaîne alimentaire. Il convient de souligner que, bien que les données consacrées aux extraits au CO₂ soient de plus en plus nombreuses, le nombre d’études globales examinant leur vaste activité biologique conjointement à leur composition et à différentes conditions d’extraction reste limité. En outre, les auteurs utilisent des conditions d’extraction différentes, de sorte que les résultats ne sont pas toujours comparables.
Les données obtenues dans la présente étude indiquent que les températures d’extraction les plus basses, 40 et 50 °C, ont conféré aux extraits d’origan au SC-CO₂ des propriétés antibactériennes supérieures contre S. aureus, M. luteus, E. faecalis et C. jejuni, tandis que cet effet n’a pas été observé pour les autres bactéries indicatrices. Aucune relation de ce type n’a été observée pour les champignons indicateurs. En raison de sa popularité et de ses propriétés, l’origan est assez fréquemment utilisé dans la recherche ; toutefois, les résultats relatifs à ses propriétés antimicrobiennes rapportés dans la littérature diffèrent entre eux et de ceux obtenus dans cette étude. Santoyo et al. (2006) ont également utilisé la SFE pour obtenir des extraits d’O. vulgare L. selon différents paramètres de procédé, puis ont déterminé leurs propriétés antimicrobiennes. Les auteurs ont observé une activité antibactérienne de toutes les fractions extraites contre S. aureus, B. subtilis, E. coli et P. aeruginosa, ainsi que des propriétés antifongiques contre Aspergillus niger et Candida albicans. La fraction d’origan la plus active a toutefois été obtenue avec 7 % d’éthanol, à 150 bar et 40 °C. Le micro-organisme testé le plus sensible était C. albicans, tandis qu’A. niger était le moins sensible. Karakaya et al. (2011) ont étudié les propriétés antioxydantes et antibactériennes d’extraits au SC-CO₂ obtenus à 40 °C et sous une pression de 105 bar à partir d’origan (Origanum vulgare ssp. hirtum). Cependant, aucun des extraits SFE n’a affecté la croissance des souches bactériennes testées : L. monocytogenes, S. aureus, E. coli et S. typhimurium. Les auteurs ont estimé que la faible quantité de composés oxygénés dans l’extrait SFE expliquait l’absence de propriétés antibactériennes. Cela s’explique par le fait que les constituants phénoliques des extraits présentent l’activité antimicrobienne la plus forte, suivis des aldéhydes, des cétones et des alcools. Il convient néanmoins de noter que la teneur en composés polyphénoliques ne reflète pas entièrement le profil des composés végétaux dotés d’une activité antimicrobienne, lequel est influencé par la présence d’autres substances telles que les alcaloïdes, les coumarines, les terpènes, les aldéhydes, les caroténoïdes, le carvacrol ou les composés soufrés. D’autres auteurs confirment également l’activité antimicrobienne d’extraits SFE issus de différentes plantes, en soulignant souvent que cette activité dépend des conditions d’extraction. Il peut donc être affirmé qu’une température d’extraction au SC-CO₂ plus basse peut conférer aux extraits des propriétés antimicrobiennes supérieures ; leur activité dépend toutefois des techniques d’extraction utilisées, des différents paramètres du procédé, de la concentration des substances actives et, enfin, des souches microbiennes testées.
