Référence : Molecules 2017. — PMC6151772 · DOI 10.3390/molecules22101773 Type : Article de recherche original (étude expérimentale in vitro et in vivo chez la souris) · Plante : Plantain lancéolé · Propriété → Peau Accès : ⭐ libre (open-access, CC BY 4.0) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Les composants les plus importants des feuilles de Plantago lanceolata L. sont le catalpol, l’aucubine et l’actéoside (= verbascoside). Ces composés bioactifs possèdent différents effets pharmacologiques : anti-inflammatoire, antioxydant, antinéoplasique et hépatoprotecteur. Le but de cette étude était de protéger l’extrait de Plantago lanceolata de l’hydrolyse et d’améliorer son effet antioxydant à l’aide de systèmes de délivrance de médicaments auto-nanoémulsifiants (SNEDDS). Huit compositions de SNEDDS ont été préparées, et leurs propriétés physiques, leur cytotoxicité in vitro et leurs valeurs d’AST/ALT in vivo ont été étudiées. Un test de viabilité cellulaire MTT a été réalisé sur des cellules Caco-2. Les échantillons bien dilués (dilutions de 200 à 1000 fois) se sont révélés non cytotoxiques. L’administration aiguë des compositions PL-SNEDDS a entraîné des modifications mineures des marqueurs hépatiques (AST, ALT), à l’exception des compositions 4 et 8 en raison de leur forte teneur en Transcutol (80 %). Les compositions non toxiques ont montré une augmentation significative de l’activité de piégeage des radicaux libres mesurée par le test DPPH par rapport aux SNEDDS à blanc. Un test de dissolution indirect a été réalisé, basé sur le résultat du test antioxydant DPPH ; les profils de dissolution de l’extrait de Plantago lanceolata étaient statistiquement différents pour chaque SNEDDS. L’effet anti-inflammatoire des compositions PL-SNEDDS a été confirmé par le test d’inflammation de l’oreille. Sur toute la durée d’examen, toutes les compositions ont diminué l’œdème de l’oreille par rapport au témoin positif (non traité). On peut conclure que les compositions PL-SNEDDS pourraient être utilisées pour délivrer des composés naturels actifs de manière stable, efficace et sûre.
Plantago est l’un des genres les plus importants au sein de la famille des Plantaginaceae, contenant plus de 200 espèces à travers le monde « [ ] ». Plantago lanceolata L. (plantain lancéolé) possède diverses propriétés pharmacologiques pour la santé humaine, notamment antioxydante « [ ] », anti-inflammatoire « [ ] », antinéoplasique « [ ] », hépatoprotectrice « [ ] », d’immunorégulation et neuroprotectrice, avec un profil de sécurité excellent et bien connu. P. lanceolata a également été utilisé en médecine traditionnelle pour la cicatrisation des plaies « [ ] ». Ses principaux ingrédients pharmaceutiques actifs appartiennent au groupe des glycosides phényléthanoïdes et des glycosides iridoïdes « [ ] ». Le verbascoside (actéoside) est un glycoside phénylpropanoïde et représente le principal composant bioactif de P. lanceolata « [ ] ». La limitation de leurs formulations réside dans leur faible stabilité chimique due à l’hydrolyse « [ ] ». Le caractère fortement hydrophile du verbascoside limite l’éventail des applications possibles. Des études de stabilité ont fait état d’une plus grande stabilité du verbascoside dans une émulsion H/E (huile dans eau) « [ ] ». L’attention s’est portée sur le développement de systèmes de délivrance de médicaments auto-microémulsifiants (SMEDDS) afin de stabiliser les drogues végétales et d’améliorer leur biodisponibilité « [ ] ». Les systèmes de délivrance de médicaments de taille micro et nanométrique contenant des drogues végétales ont été considérés comme des systèmes vecteurs idéaux pour l’optimisation de l’activité/efficacité de ces extraits et pour la gestion des problèmes apparus qui sont associés aux plantes « [ ] ». Les SNEDDS sont fréquemment utilisés pour la stabilisation des produits naturels et ces systèmes vecteurs peuvent également augmenter la biodisponibilité des matériaux bioactifs naturels « [ ] ». P. lanceolata est l’une des espèces de Plantaginaceae les mieux caractérisées et décrites, qui est officielle dans la Pharmacopée européenne « [ ] ». Il a été rapporté comme une herbe sûre et efficace, mais peu d’études toxicologiques ont été établies/menées sur la biocompatibilité des extraits végétaux de PL dans différents systèmes vecteurs. L’application de doses élevées ou l’exposition sur de longues périodes peut entraîner des effets mutagènes et cytotoxiques « [ ] ». Les microémulsions et les SNEDDS nécessitent souvent une forte teneur en tensioactifs, ce qui peut conduire à une irritation cutanée ou muqueuse. Les molécules amphiphiles peuvent être des tensioactifs et co-tensioactifs idéaux dans les SNEDDS, mais les effets toxiques doivent être criblés pour prouver leur innocuité « [ ] ».
