Référence : Molecules 2018. — PMID 30314325 · DOI 10.3390/molecules23102605 Type : etude in vitro · Plante : Paquerette · Propriété → Metabolisme & glycemie Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale, section par section ; figures/tableaux « [ ] ». Appels [n] omis.
Le diabète sucré (DS) et les maladies cardiovasculaires qui en découlent entraînent chaque année des millions de décès dans le monde ; 90 % des personnes atteintes de DS sont classées comme patients diabétiques de type 2 (DT2). Le DT2 est lié à une résistance à l’insuline et à une perte de sensibilité à l’insuline. Il conduit à une réduction de la captation du glucose médiée par le transporteur de glucose 4 (GLUT4) dans le muscle et le tissu adipeux, et finalement à une hyperglycémie. À l’aide d’un test de criblage fondé sur la microscopie de fluorescence, nous avons recherché des extraits végétaux qui induisent la translocation de GLUT4 en l’absence d’insuline, et nous avons confirmé leur activité chez des embryons de poulet. Nous avons constaté que les extraits préparés à partir de Bellis perennis (pâquerette commune) sont des inducteurs efficaces de la translocation de GLUT4 dans le système cellulaire in vitro utilisé. De plus, ces extraits ont également conduit à une réduction de la glycémie chez des embryons de poulet (in ovo), confirmant leur activité dans un organisme vivant. À l’aide d’une analyse par chromatographie liquide haute performance (CLHP), nous avons identifié et quantifié de nombreux composés polyphénoliques, dont des glycosides d’apigénine, la quercitrine et l’acide chlorogénique, qui contribuent potentiellement à l’induction de la translocation de GLUT4. En conclusion, les extraits de Bellis perennis réduisent la glycémie et constituent donc des candidats appropriés pour une application dans des compléments alimentaires destinés à la prévention et à la thérapie d’accompagnement du DT2.
Le diabète sucré est un groupe de maladies métaboliques conduisant à une hyperglycémie. Les personnes atteintes de diabète de type 2 (DT2) représentent le principal groupe de patients diabétiques (90 %) dans le monde. La prévalence mondiale du diabète a augmenté de manière significative au cours des dernières décennies, avec plus de 400 millions de personnes touchées en 2014. Le diabète a causé 1,5 million de décès en 2012 et 2,2 millions de décès supplémentaires en augmentant les risques de maladies cardiovasculaires et d’autres maladies. Au-delà des problèmes de santé, le diabète menace les économies de toutes les nations. Les coûts mondiaux absolus du diabète et de ses conséquences sont importants et augmenteront substantiellement d’ici 2030 : l’augmentation des coûts en part du produit intérieur brut mondial devrait passer de 1,8 % en 2015 à un maximum de 2,2 % d’ici 2030.
Les principales caractéristiques du DT2 sont l’hyperglycémie, la résistance à l’insuline et l’obésité. De plus, le DT2 est également associé à une hyperlipidémie et à une hypertension. Cette combinaison est connue sous le nom de syndrome métabolique et constitue un facteur de risque élevé de maladies cardiovasculaires. Pour cette raison, il existe une forte demande d’approches pour prévenir et traiter les problèmes de santé associés au DT2. La pharmacothérapie hypoglycémiante comprend des sensibilisateurs à l’insuline tels que la glitazone, des inhibiteurs de la néoglucogenèse hépatique tels que la metformine, ou des inhibiteurs du co-transporteur rénal sodium-glucose (SGLT1/2) tels que la dapagliflozine. Cependant, l’application de ces médicaments est associée à des effets secondaires graves, notamment diarrhée, nausées, douleurs abdominales, œdème, insuffisance cardiaque congestive, glycosurie suivie d’infections des voies urinaires, et éventuellement cancer de la vessie.
De nombreuses plantes consommées comme nutraceutiques ou en médecine traditionnelle chinoise contiennent des ingrédients actifs, appelés phytochimiques, qui possèdent des propriétés antidiabétiques potentielles. Ces effets reposent sur la modulation de diverses voies cellulaires et physiologiques, telles que l’augmentation de la sensibilité à l’insuline, l’inhibition de l’absorption et du métabolisme des lipides, ou l’augmentation de la captation du glucose dans le muscle et le tissu adipeux. De plus, l’inhibition de l’absorption intestinale du glucose, principalement facilitée par le co-transporteur sodium-dépendant du glucose 1 (SGLT1) et le transporteur de glucose 2 (GLUT2), représente une alternative attractive pour la prévention d’une glycémie élevée. Par exemple, nous avons récemment montré que des extraits préparés à partir de goyave (Psidium guajava) inhibent efficacement l’absorption intestinale du glucose.