Les données de la littérature confirment la capacité des extraits végétaux à inhiber la formation des biofilms bactériens. Il convient de mentionner que les bactéries présentent des capacités différentes à former des biofilms. Cette aptitude est principalement déterminée par la quantité d’EPS produite, c’est-à-dire par les composés responsables de l’adhésion des cellules bactériennes à la surface colonisée. Les bactéries B. cereus, C. jejuni, E. coli, L. monocytogenes, S. enterica, S. aureus et P. aeruginosa sont le plus souvent utilisées comme micro-organismes modèles dans les études sur les biofilms, en raison de leur capacité démontrée à former de telles structures sur différentes surfaces, y compris dans l’industrie alimentaire. Les résultats relatifs à l’élimination du biofilm mature par l’extrait OR40 au SC-CO₂ indiquaient une activité modérée, qui pourrait être liée à la structure particulière des biofilms bactériens, responsable de leur résistance à différents types d’agents nettoyants et désinfectants. En raison des différences entre les approches méthodologiques des auteurs, la comparaison des résultats s’est fondée sur le pourcentage d’inhibition du biofilm à la concentration testée de 1 × CMI, quelle que soit la valeur de CMI déterminée par l’auteur de l’étude. Bazargani et Rohloff (2016) ont constaté que la concentration correspondant à la CMI des huiles essentielles d’origan testées, soit 4 mg/mL, inhibait de plus de 50 % la formation du biofilm de S. aureus. En comparaison, les résultats obtenus par Vidaković et al. (2023) indiquent qu’un extrait d’origan ayant une CMI comprise entre 0,09 et 0,72 µL/mL inhibait la formation du biofilm de L. monocytogenes dans une proportion de 42 à 62 %, selon le milieu et la concentration des extraits. Ben Abdallah, Lagha et Gaber (2020) ont démontré la capacité de l’huile d’origan à détruire de 60 à 76 % du biofilm mature de S. aureus à des concentrations supérieures à 3,125 mg/mL. L’efficacité d’élimination du biofilm mature était inférieure à l’efficacité d’inhibition de sa formation. Cette plus faible efficacité d’élimination du biofilm par rapport à son inhibition au stade de sa formation est directement liée à la complexité de sa structure adhésive multicouche, dont la matrice protège les cellules qui s’y trouvent en entravant la pénétration des substances actives. Bien qu’il ait été démontré que les substances végétales déstabilisent efficacement les structures des biofilms en raison de leur capacité à diffuser à l’intérieur de la matrice polysaccharidique, ce qui se traduit par une forte activité antimicrobienne intrinsèque, les résultats indiquent que les structures matures des biofilms de bactéries à Gram négatif sont fortement résistantes à l’action de certains extraits végétaux.
De nombreuses études indiquent que les extraits végétaux peuvent détruire l’intégrité de la paroi cellulaire. Dans cette étude, l’effet des extraits obtenus sur la morphologie cellulaire et la continuité de la paroi cellulaire a donc été évalué à partir des champignons F. culmorum et F. graminearum. Cette étude a montré que les extraits affectent fortement la morphologie cellulaire et entraînent également la destruction de la paroi des cellules fongiques, comme en témoignent le changement de couleur des cellules observé au microscope à fluorescence et l’efflux de substances intracellulaires. Toutefois, des modifications aussi fortes que celles observées par certains auteurs ayant appliqué un traitement n’ont pas été relevées. Helal et al. ont observé l’effet de l’huile essentielle de Cymbopogon citratus sur la désorganisation de la membrane cellulaire et la fuite de constituants intracellulaires. De même, Zhang et al. ont décrit la désorganisation de Botrytis cinerea, accompagnée de modifications morphologiques des cellules, notamment d’une déformation et d’une détérioration des hyphes et des conidies.
Outre l’activité biologique des extraits testés, leur composition a été déterminée. L’origan est présent presque partout dans le monde, mais il est principalement associé à la région méditerranéenne ; certains travaux ont donc caractérisé la composition de ses extraits selon le type d’extraction. Les huiles essentielles riches en constituants tels que le carvacrol et le thymol, ainsi que le p-cymène, le γ-terpinène, le caryophyllène, le spathulénol et le germacrène D, sont responsables de l’arôme caractéristique et des propriétés biologiques de l’origan ; leurs proportions peuvent varier significativement selon l’origine de la plante et ses conditions de culture. Busatta et al. (2017) ont étudié les profils chimiques d’extraits d’origan obtenus au CO₂ supercritique, à 40 °C et 200 atm, et ont constaté que l’hydrate de cis-sabinène était le principal composé obtenu. Il a été établi que la quantité de monoterpènes oxygénés dans l’extrait d’origan obtenu au SC-CO₂ représentait 58 % des composés identifiés. Dans le présent travail, de nombreux constituants bien décrits de l’origan, appartenant aux acides phénoliques, aux flavonoïdes et aux terpénoïdes, ont été observés ; certaines caractéristiques moléculaires non identifiées ont toutefois également été détectées.
Les parties herbacées séchées et broyées d’O. vulgare L. ont été achetées auprès de Dary Natury, un producteur polonais de produits à base de plantes de haute qualité situé dans la voïvodie de Podlachie, aux coordonnées 53°4′10,98 de latitude et 22°58′2,87 de longitude.