Cette étude a été menée pour développer des SNEDDS contenant de l’extrait de Plantago lanceolata (PL-SNEDDS), afin d’améliorer la stabilité physique de l’extrait végétal et d’augmenter son effet anti-inflammatoire et antioxydant. Les composants des PL-SNEDDS étaient le myristate d’isopropyle, le Transcutol et le Labrasol/Kolliphor RH 40. Les diagrammes de phase ternaires ont mis en évidence les zones existantes de nanoémulsions. Néanmoins, des études de toxicité (test de viabilité MTT sur cellules Caco-2, investigation des enzymes hépatiques chez la souris) ont également été réalisées pour certifier le profil de sécurité des formulations développées. Le test d’inflammation de l’oreille et le test antioxydant DPPH ont vérifié l’efficacité des compositions de SNEDDS et ont vérifié la biodisponibilité améliorée des formulations étudiées.
Les concentrations des composés bioactifs trouvés dans la Plantaginis lanceolatae folium (feuille de plantain lancéolé) sont présentées dans « [ ] ». 10 mg/mL d’extrait sec au MeOH équivaut à 39,68 mg PS mL/mL de drogue végétale. L’actéoside est plus hydrophile que les molécules typiques de type médicamenteux (logP prédit = 0,82, logD = 0,81 à pH 7,50). Les glycosides iridoïdes sont encore plus polaires (logP prédit = 3,18 et = −3,43 pour l’aucubine et le catalpol, respectivement).
Des diagrammes de phase pseudoternaires ont été construits en utilisant une technique conventionnelle de titrage à l’eau. Le myristate d’isopropyle comme phase huileuse, le Labrasol ou le Kolliphor RH 40 comme tensioactif, et le Transcutol HP comme co-tensioactif ont été utilisés dans nos compositions. Les zones maximales d’existence de nanoémulsion observées sont montrées dans « [ ] ». La distribution de la taille des gouttelettes est déterminée par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et présentée dans « [ ] ». Les SNEDDS-PL développés (montrés dans « [ ] ») ont spontanément formé une nanoémulsion sous une agitation douce dans l’eau distillée à température ambiante. La concentration d’extrait de P. lanceolata était de 10 mg/mL dans chaque composition. Les SNEDDS étudiés étaient stables pendant un mois à température ambiante. Le criblage des SNEDDS a également impliqué la détermination du pourcentage de transmittance et de l’indice de réfraction. Le pourcentage de transmittance et l’indice de réfraction de la formulation obtenue se sont révélés être de 976,8 ± 1,31 % et 1,337 ± 0,13 %, indiquant la transparence de ces formulations. Sur la base du résultat de ces expériences, huit compositions ont été sélectionnées pour des investigations ultérieures.
Le niveau d’extrait de P. lanceolata dans les SNEDDS est resté supérieur à 90 % au jour 10 dans des conditions de 40 °C ; l’humidité relative était de 92,5 %. Lorsque la température a été augmentée à 60 °C, le niveau d’extrait de drogue végétale a diminué à 91,6 %. Ces données suggèrent que les SNEDDS sont stables dans des conditions de température élevée et d’humidité élevée. Les glycosides des espèces de Plantago ont une stabilité dépendante du pH. Alors que les iridoïdes se décomposent spontanément à très bas pH (base du test de Trim-Hill), l’actéoside devient instable à pH 7 et au-dessus. Le pH original du mélange (typiquement autour de pH 5–6) maintient la stabilité des composés majeurs à un degré acceptable. Cela signifie que l’environnement d’extraction est « tamponné » par les composants de la plante et préserve ainsi la plupart des composés lors de l’extraction liquide. L’enzyme de décomposition des glycosides iridoïdes (bêta-glucosidase) est incapable d’opérer dans le MeOH et, de plus, est inactivée par la chaleur.