Comme rapporté précédemment, notre laboratoire vise à identifier et à caractériser des composés phytochimiques, appelés insulinomimétiques, qui induisent la captation du glucose dans le muscle et le tissu adipeux en l’absence d’insuline. Ces composés induisent potentiellement la translocation du transporteur de glucose 4 (GLUT4) des compartiments cytosoliques vers la membrane plasmique, ce qui aboutit finalement à une diminution de la glycémie. Les mécanismes sous-jacents ne sont pas entièrement compris mais, par exemple, il a été montré que certains polyphénols activent la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), ou la phosphatidylinositide 3 (PI3) kinase, dont l’activation entraîne une augmentation de la translocation de GLUT4.
Pour une approche de criblage, nous appliquons un test hautement sensible fondé sur la microscopie de fluorescence afin de quantifier le processus de translocation de GLUT4. Nous utilisons également des approches de chimie expérimentale pour vérifier les effets des candidats positifs présumés et, plus important encore, pour tester leur efficacité in vivo. À cette fin, un test de l’œuf de poule modifié (appelé Gluc-HET), développé dans notre laboratoire sur la base du test bien établi de l’œuf de poule sur membrane chorio-allantoïdienne (HET-CAM), s’est révélé être une stratégie prometteuse. Il est important de noter que les expériences réalisées sur des embryons aviaires non éclos, pendant les deux premiers tiers du développement embryonnaire (qui dure 21 jours), ne sont pas considérées comme des expérimentations animales. Par conséquent, l’approbation d’un comité d’éthique n’est pas requise. Les taux d’insuline sérique ne sont pas détectables avant le 12ᵉ jour de développement, et par conséquent l’interférence entre l’insuline naturellement produite et les composés insulinomimétiques appliqués jusqu’au jour 12 peut être considérée comme non pertinente. Dans l’ensemble, le système Gluc-HET représente un outil précieux pour tester les composés insulinomimétiques dans un organisme vivant.
Nous décrivons ici l’identification et la caractérisation d’extraits préparés à partir de Bellis perennis (pâquerette commune) en tant que mélanges de composés prometteurs qui réduisent efficacement la glycémie in ovo, très probablement par l’induction de la translocation de GLUT4, qui conduit à une captation accrue du glucose depuis la circulation sanguine.
L’insuline humaine, le CaCl₂, le NaCl, le KCl, le MgSO₄, le KH₂PO₄, le tampon phosphate salin (PBS), la solution saline équilibrée de Hank (HBSS), la quercétine, l’acide chlorogénique, l’acide néochlorogénique et l’acide caféique ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Allemagne). La guaijavérine et l’avicularine provenaient de Glentham Life Sciences (Corsham, Royaume-Uni). La rutine, l’hypéroside, l’isoquercitrine et la quercitrine ont été obtenues chez Extrasynthese (Genay CEDEX, France). Pour la préparation des solutions mères, les composés végétaux ont été dissous dans un tampon Krebs Ringer phosphate HEPES (KRPH ; 20 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 136 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1 mM MgSO₄ et 5 mM KH₂PO₄). Une bibliothèque contenant 2300 extraits végétaux hydrosolubles (PECKISH) a été fournie par Frank Döring (Université Christian-Albrechts, Kiel, Allemagne). Le NovoRapid fabriqué par Novo Nordisk a été un don généreux de Daniel Weghuber (Université de médecine Paracelsus, Salzbourg, Autriche). Un mélange de saponines à teneur de 10 % en saponines a été fourni par Delacon Biotechnik GmbH (Steyregg, Autriche). Les inserts Transwell (8,4 mm, traités au collagène, diamètre de pore de 0,4 μm) et les plaques 24 puits ont été obtenus chez Greiner Bio-One (Kremsmünster, Autriche).
Des cellules CHO-K1 exprimant de manière stable le récepteur humain de l’insuline (hIR) et GLUT4-myc-GFP ont été un don généreux de Manoj K. Bhat (National Centre for Cell Science, Université de Pune, Inde). Les cellules ont été maintenues dans un milieu de culture Ham’s F12 supplémenté avec 100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 1 % de G418 et 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) (tous de Life Technologies, Carlsbad, CA, États-Unis). Des cellules humaines Caco-2 ont été obtenues auprès de DSMZ (Braunschweig, Allemagne) et maintenues dans du MEM avec sels d’Earle supplémenté avec 10 % de SVF, 100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 0,1 % de 2-mercaptoéthanol (tous de Life Technologies, Carlsbad, CA, États-Unis). Les cellules ont été cultivées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂.
Les effets cytotoxiques des composés utilisés pour l’étude de l’intégrité de la couche cellulaire ont été évalués à l’aide d’un test de toxicologie in vitro fondé sur la résazurine (Sigma-Aldrich ; Schnelldorf, Allemagne), selon les instructions du fabricant. Brièvement, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits (45 000 cellules par puits), cultivées jusqu’à 90 % de confluence et incubées avec les substances testées pendant 2 h à 37 °C. Les cellules ont été lavées et incubées avec 10 % de résazurine dans le milieu de croissance pendant 2 h. Ensuite, la quantité de la forme réduite de la résazurine (résorufine) a été déterminée à l’aide d’un lecteur de microplaques en mode fluorescence (excitation 544 nm, émission 590 nm ; POLARstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Allemagne). L’analyse des données a été effectuée à l’aide de la suite logicielle OmegaMARS (BMG LABTECH, Ortenberg, Allemagne). Des cellules non traitées cultivées dans les mêmes conditions ont été utilisées pour la normalisation de la viabilité cellulaire. Chaque substance testée a été mesurée en triple.