L’extrait d’O. vulgare a été obtenu par une technique/procédure d’extraction au CO₂ supercritique, conformément à la méthodologie décrite par Uwineza et al. (2021). Cinq grammes de parties herbacées d’origan séchées et broyées ont été introduits dans une cuve d’extraction de 25 mL, maintenue dans une enceinte à différentes températures — 40, 50 et 60 °C — et sous une pression constante de 250 bar. Le débit de CO₂ a été réglé à 4 mL/min et celui du méthanol pur, d’une pureté de 99,5 % et utilisé comme cosolvant, à 1 mL/min. Le processus d’extraction a démarré automatiquement une fois les conditions établies atteintes et a duré 180 min pour chaque essai expérimental : une première phase dynamique de 45 min, une phase statique de 15 min et une seconde phase dynamique de 120 min. Les extraits d’O. vulgare ont finalement été recueillis dans des flacons placés dans un module de collecte des fractions, puis conservés à −20 °C pour les études ultérieures.
L’acétonitrile et l’eau de qualité MS utilisés pour préparer les phases de LC–MS ont été achetés auprès de Witko, Łódź, Pologne. Les additifs de phase, le formiate d’ammonium (≥97 %) et l’acide formique (98–100 %), de qualité LC–MS, ont été fournis par Chem-Lab, Zedelgem, Belgique. Le méthanol a été acheté auprès de POCh, Gliwice, Pologne. Le diacétate de fluorescéine et l’iodure de propidium ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne. Le dioxyde de carbone de qualité SFE a été acheté auprès d’Air Products Ltd., Poznań, Pologne. Les milieux microbiologiques provenaient de BioMaxima, Lublin, Pologne, et d’A&A Biotechnology, Gdańsk, Pologne. Tous les produits chimiques utilisés dans les études étaient de qualité analytique.
L’activité fongistatique des extraits testés a été déterminée contre cinq champignons filamenteux. Les espèces du genre Fusarium — F. graminearum KZF 1, F. culmorum KZF 5, F. avenaceum KZF 3, F. equiseti KZF 6 et F. poae KZF 181 — provenaient de la collection du Centre de recherche pour l’enregistrement des produits agrochimiques de l’Institut national de recherche sur la protection des végétaux de Poznań, en Pologne. Les champignons filamenteux testés ont été cultivés dans des boîtes de Petri de 55 mm de diamètre, sur gélose dextrosée à la pomme de terre (PDA), à 25 °C pendant 5 à 10 jours. La CMI et la CMF des extraits d’O. vulgare testés ont été déterminées par la méthode de microdilution décrite par Gwiazdowska et al. (2022), avec quelques modifications. Des suspensions d’hyphes et de conidies ont d’abord été préparées dans du bouillon dextrosé à la pomme de terre (PDB) stérile, en mélangeant au milieu le mycélium prélevé dans des cultures matures, afin d’obtenir une concentration cellulaire finale de 10⁶ cellules/mL, déterminée à l’aide d’un hémocytomètre. Des dilutions au demi des extraits ont ensuite été préparées dans du PDB, sur des plaques de microtitration à 96 puits, afin d’obtenir des concentrations finales comprises entre 0,08 et 10 mg/mL. Dans les échantillons témoins, la concentration finale de méthanol a été établie entre 0,2 et 25 %, proportionnellement à sa teneur dans les échantillons. Cent microlitres des solutions microbiennes ont ensuite été ajoutés dans chaque puits. Les plaques de microtitration ont été incubées en conditions aérobies à 25 °C ± 2 °C pendant 5 à 10 jours. Les milieux de culture contenant les extraits d’O. vulgare sans inoculum fongique ont servi de témoins négatifs, tandis que les cultures fongiques dépourvues d’extrait ont servi de témoins positifs. Les valeurs de CMI pour les champignons filamenteux ont d’abord été déterminées par évaluation visuelle de leur croissance sur la plaque. La valeur de CMF a été déterminée par inoculation ponctuelle de 10 µL de culture microbienne. Tous les essais ont été réalisés en trois exemplaires.