Un test de viabilité cellulaire MTT a été réalisé sur des cellules Caco-2 « [ ] ». Les compositions 1–8 ont été diluées par une solution équilibrée de Hank (HBSS). 1 mg de composition PL-SNEDDS a été dilué par 1–1000 mL de HBSS. Il existait une relation linéaire entre la cytotoxicité et le rapport de dilution des différentes compositions de SNEDDS. Les échantillons plus concentrés ont diminué la viabilité cellulaire et entraîné une cytotoxicité significative. Plus le rapport de dilution des compositions de SNEDDS était élevé, meilleure était la viabilité cellulaire de la lignée cellulaire Caco-2. L’application de ces compositions (compositions 1, 2 et 5, 6), dans lesquelles la teneur en Transcutol HP était plus faible, a entraîné des valeurs de viabilité cellulaire plus élevées que dans les cas des compositions 3, 4 et 7, 8, où la plage de teneur en Transcutol était de 60–80 %. Néanmoins, on peut observer qu’il y a une cytotoxicité réduite à une dilution de 200–1000. Des différences significatives entre les groupes pour les compositions 1, 2, 5, 6 et les groupes pour les compositions 3, 4, 7, 8 (à l’exception de la composition 3 vs. les compositions 5 et 6 au rapport de dilution 100, où les différences n’ont pas atteint le niveau de signification statistique). Il existe des différences significatives entre les groupes traités par PL-Composition et les témoins positifs ou négatifs. Après analyse de régression, il semble qu’il existe des différences significatives entre les groupes pour les compositions 1, 2, 5, 6 et les groupes pour les compositions 3, 4, 7, 8 « [ ] ».
L’effet de toutes les compositions de SNEDDS contenant P. lanceolata sur les marqueurs de la fonction hépatique a été étudié. « [ ] » montre l’effet des SNEDDS-PL administrés par voie orale sur les enzymes de la fonction hépatique AST et ALT après 2 jours de traitement. Les compositions 4 et 8, contenant 80 % de Transcutol HP, ont entraîné une conséquence fatale, et le nombre de souris mortes était de 5/5 et 4/5, respectivement. Ces échantillons ont été retirés de notre plan expérimental. Cependant, les compositions (SNEDDS-PL 1, 2, 3 et 5, 6, 7), dans lesquelles la plage de teneur en Transcutol HP variait entre 33–60 %, n’ont pas montré d’augmentation significative de l’AST. Une diminution significative des niveaux d’enzyme AST a été observée. Cependant, la variation du niveau d’enzyme ALT n’était pas significative dans chaque cas. Une élévation modérée de l’ALT a été enregistrée par rapport au groupe témoin normal. Les résultats ont révélé que nos échantillons, à l’exclusion des compositions 4 et 8, pourraient être appliqués en toute sécurité dans nos expériences ultérieures.
Les profils de libération in vitro des SNEDDS ont été étudiés par la détermination de la capacité antioxydante des échantillons diffusés « [ ] ». Le témoin négatif était l’extrait de Plantago lanceolata sans SNEDDS. Tous les groupes traités par PL-Composition différaient significativement du groupe témoin négatif (aucune marque n’est indiquée). L’inhibition du DPPH de l’extrait d’herbe dissous était significativement différente de 15 min à 60 min. Après 15 min, lorsque les capsules de gélatine dure étaient désintégrées, les SNEDDS ont formé rapidement des gouttelettes de nanoémulsion et la capacité antioxydante des PL-Compositions a fortement augmenté. Les capacités antioxydantes des PL-Composition 2 et 6 étaient significativement plus élevées que les autres PL-Compositions. Sur la base du test antioxydant DPPH, les profils de dissolution de l’extrait de P. lanceolata étaient statistiquement différents pour chaque SNEDDS. L’efficacité de diffusion des compositions PL-SNEDDS était 4–5 fois plus élevée que l’extrait seul.
Le test antioxydant DPPH est basé sur la capacité d’un radical libre stable (DPPH) à changer de couleur en présence d’antioxydants. Dans nos mesures de capacité antioxydante, les compositions 1–3 et 5–7, avec ou sans extraits de P. lanceolata, ont été testées. Comme témoins, les compositions à blanc appropriées (compositions 1–3 et 5–7) ont été appliquées. Chaque échantillon contenait 10 mg/mL d’extrait de P. lanceolata (PL-composition). Le pourcentage d’activité antioxydante (AA %) de chaque substance a été évalué par le test des radicaux libres DPPH. La mesure de l’activité de piégeage des radicaux DPPH a été réalisée selon la méthodologie décrite par Brand-Williams et al. « [ ] ». Il y avait des différences significatives entre les groupes traités par PL-composition et les compositions sans PL, ainsi qu’entre les groupes traités par PL-composition et l’échantillon traité par PL-E (comme témoin positif). Ces différences significatives entre les groupes PL-composition et le groupe témoin positif ont été marquées d’un astérisque.