Pour les mesures de l’intégrité de la couche cellulaire et du transport de sucre, les cellules Caco-2 ont été ensemencées à 1,65 × 10⁵ cellules/insert. La différenciation a été induite le lendemain avec le milieu Entero-STIM Intestinal Epithelium Differentiation Medium (Corning, Wiesbaden, Allemagne) supplémenté avec 100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 0,1 % de MITO + Serum Extender (Corning, Wiesbaden, Allemagne). Le changement quotidien du milieu cellulaire a été suivi de l’expérience au jour 5.
La différenciation de la monocouche a été évaluée en mesurant la résistance électrique transépithéliale (TEER) des monocouches cellulaires. Seuls les inserts Transwell présentant une résistance supérieure à 400 Ω ont été utilisés dans les expériences.
Pour le test de transport du glucose, le milieu a été retiré et les cellules différenciées ont été lavées deux fois avec un tampon HEPES (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO₄, 1,8 mM CaCl₂) et placées dans une nouvelle plaque 12 puits contenant 800 μL de tampon HEPES dans le compartiment basolatéral. 250 μL de solution donneuse constituée de milieu de culture cellulaire avec 13,5 g/L de glucose, 1,0 g/L de xylitol et la substance d’intérêt aux concentrations indiquées ont ensuite été introduits dans le compartiment apical. Ensuite, 50 μL d’échantillons ont été prélevés dans le compartiment basolatéral à divers instants et la TEER a été mesurée pour garantir l’intégrité de la monocouche cellulaire. La teneur en glucose des échantillons a ensuite été analysée par chromatographie liquide haute performance (CLHP). Enfin, 100 μL de solution donneuse du compartiment apical ont été utilisés pour quantifier la concentration de glucose restante.
Des plants frais de Bellis perennis ont été récoltés dans une zone locale et séchés à température ambiante pendant 1 semaine. Le matériel séché a été broyé dans un moulin à café pendant 30 s. Pour la préparation de l’extrait, 3 g de la poudre ont été dissous dans 30 mL d’EtOH (50 %). La solution a été traitée pendant 20 min aux ultrasons, centrifugée et filtrée avec un filtre domestique. L’EtOH a été chassé au N₂ et les résidus ont été à nouveau dilués dans l’eau. Les échantillons ont été conservés à −20 °C.
Les cellules CHO-K1 hIR/GLUT4-myc-GFP ont été cultivées dans des plaques d’imagerie 96 puits (35 000 cellules/puits ; Mobitec, Göttingen, Allemagne) pendant une nuit, comme rapporté précédemment. Le milieu de culture cellulaire a été aspiré et, après lavage des cellules avec du HBSS (VWR, Vienne, Autriche), remplacé par du HBSS (Thermo Fisher, Waltham, MA, États-Unis) pendant 3 h. Les cellules ont été incubées avec de l’insuline ou des extraits de Bellis perennis dissous dans un tampon KRPH et imagées sur un microscope inversé Olympus IX-81 en configuration de réflexion totale interne (TIR) de type objectif, via un objectif Olympus 60× NA = 1,49 Plan-Apochromat comme décrit précédemment. Les plaques 96 puits ont été placées sur une platine x–y (table motorisée CMR-STG-MHIX2 ; Märzhäuser, Wetzlar, Allemagne). Le balayage de zones plus larges a été assuré par un système de maintien de mise au point automatisé guidé par laser (ZDC2). L’émission à 488 nm du laser à diode (Toptica Photonics, Munich, Allemagne) a été utilisée pour imager la fluorescence de la protéine fluorescente verte (GFP). Après filtrage approprié, le signal de fluorescence a été enregistré à l’aide d’une caméra CCD Orca-R2 (Hamamatsu Photonics, Herrsching, Allemagne).