L’activité antibactérienne des extraits d’O. vulgare a été déterminée contre quatre bactéries à Gram positif — Micrococcus luteus ATCC 10240, Staphylococcus aureus ATCC 33862, Bacillus subtilis ATCC 11774, Enterococcus faecalis ATCC 19433 et Listeria monocytogenes ATCC 19115 — ainsi que contre quatre bactéries à Gram négatif — Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella enterica sérovar Enteritidis ATCC 13076 et Campylobacter jejuni ATCC 33291. Toutes les souches bactériennes ont été achetées auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC) et cultivées sur des milieux liquides ou gélosés : bouillon/gélose nutritifs (NB/NA) pour S. aureus, B. subtilis, E. coli et P. aeruginosa ; bouillon/gélose trypticase-soja (TSB/TSA) pour M. luteus ; et bouillon/gélose cœur-cervelle (BHI) pour E. faecalis, L. monocytogenes, S. Enteritidis et C. jejuni, à 30 °C pour M. luteus et à 37 °C pour les autres bactéries. Avant l’expérience, toutes les bactéries ont été repiquées sur les milieux gélosés appropriés et cultivées pendant 24 h. Des inoculums ont ensuite été préparés dans du bouillon Mueller–Hinton (MHB), avec une densité optique ajustée à l’étalon 0,5 de McFarland. La méthode de microdilution décrite par Gwiazdowska et al. (2022), avec quelques modifications, a été utilisée pour déterminer les valeurs de CMI et de CMB des extraits d’O. vulgare testés. Des dilutions au demi des extraits dans du MHB ont été préparées sur des plaques de microtitration à 96 puits, à des concentrations finales comprises entre 0,04 et 5 mg/mL. Cent microlitres des solutions microbiennes ont ensuite été ajoutés dans chaque puits. Les plaques ont été couvertes et incubées pendant 24 h à 30 ou 37 °C, selon le micro-organisme. Les milieux de culture contenant les extraits d’O. vulgare sans inoculum bactérien ont servi de témoins négatifs, tandis que les cultures bactériennes dépourvues d’extrait ont servi de témoins positifs. Après incubation, la densité optique des échantillons bactériens a été mesurée à une longueur d’onde de 600 nm au moyen d’un lecteur de microplaques BioTek Epoch 2. La CMI a été définie comme la plus faible concentration d’extrait produisant une inhibition de la croissance d’au moins 90 %, tandis que la CMB correspondait à une inhibition de 100 %, d’après les mesures spectrophotométriques réalisées avec le BioTek Epoch 2.
La libération des constituants cellulaires a été déterminée selon la méthode décrite par Paul et al. et Zhang et al., avec quelques modifications. Les mycéliums de F. culmorum et de F. graminearum prélevés sur PDA ont été mis en suspension dans 10 mL d’eau stérile additionnée d’OR40 ou d’OR60 à une concentration égale à 1 × CMI, puis incubés à 24 °C pendant 24 h. Après 2 et 24 h, des échantillons ont été prélevés et centrifugés pendant 2 min à 14 000 × g. Le surnageant a été utilisé pour déterminer l’absorbance à 260 nm.
Les lésions de la membrane cellulaire ont été évaluées en déterminant les concentrations de sodium et de potassium dans le matériel intracellulaire libéré immédiatement après l’application de l’extrait, à 0 h, et après 24 h d’incubation dans du PBS, par spectrométrie de masse avec ionisation par plasma à couplage inductif (ICP-MS), conformément à la norme ISO 17294-2:2023. La limite de détection des éléments déterminés était de 1 µg/mL. Immédiatement avant la mesure, les échantillons ont été centrifugés à 14 000 tr/min pendant 20 min afin d’obtenir un surnageant exempt de résidus cellulaires.
Les propriétés antibiofilm de l’extrait d’O. vulgare ont été étudiées de deux manières : comme agent provoquant et inhibant le processus de formation du biofilm par P. aeruginosa, L. monocytogenes et S. aureus, et, après formation du biofilm, comme agent d’élimination du biofilm mature, conformément à la méthode décrite par Gwiazdowska et al. (2022). L’extrait obtenu à 40 °C a été choisi pour l’expérience en raison des résultats similaires d’activité antimicrobienne des trois extraits testés. La formation du biofilm a été réalisée selon la méthode modifiée de Somrani (2020). Dans un premier temps, des cultures bactériennes standardisées à 10⁶ UFC/mL ont été préparées dans du bouillon nutritif et ajoutées dans chaque puits à raison de 60 µL. Afin de déterminer l’effet des extraits testés sur la capacité à former des biofilms bactériens, 60 µL d’extrait à des concentrations égales à 0,5 CMI, 1 CMI et 2 CMI ont été ajoutés avec l’inoculum dans chaque puits de plaques de microtitration à fond plat comportant 96 puits. Les plaques préparées ont été incubées pendant 24 h à 37 °C, après quoi la suspension a été retirée des puits et ceux-ci ont été rincés trois fois à l’eau stérile afin d’éliminer les cellules non adhérentes et le milieu résiduel. Les plaques de microtitration ont ensuite été séchées à l’air pendant 2 h et le biofilm a été coloré au violet de cristal. L’efficacité d’élimination du biofilm mature par l’extrait testé a été déterminée après formation du biofilm, en introduisant 60 µL d’inoculum bactérien dans chaque puits et en incubant les plaques pendant 24 h à 37 °C. Après incubation, le biofilm a été lavé à l’eau et séché à l’air. Le biofilm ainsi préparé a été exposé à l’extrait par trois lavages avec 125 µL d’extrait à des concentrations égales à 0,5 CMI, 1 CMI et 2 CMI. Après 15 min à température ambiante, soit 25 °C ± 1 °C, l’extrait a été retiré, puis les plaques ont été lavées à l’eau, séchées à l’air pendant 2 h et colorées au violet de cristal. Le méthanol a été utilisé comme témoin négatif.