Il a été démontré que toutes les compositions étaient capables d’inhiber significativement l’oxydation moyenne du DPPH. Parmi les PL-compositions, la PL-composition 6 a montré l’activité antioxydante la plus efficace dans le test DPPH. Selon nos mesures, la PL-composition 7 a montré la plus faible activité, bien que sa capacité antioxydante se soit révélée significativement supérieure à l’extrait de P. lanceolata non formulé (PL-E).
Chaque composition administrée par voie orale contenant 10 mg/mL d’extrait de P. lanceolata a diminué significativement l’épaisseur de l’oreille sur toute la période de temps par rapport au témoin positif (diméthyl-benzène seul), comme on le voit dans « [ ] ». L’effet maximal du diméthyl-benzène a été mesuré 2 h après le temps de provocation dans chaque cas. Sur toute la durée d’examen, toutes les compositions diminuent l’œdème de l’oreille par rapport au témoin positif (non traité).
P. lanceolata est une espèce bien connue qui présente divers effets pharmacologiques « [ ] ». Cependant, la grande capacité de ses composants bioactifs à l’hydrolyse a entraîné une faible stabilité de cet extrait naturel « [ ] ». Vertuani et al. « [ ] » ont trouvé une diminution de 90 % du niveau d’actéoside à 40 °C et pH = 7, et de 80 % à pH = 6. Dans notre étude, nous avons montré que les systèmes de délivrance de médicaments auto-nanoémulsifiants (SNEDDS) peuvent être une solution réalisable pour améliorer la stabilité des ingrédients pharmaceutiques actifs (API) de l’extrait de P. lanceolata. Les liposomes pour administration parentérale peuvent également améliorer la stabilité du verbascoside en empêchant son hydrolyse « [ ] ». Néanmoins, les nanoémulsions peuvent augmenter la stabilité des composés naturels et l’encapsulation améliore l’activité antioxydante des API « [ ] ». Il convient de noter que nos compositions PL-SNEDDS ont potentialisé l’activité de piégeage des radicaux libres de l’extrait de P. lanceolata par rapport au témoin positif (extrait de P. lanceolata non encapsulé). Le test de réduction du DPPH était une méthode efficace et rapide pour cribler l’activité de piégeage des échantillons PL-SNEDDS in vitro « [ ] ». La réaction DPPH est prédictive mais pas suffisante pour certifier le potentiel thérapeutique de l’extrait de P. lanceolata « [ ] ». Par conséquent, un test d’inflammation de l’oreille a été réalisé. Le diméthyl-benzène est capable d’induire un œdème de l’oreille à la dose appropriée, comme décrit précédemment « [ ] » ; chaque composition PL-SNEDDS était capable de diminuer l’inflammation induite par le diméthyl-benzène. La fraction insoluble dans le n-hexane de Plantago lanceolata a démontré des activités anti-inflammatoires chez la souris. La fraction a réduit le volume de l’œdème de la patte ainsi que l’expression de la COX-2 « [ ] ».