Le test HET-CAM a été utilisé comme rapporté précédemment. Brièvement, les œufs ont été incubés à 38 °C pendant 11 jours. Les œufs ont été retournés automatiquement et constamment, contrôlés pour la fécondation par mirage, et la zone de la chambre à air a été marquée. La coquille a été légèrement percée avec une pince pointue dans cette zone et 300 μL d’une solution tampon (HBSS ou eau) contenant la substance présumée hypoglycémiante ont été ajoutés. Nous avons testé 3 extraits végétaux différents de Bellis perennis provenant d’une bibliothèque d’extraits (PECKISH) ou préparés maison. Le HBSS ou l’eau a été utilisé pour diluer les extraits jusqu’à une concentration finale d’environ 300 mg/L, qui a finalement été appliquée à la seringue dans le compartiment aérien de l’œuf. Les œufs ont été replacés dans l’incubateur pendant 1 et 2 h. Après incubation, la coquille au-dessus de la chambre à air a été soigneusement retirée et la membrane coquillière a été équilibrée avec du PBS. À l’étape suivante, la membrane coquillière a été retirée et la membrane chorio-allantoïdienne a été soigneusement découpée avec des microciseaux. Un vaisseau sanguin approprié a été soigneusement placé sur une bandelette de pH en plastique, séchée par tamponnement au papier filtre avant que le vaisseau ne soit coupé, et le sang qui s’écoulait a été recueilli. La glycémie a été déterminée à l’aide d’un lecteur de glycémie (Accu-Check Performa, Roche Diabetes Care GmbH, Mannheim, Allemagne). Pour chaque instant, au moins 10 œufs fécondés ont été utilisés. Chaque expérience a été répétée au moins trois fois.
Les analyses d’extraits ont été réalisées par chromatographie en phase inverse à l’aide d’un système Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 comprenant une pompe LPG-3400SD avec dégazeur intégré, un passeur d’échantillons refroidi WPS-3000 U(T)SL, un compartiment à colonne à température contrôlée et un détecteur à barrette de diodes (DAD) FLD-34000RS équipé du logiciel Chromeleon, comme décrit récemment. La séparation des analytes a été réalisée sur une colonne Accucore C18 (150 mm × 3,0 mm de diamètre intérieur, taille de particule de 2,6 µm ; Thermo Scientific). La température de la colonne a été réglée à 40 °C et le volume d’injection était de 1 µL. Les longueurs d’onde ultraviolettes (UV) ont été détectées à 260 nm. Les analytes ont été séparés par élution en gradient avec une phase mobile A contenant 0,1 % d’acide formique (AF) dans l’eau et une phase mobile B contenant 0,1 % d’AF dans l’acétonitrile, à un débit de 0,5 mL/min. Les conditions de départ du gradient d’élution étaient de 95 % A et 5 % B. Après 5 min de temps d’équilibrage, la proportion de B a été augmentée à 20 % à 8 min et à 40 % à 12 min, suivie de 60 % B à 15 min et 80 % B à 17 min pendant 3 min. B a été réduit à 5 % à 20 min jusqu’à 25 min.
Des spectres de masse à haute résolution ont été obtenus à l’aide d’un Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL équipé d’une source d’électrospray Ion Max API fonctionnant en mode d’ionisation négative avec les paramètres suivants : température du capillaire, 350 °C ; débit du gaz de gaine, 45 ; débit du gaz auxiliaire, 15 ; tension de source, 3,5 kV ; tension du capillaire, −25 V ; et lentille tubulaire, −90 V. Les séparations ont été réalisées à l’aide d’une colonne Accucore C18 (150 mm × 3,0 mm de diamètre intérieur, taille de particule de 2,6 µm ; Thermo Scientific, dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus). Les polyphénols ont été quantifiés par rapport à des étalons connus lorsqu’ils étaient disponibles, avec des concentrations dans une plage linéaire de 1 à 1000 mg/L.
L’analyse des sucres a été réalisée comme rapporté précédemment avec des modifications mineures. Un système Jasco LC-2000 Plus Series comprenant une pompe analytique avec dégazeur externe, un passeur d’échantillons, un compartiment à colonne à température contrôlée, un détecteur Jasco RI-2031 Plus et un détecteur UV-Vis équipé du logiciel Chrompass (tous de Jasco Corporation, Tokyo, Japon) a été utilisé. L’analyse du glucose et du xylitol a été menée à l’aide du même système CLHP. La séparation a été réalisée sur une colonne Varian Meta Carb 87H (PN A5210, SN 12509907). La température de la colonne a été réglée à 56 °C et l’élution isocratique a été réalisée à 0,8 mL/min. Une phase mobile de 5 mM d’acide sulfurique dans de l’eau bidistillée a été utilisée. La CLHP a été calibrée avec du glucose (allant de 10 à 1000 mg/L) et du xylitol (allant de 5 à 1000 mg/L). La courbe étalon obtenue était linéaire dans cette plage. La limite de détection (LOD) a été définie comme un rapport signal/bruit de 2:1 et la limite de quantification (LOQ) comme 4:1. La LOD était de 2,5 mg/L et la LOQ de 5 mg/L pour le glucose et le xylitol, respectivement. Les données ont été traitées par le logiciel Jasco Chrompass Chromatography System (version 1.7.403.1).