Dans les deux cas, la biomasse du biofilm a été quantifiée au moyen de la méthode modifiée au violet de cristal mise au point par O’Toole. Cent vingt-cinq microlitres d’une solution de violet de cristal à 0,1 % ont été ajoutés au biofilm formé et séché, puis incubés pendant 15 min ; les plaques ont ensuite été lavées à l’eau et séchées pendant la nuit. Cent vingt-cinq microlitres d’acide acétique à 30 % ont ensuite été introduits dans les puits et laissés pendant 10 à 15 min à température ambiante, soit 25 °C ± 1 °C. La solution de chaque puits a été transférée dans une nouvelle plaque de microtitration et la densité optique a été analysée à une longueur d’onde de 550 nm au moyen d’un lecteur de microplaques BioTek Epoch 2. Une solution d’acide acétique à 30 % dans l’eau a été utilisée comme blanc. Toutes les expériences ont été menées en trois répétitions parallèles. Les résultats obtenus ont été exprimés en pourcentage d’inhibition de la formation du biofilm.
Les observations microscopiques ont été réalisées sur les champignons sélectionnés, F. culmorum et F. graminearum. Après culture dans du PDB pendant 5 jours à 25 °C, les mycéliums des champignons testés ont été prélevés à la surface du milieu et mis en suspension dans 1 mL d’eau stérile additionnée d’extraits d’O. vulgare à une concentration égale à 1 × CMI, pendant 1 ou 2 h d’incubation. Les échantillons ont été déposés sur des lames de verre et photographiés avec un microscope optique Olympus BX53, Olympus Corporation, Tokyo, Japon, à un grossissement de 400×. Des échantillons fongiques traités avec de l’eau stérile ont servi de témoins. Chaque essai a été répété trois fois.
Les sondes fluorescentes diacétate de fluorescéine (FDA) et iodure de propidium (PI), provenant de Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne, ont été utilisées afin d’évaluer la viabilité des champignons traités avec les extraits d’O. vulgare. La procédure de coloration reposait sur la méthode décrite par Wang et al. (2022) et Gwiazdowska et al. (2022). Une solution mère de FDA à 1 mg/mL dans l’acétone et une solution mère de PI à 1 mg/mL dans l’eau distillée ont été préparées et conservées au réfrigérateur. Les souches testées, F. culmorum et F. graminearum, ont été préparées et incubées comme décrit à la section 4.8. Vingt-cinq microlitres de FDA et 5 µL de PI ont ensuite été ajoutés aux échantillons, qui ont été incubés avec les colorants fluorescents pendant 30 min à 30 °C. La solution de coloration a été éliminée par centrifugation et le culot cellulaire a été transféré sur des lames de verre, puis examiné au microscope à fluorescence Olympus BX53, Olympus Corporation, Tokyo, Japon, équipé de filtres spécifiques pour les longueurs d’onde considérées — excitation/émission de la FDA : 485/530 ; excitation/émission du PI : 538/617. Des échantillons fongiques traités avec de l’eau stérile ont servi de témoins.