Les enregistrements initiaux d’imagerie ont été assurés par le logiciel Olympus Xcellence RT. L’analyse approfondie pour le calcul de l’intensité de fluorescence dans les cellules individuelles et une comparaison rapide du signal fluorescent dans de nombreuses cellules à différents intervalles de temps a été réalisée à l’aide du cadre logiciel Spotty. Spotty peut être obtenu en ligne à l’adresse http://bioinformatics.fh-hagenberg.at/projects/microprot/ . L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’une ANOVA à deux facteurs et d’un test t non apparié dans Graphpad Prism (version 6.07). Les figures ont été préparées à l’aide de Corel Draw (version X6).
Au cours des deux dernières années, nous avons utilisé un criblage primaire fondé sur la quantification de la translocation de GLUT4 pour identifier des extraits végétaux dotés de propriétés insulinomimétiques. Cette approche a conduit à l’identification de Bellis perennis comme candidat positif potentiel. Nous décrivons ici l’efficacité de divers extraits de Bellis perennis à induire la translocation de GLUT4 des compartiments de stockage cytosoliques vers la membrane plasmique. Tout d’abord, deux extraits identifiés dans la bibliothèque d’extraits PECKISH ont été testés. Un extrait était un mélange de fleurs et de feuilles (4404) et l’autre était produit à partir de fleurs seules (4407). Ensuite, nous avons produit un extrait préparé à partir de fleurs de Bellis perennis récoltées dans une zone locale. Pour les mesures, des cellules CHO-K1 privées de nutriments exprimant de manière stable le récepteur humain de l’insuline et une protéine de fusion GLUT4-myc-GFP ont été incubées avec l’extrait choisi à de faibles concentrations (1 mg/L). Ensuite, l’augmentation du signal GFP dans le champ évanescent, qui est corrélée à la concentration de protéines GLUT4 dans la membrane plasmique, a été déterminée. La figure [ ] indique les effets des trois extraits testés après 10 min d’incubation. Les extraits 4404 et 4407 n’ont conduit qu’à une augmentation modérée du signal GFP d’environ 8 % et environ 5 %, respectivement. Cependant, l’extrait éthanolique préparé maison a entraîné une forte augmentation du signal GFP (environ 35 %). Pour garantir la performance du test, nous avons également traité les cellules avec 100 nM d’insuline humaine ou avec le solvant de l’extrait (tampon KRPH) seul. L’insuline a conduit à une augmentation d’environ 26 %, ce qui est en accord avec des études réalisées précédemment, tandis que l’incubation avec le tampon KRPH n’a pas entraîné d’augmentation significative du signal.
Sur la base de ces résultats, nous avons quantifié l’efficacité des deux extraits de la bibliothèque PECKISH (4404 et 4407) en testant diverses concentrations allant de 0,1 mg/L à 10 mg/L. Comme le montre la figure [ ], nous avons trouvé une relation dose-réponse nette pour les deux extraits, 4404 étant légèrement plus efficace que 4407. Cependant, il n’y a eu aucun effet de 4407 à 0,25 mg/L, tandis que 4404 à la même concentration n’a entraîné qu’une augmentation d’environ 4 %. Dans l’ensemble, les extraits préparés à partir de Bellis perennis sont des inducteurs efficaces de la translocation de GLUT4 en l’absence d’insuline.
Sur la base des résultats obtenus avec notre système in vitro fondé sur les CHO-K1, nous avons décidé de tester l’efficacité des extraits de Bellis perennis in ovo. À cette fin, nous avons appliqué notre test HET-CAM récemment établi. Grâce à cette approche, il est possible de tester si l’application d’un composé ou d’un extrait sélectionné est efficace pour réduire la glycémie dans un organisme vivant. Par conséquent, l’extrait préparé maison ainsi que les deux extraits PECKISH ont été dissous dans un tampon HBSS (300 mg/L). Le NovoRapid, un analogue de l’insuline humaine à action rapide, a été utilisé comme témoin positif (3,3 U/mL) pour prouver la sensibilité à l’insuline. Après incubation avec les extraits pendant 1 et 2 h, la glycémie a été mesurée à l’aide d’un lecteur de glycémie. Comme le montre la figure [ ], les trois extraits ont entraîné une diminution comparable de la glycémie (environ 20 % après 1 h et 30 % après 2 h) et l’effet était statistiquement significatif après 2 h d’incubation. Le traitement au NovoRapid a conduit à une réduction d’environ 16 % après 1 h et à un effet significatif d’environ 33 % après 2 h.
Nous avons récemment montré que le tampon HBSS seul entraîne également une légère diminution de la glycémie. De plus, l’eau bidistillée s’est révélée être un meilleur solvant pour la performance du test. Par conséquent, nous avons répété les expériences décrites précédemment dans ces conditions. Comme le montre la figure [ ], l’eau bidistillée seule a entraîné une réduction non significative d’environ 3 %, confirmant son applicabilité préférentielle. De plus, les trois extraits de Bellis perennis ont été trouvés capables de réduire significativement la glycémie aux deux instants avec une efficacité comparable (environ 12 % après 1 et 2 h).
En conclusion, les extraits préparés à partir de Bellis perennis sont efficaces pour réduire la concentration de glucose sanguin in vitro ainsi que dans un organisme vivant.
Nos tests Gluc-HET réalisés n’ont pas conduit à des effets toxiques observables, tels que des lésions ou des vaisseaux sanguins désorganisés, lors du traitement avec les extraits de Bellis perennis. Pour exclure davantage une réduction de la glycémie in ovo due à une fuite non spécifique causée par les extraits, nous avons utilisé l’approche in vitro de la monocouche Caco-2 : les cellules Caco-2 peuvent être cultivées et différenciées en monocouches de cellules épithéliales polarisées sur des inserts membranaires, et l’intégrité de la monocouche peut être validée en mesurant la résistance électrique transépithéliale (TEER). L’incubation avec l’extrait de Bellis perennis préparé maison n’a pas conduit à une réduction des valeurs de TEER ni à une augmentation du transport du glucose ou du polyol xylitol (figure [ ]). La performance du test a été validée par l’ajout d’un mélange de saponines, qui a entraîné une chute rapide des valeurs de TEER (figure [ ]) : le mélange de saponines réduit la viabilité cellulaire (figure [ ]) et augmente ainsi le transport paracellulaire des nutriments, y compris les sucres. En conclusion, les extraits de Bellis perennis n’influencent apparemment pas négativement l’intégrité épithéliale.
Il est connu que plusieurs composés polyphénoliques, tels que l’acide gallique, l’acide tannique, l’acide abscissique, l’acide caféique et la quercétine, sont des composés antidiabétiques présumés, agissant comme inducteurs de la translocation de GLUT4. Par conséquent, nous avons analysé les teneurs en polyphénols des extraits préparés à partir de Bellis perennis utilisés dans cette étude par CLHP-spectrométrie de masse (SM). Tout d’abord, les composés ont été identifiés par spectrométrie de masse et spectres UV, suivis d’une quantification à l’aide de courbes d’étalonnage avec les étalons pertinents. Treize composés polyphénoliques ont été identifiés et quantifiés, dont la rutine, l’hypéroside, l’isoquercitrine, la guaijavérine, l’avicularine, la quercitrine, la quercétine (flavonols), l’apigénine-7-glucoside (également connue sous le nom d’apigétrine), l’apigénine 7-glucuronide, l’apigénine (flavones), l’acide néochlorogénique, l’acide chlorogénique et l’acide caféique (acides hydroxycinnamiques). De plus, le kaempférol et la lutéoline ont été identifiés par analyse CLHP-SM, mais en raison de l’absence d’étalons et de temps de rétention se chevauchant, ils n’ont pas été quantifiés. Un chromatogramme CLHP-DAD représentatif indiquant les temps de rétention et les longueurs d’onde maximales de chaque composé est présenté à la figure [ ]. Le tableau [ ] résume les teneurs en polyphénols identifiées. L’acide hydroxycinnamique le plus abondant était l’acide chlorogénique (2,69 mg/L), l’apigénine-7-glucoside et l’apigénine-7-glucuronide (temps de rétention se chevauchant) se sont révélés être les flavones les plus abondantes (0,42 mg/L), et la quercitrine a été détectée comme le flavonol majoritaire (0,1 mg/L). Tous les autres polyphénols n’ont été détectés qu’à des concentrations plus faibles. De manière générale, la concentration de composés polyphénoliques dans l’extrait préparé maison était environ dix fois plus élevée que dans les extraits PECKISH. Cependant, le profil polyphénolique obtenu à partir des chromatogrammes respectifs était très similaire, indiquant des compositions identiques. En conclusion, les composés polyphénoliques sont abondants dans les extraits préparés à partir de Bellis perennis et pourraient contribuer aux effets hypoglycémiants.
En 2012, le diabète était la huitième cause de décès chez les deux sexes, entraînant 1,5 million de décès dans le monde. La croissance démographique, l’augmentation de l’âge moyen de la population et surtout la hausse de la prévalence du diabète à chaque âge ont régulièrement accru le nombre de personnes vivant avec le diabète. Une glycémie élevée, même en dessous du seuil diagnostique du diabète (> 7,0 mmol/L), représente une source importante de morbidité et de mortalité. Les personnes touchées souffrent directement de complications microvasculaires conduisant à une neuropathie ou à un syndrome du pied diabétique, mais aussi de maladies macrovasculaires, notamment un risque accru de crise cardiaque ou d’accident vasculaire cérébral.
À mesure que le nombre de personnes vivant avec le diabète continue d’augmenter, les impacts sanitaires et économiques déjà importants du diabète augmenteront également. Ces impacts peuvent être réduits à long terme grâce à des mesures de prévention à l’échelle de la population et individuelles ciblant les principaux facteurs de risque. Il existe donc une forte demande de produits pharmaceutiques pour traiter et, plus efficacement, prévenir le diabète. Dans ce contexte, les composés phytochimiques constituent potentiellement une alternative attractive aux médicaments de synthèse, car ils sont associés à une incidence réduite d’effets secondaires et à de faibles coûts. Cependant, une faible biodisponibilité et une faible efficacité pourraient limiter leur application.