Pour le criblage analytique, une colonne C18 Cortecs de 100 mm × 2,1 mm × 1,6 µm, Waters, Milford, Massachusetts, États-Unis, a été utilisée. La phase mobile A était constituée d’eau contenant 0,1 % d’acide formique et 5 mM de formiate d’ammonium, tandis que la phase mobile B était constituée d’acétonitrile et d’eau dans un rapport 80:20, avec 0,1 % d’acide formique et 5 mM de formiate d’ammonium. Le programme de gradient était le suivant : de 0 à 3,5 min, 0 % de B ; de 3,5 à 16 min, 0 à 26 % de B ; de 16 à 26,5 min, 26 à 100 % de B ; et de 26,5 à 28,5 min, 100 % de B. Le débit était de 0,3 mL/min. La température de l’enceinte de la colonne était de 45 °C. Avant l’injection, les échantillons ont été filtrés à l’aide de filtres seringues en nylon de 0,22 µm. Le volume d’injection était de 2 µL. Les analyses ont été réalisées au moyen d’un système Vanquish UHPLC couplé à un spectromètre de masse Orbitrap Exploris 120, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis. L’échantillon blanc, constitué de MeOH aqueux à 50 %, a été analysé afin de préparer la liste d’exclusion et d’augmenter la quantité de données MS2 obtenues à partir des échantillons expérimentaux. Les extraits obtenus à 40 et 60 °C ont été analysés séparément dans les deux modes d’ionisation, en trois répétitions, en mode MS1 seul et en mode d’acquisition DDA, avec intégration de la liste d’exclusion dans la méthode. Les paramètres ESI étaient les suivants : tension capillaire de 3,5 kV en mode positif et 2 kV en mode négatif ; débit du gaz de gaine de 48 UA ; gaz auxiliaire de 11 UA ; gaz de balayage de 2 UA ; température du tube de transfert des ions de 320 °C ; et température du vaporisateur de 350 °C. Les paramètres d’acquisition étaient les suivants : résolution MS1 de 120 000 ; résolution MS2 de 15 000 ; plage de balayage m/z de 100 à 1 500 ; acquisition des données en mode profil ; énergie de collision HCD normalisée à 30 %. Les données ont été traitées avec Compound Discoverer 3.3, Thermo Scientific, Austin, Texas, États-Unis. Le flux de travail prédéfini de métabolomique avec identification a été utilisé après modification, en incluant la recherche dans les bibliothèques GNPS et mzCloud. MZmine 4.3 a été utilisé pour la visualisation et l’inspection des données.
Les résultats sont présentés sous la forme de la moyenne arithmétique ± écart-type de trois répétitions parallèles. Certains résultats ont en outre été évalués par analyse de variance à un facteur (ANOVA), au moyen du test de Tukey, avec un seuil de significativité fixé à p < 0,05. Les logiciels Microsoft Excel® et IBM SPSS Statistics 29 (PS IMAGO PRO 9.0) ont été utilisés pour toutes les analyses statistiques.
Le développement des recherches consacrées aux substances antimicrobiennes respectueuses de l’environnement attire de plus en plus l’attention sur les méthodes modernes d’extraction, telles que l’extraction au CO₂ supercritique. Les résultats obtenus dans cette étude ont montré le potentiel significatif des extraits d’origan obtenus par extraction au SC-CO₂ contre un large spectre de micro-organismes, comprenant à la fois des bactéries et des champignons. Malgré de légères différences dans l’étendue de l’activité biologique, les résultats les plus prometteurs ont été obtenus avec l’extrait préparé à 40 °C. Cela ouvre d’importantes possibilités d’utilisation à différentes étapes de la chaîne alimentaire, tant lors de la culture des plantes que dans l’industrie alimentaire. En conséquence, les extraits d’O. vulgare L. au SC-CO₂ présentent un potentiel prometteur pour leur incorporation dans des produits alimentaires et leur utilisation dans une agriculture durable nécessitant un additif antimicrobien comme alternative sûre aux antimicrobiens synthétiques. De plus, le procédé SFE repose sur l’emploi d’une technologie respectueuse de l’environnement. Il convient de souligner que la méthode d’obtention des extraits comme l’étendue de leur caractérisation apportent un élément de nouveauté scientifique, car, à la connaissance des auteurs, il existe peu d’études similaires.
Cette étude in vitro a montré que des extraits de feuilles d’Origanum vulgare L. obtenus au SC-CO₂ à 40, 50 et 60 °C présentaient une activité contre Fusarium graminearum, F. culmorum, F. avenaceum, F. equiseti et F. poae avec des CMI/CMF de 1,90 à 15,0 mg/mL, ainsi que contre les bactéries testées, dont S. aureus, L. monocytogenes, S. Enteritidis et P. aeruginosa, avec des CMI/CMB de 0,25 à 1,0 mg/mL ; l’extrait OR40 inhibait complètement à 2 × CMI la formation des biofilms de S. aureus et de L. monocytogenes, contre 34 % pour P. aeruginosa, et éliminait respectivement 52 %, 44 % et 32 % de leurs biofilms matures, résultats constituant uniquement une preuve expérimentale in vitro sans évaluation clinique.
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