Dans notre laboratoire, nous visons à identifier des composés phytochimiques antidiabétiques selon deux stratégies. Premièrement, des composés végétaux et des extraits qui inhibent la résorption intestinale du glucose en utilisant les monocouches Caco-2 comme modèle in vitro ont été identifiés. Cette approche a conduit à la caractérisation de divers candidats positifs, tels que des extraits préparés à partir de fruits et de feuilles de goyave. Deuxièmement, à l’aide d’un test in vitro fondé sur la microscopie de fluorescence, nous criblons des extraits végétaux qui induisent la translocation de GLUT4 dans la membrane plasmique. GLUT4 est le principal transporteur de glucose sensible à l’insuline dans le muscle et le tissu adipeux. Sa translocation efficace des compartiments de stockage cytosoliques vers la membrane plasmique entraîne une diminution rapide de la glycémie. Le trafic de GLUT4 est fréquemment perturbé dans le DT2, conduisant à un état pathologique appelé résistance à l’insuline (RI) : dans ce cas, les cellules ne parviennent pas à répondre normalement à l’insuline, ce qui aboutit finalement à une hyperglycémie.
L’application de composés insulinomimétiques, c’est-à-dire de substances qui induisent la translocation de GLUT4 en l’absence d’insuline, représente une stratégie prometteuse pour la prévention et le traitement du DT2. Divers composés phytochimiques ont été rapportés comme induisant la translocation de GLUT4 in vitro. À l’aide de l’approche de microscopie de fluorescence susmentionnée, nous avons confirmé l’efficacité d’extraits végétaux connus à induire la translocation de GLUT4. De plus, nous avons criblé des centaines d’extraits végétaux hydrosolubles de la bibliothèque PECKISH, ce qui a abouti à plusieurs candidats positifs. Pour la procédure de criblage, l’application des extraits a été réalisée à faible concentration (1 mg/L) afin de garantir l’identification uniquement des extraits efficaces. Nous avons pu identifier deux extraits (4404 et 4407) préparés à partir de Bellis perennis (pâquerette commune) comme des mélanges de composés puissants, capables d’induire la translocation de GLUT4. Des concentrations de seulement 250 à 500 µg/L, soit 100 à 1000 fois inférieures à celles rapportées pour divers autres extraits végétaux, principalement éthanoliques/méthanoliques, ont entraîné une augmentation significative des molécules de GLUT4 dans la membrane plasmique. De plus, l’extrait éthanolique de Bellis perennis préparé maison à partir de matière première récoltée dans la zone locale s’est révélé encore plus puissant pour induire la translocation de GLUT4. L’application de 1 mg/L a entraîné une augmentation de plus de 35 %, comparable à l’effet du témoin insuline. Nous concluons que les extraits hydrosolubles ainsi qu’éthanoliques de Bellis perennis sont des inducteurs efficaces de la translocation de GLUT4 in vitro. Cependant, sur la base d’études précédentes, nous savons qu’une forte augmentation du signal GFP dans le champ évanescent ne prouve pas nécessairement une insertion membranaire accrue : un mélange de composés polyphénoliques, PP60, s’est révélé augmenter la translocation de GLUT4, mais pas l’insertion dans la membrane plasmique. Ainsi, d’autres expériences sont nécessaires pour répondre à cette question.
À cette fin, nous avons utilisé un test de l’œuf de poule modifié développé dans notre laboratoire (appelé Gluc-HET) pour confirmer l’efficacité des extraits de Bellis perennis à réduire la glycémie dans un organisme vivant (in ovo). Comparés aux tests in vitro, les tests in ovo sont beaucoup plus chronophages. Par conséquent, seuls les composés à forte efficacité dans les systèmes de culture cellulaire sont analysés. Au cours de cette étude, plusieurs extraits végétaux ayant conduit à une induction de la translocation de GLUT4 in vitro ont été testés à l’aide de l’approche Gluc-HET. Fait intéressant, seuls les extraits de Bellis perennis ont été capables de réduire significativement la glycémie des embryons de poulet. Cet effet était apparent pour les trois extraits testés, dans différents solvants et à différents instants. Fait intéressant, nous n’avons pas trouvé de différences significatives entre les extraits hydrosolubles et préparés maison de Bellis perennis in ovo. Cela nous a surpris, car la concentration de composés polyphénoliques était considérablement plus élevée dans l’extrait préparé maison que dans les extraits PECKISH. Nous supposons que les polyphénols disponibles dans les extraits PECKISH suffisent à induire les effets observés et qu’une concentration plus élevée n’augmente pas leur efficacité. En outre, nous ne pouvons exclure que des composés bioactifs inconnus, non polyphénoliques, soient, éventuellement en partie, responsables des effets physiologiques. Cependant, nous concluons que l’application d’extraits préparés à partir de Bellis perennis réduit la glycémie dans un organisme vivant.
À l’aide des cellules Caco-2, qui forment des monocouches de type épithélial in vitro, nous avons pu montrer que l’extrait de Bellis perennis préparé maison ne réduit pas l’intégrité de la membrane épithéliale. C’est un bon indice que la réduction observée de la glycémie in ovo est réellement causée par une captation accrue dans le muscle et le tissu adipeux, plutôt que par une fuite non spécifique des vaisseaux sanguins embryonnaires. Le système Gluc-HET présente plusieurs avantages par rapport à d’autres modèles in vivo : il est rapide, fiable, peu coûteux et ne nécessite aucune autorisation d’un comité d’éthique. De plus, les embryons de poulet sont sensibles à l’insuline humaine à certains stades de développement, même si la production d’insuline n’a pas commencé. Cependant, nous sommes conscients que d’autres données in vivo (souris diabétiques) et cliniques sont nécessaires pour prouver l’efficacité des extraits de Bellis perennis chez l’humain.
Nous avons utilisé la CLHP-SM pour l’identification et la quantification des composés actifs potentiels. Comme les polyphénols sont fréquemment associés à des effets antidiabétiques potentiels conjointement à une translocation accrue de GLUT4, notre attention s’est principalement portée sur les composés phytochimiques. À ce jour, il n’existe que des informations limitées sur les teneurs en polyphénols de Bellis perennis. Les composés identifiés présents dans les extraits comprennent des flavonoïdes, des anthocyanes, des tanins et quelques acides phénoliques. Nos mesures ont conduit à l’identification et à la quantification de 13 composés polyphénoliques, dont 7 flavonols, 3 flavones et 3 acides hydroxycinnamiques. L’apigénine-7-O-glucoside (apigétrine) et l’apigénine-7-O-glucuronide se sont révélées être les flavones les plus abondantes (avec des temps de rétention se chevauchant), bien que l’aglycone apigénine n’ait été présente qu’à de très faibles concentrations. L’acide hydroxycinnamique le plus abondant était l’acide chlorogénique, tandis que la quercitrine a été détectée comme le flavonol majoritaire. Nous avons également pu identifier le kaempférol et la lutéoline comme deux autres flavonols. Cependant, en raison de leurs masses moléculaires identiques, de leurs temps de rétention similaires dans le spectre UV et de l’absence d’étalons appropriés, ces composés n’ont pas pu être quantifiés. Par rapport à d’autres études, nous n’avons pas trouvé d’acide férulique ni d’acide rosmarinique, ni d’isorhamnétine ni de myricétine. Il est important de noter que les extraits PECKISH 4404 et 4407 et l’extrait préparé maison ont donné des chromatogrammes similaires, avec des tailles de pics ne variant que légèrement, indiquant des profils de composés polyphénoliques identiques dans tous les extraits utilisés pour cette étude.
En examinant la littérature, nous avons réalisé que l’effet antidiabétique présumé des extraits de Bellis perennis décrit dans cette étude est nouveau. Bellis perennis est connue comme une herbe traditionnelle utilisée depuis de nombreuses années pour le traitement des plaies et des fractures osseuses. De plus, elle a été utilisée pour traiter les maux de gorge, les céphalées, le rhume banal, la gastrite, l’entérite, l’inflammation et plusieurs autres maladies en médecine traditionnelle. Des études récentes ont indiqué que des extraits préparés à partir de Bellis perennis inhibent l’augmentation des taux de triglycérides, présentent une activité inhibitrice de la lipase pancréatique, induisent la vidange gastrique chez des souris chargées en huile d’olive et favorisent l’activité de synthèse du collagène dans les fibroblastes dermiques humains normaux. Cependant, la propriété insulinomimétique et antidiabétique potentielle des extraits préparés à partir de Bellis perennis n’avait pas été rapportée jusqu’à présent. Nous supposons que la teneur particulière en polyphénols pourrait contribuer aux effets décrits ici, comme c’est également le cas pour d’autres extraits végétaux, tels que ceux préparés à partir de Portulaca oleracea. Cependant, nous ne pouvons exclure que d’autres substances bioactives soient également pertinentes. Par exemple, Bellis perennis est riche en saponines, dont la bayogénine. Ces composés amphipathiques entrent également en considération, potentiellement conjointement avec les polyphénols, pour l’effet antidiabétique documenté.
En conclusion, nous avons pu montrer que les extraits préparés à partir de Bellis perennis sont riches en substances polyphénoliques, induisent la translocation de GLUT4 in vitro à de faibles concentrations et réduisent efficacement la glycémie chez des animaux vivants. Sur la base de nos résultats, une application dans des produits alimentaires fonctionnels spécialisés et des compléments alimentaires apparaît raisonnable.