Sur la base de la valeur prédictive du test DPPH, un test de dissolution indirect a été développé. Les compositions PL-SNEDDS contenant 25–25 % de myristate d’isopropyle—Kolliphor RH 40/Labrasol et 50 % de Transcutol HP ont entraîné une réduction plus élevée des radicaux libres. Selon le résultat des tests de dissolution et d’inflammation de l’oreille, le classement des compositions PL-SNEDDS était le même dans le cas des deux tests. Ceci est soutenu par l’expérience de Li et al. « [ ] » selon laquelle des formulations stables SNEDDS-extrait de feuille de kaki ont été préparées et une corrélation linéaire in vitro-in vivo a été observée. Les nanosystèmes à base de lipides permettent également d’augmenter la biodisponibilité des API, et donc des formulations plus efficaces peuvent être développées « [ ] ». Le degré d’efficacité dépend des types d’huile, de tensioactif et de co-tensioactif dans ces systèmes nanoémulsifiants « [ ] ». Dans notre formulation, le Transcutol HP comme co-tensioactif était un promoteur de pénétration efficace « [ ] », le myristate d’isopropyle, comme phase huileuse, pouvait dissoudre les composants plus lipophiles de P. lanceolata « [ ] », et le Kolliphor RH 40/Labrasol était capable d’améliorer la perméabilité paracellulaire des API sur la monocouche de cellules Caco-2 et était approprié pour stabiliser le composant le plus hydrophile des composés naturels « [ ] ». Les molécules amphiphiles peuvent être des tensioactifs et co-tensioactifs idéaux dans les microémulsions « [ ] », mais le criblage de la cytocompatibilité peut aider à évaluer leur profil de toxicité. Pour cette raison, un test de viabilité cellulaire MTT in vitro a été réalisé et les valeurs d’AST/ALT in vivo ont été étudiées chez la souris. Dans l’étude de toxicité aiguë, les compositions PL-SNEDDS diluées étaient plus concentrées que dans l’expérience de cytotoxicité sur cellules Caco-2. Cependant, plus la dilution était élevée, plus les compositions étaient sûres. Les échantillons bien dilués (dilution de 200 à 1000 fois) se sont révélés non cytotoxiques. Ces données sont importantes pour évaluer le profil de toxicité de nos compositions, mais il existe certaines limites aux investigations. Les cellules Caco-2 sont utilisées de manière extensive comme modèle in vitro pour le criblage rapide de l’absorption intestinale et de la cytotoxicité « [ ] ». Le test in vitro peut prédire l’irritabilité, le potentiel et la toxicité retardée des tensioactifs « [ ] », mais s’il était complété par différents tests in vivo (c.-à-d. la détermination des marqueurs de la fonction hépatique, c.-à-d. dans des expériences animales), il pourrait être plus prédictif. Le classement de toxicité des compositions PL-SNEDDS était le même dans les deux tests, à l’exception des compositions PL-SNEDDS 4 et 8. Parce que ces échantillons ont entraîné la mort des souris. Cela pourrait indiquer que le test de cytotoxicité MTT n’est pas approprié pour évaluer la toxicité globale. Plus d’un test sur différentes lignées cellulaires complété par des études de toxicité animale in vivo sont applicables pour déterminer le profil de toxicité des compositions. Néanmoins, une évaluation soigneuse des résultats in vitro et in vivo est également nécessaire pour estimer les facteurs de risque et les résultats possibles en cas d’exposition humaine (approche du parallélogramme par Xing et al., 2006) « [ ] ».
Les feuilles de P. lanceolata de qualité pharmacopéiale étaient d’origine commerciale. Elles ont été réduites en une poudre fine avant tout travail ultérieur. La poudre a été extraite au MeOH sous reflux (100 g de poids sec — PS — pour 400 mL de MeOH) pendant 30 min, filtrée et évaporée à sec dans un évaporateur rotatif. Ensuite, l’extrait végétal a été dégraissé à l’hexane (3 × 50 mL) et séché à nouveau. 100 g de drogue végétale ont donné 25,2 g d’extrait sec.
Des solutions à 10 mg/mL de l’extrait sec ont été préparées avec du MeOH et diluées de 100 à 250 fois pour l’analyse. Des standards authentiques de catalpol, d’aucubine et d’actéoside ont été utilisés comme standards pour construire les courbes d’étalonnage dans la plage de concentration de 0,2–20 µg mL^−1 (MeOH). La quantification des produits naturels par LC-MS a été effectuée sur un HPLC Thermo Accela relié à un MS à piège à ions linéaire Thermo LTQ XL (colonne : kinetex XB-C18 100 mm × 2,1 mm × 2,6 μm). Les composants du gradient étaient A, eau avec 0,1 % (v/v) d’acide formique ; B, acétonitrile avec 0,1 % (v/v) d’acide formique. Le programme temporel était de 5 % B : 0–1 min, 5–20 % B : 1–5 min, 20–60 % B : 5–9 min, 60–100 % : 9–11 min ; 100 % B : 11–13 min ; 100–5 % B : 13–15 min, 5 % B : 15–17,5 min. Le débit était de 250 μL/min. Le volume d’injection était de 1 μL. Les iridoïdes ont été détectés en mode positif, et l’actéoside a été détecté en mode ion négatif. Les paramètres d’ionisation par électronébulisation (ESI) étaient les suivants : température du réchauffeur, non chauffée ; gaz de gaine, N2 ; débit, 8 unités arbitraires (arb) ; débit du gaz auxiliaire, 0 arb ; tension de pulvérisation, 5 kV ; température du capillaire, 275 °C. La tension du capillaire était de 7 V et −35 V en mode ion positif et en mode ion négatif, respectivement. Des courbes d’étalonnage de 0,2–20 µg mL^−1 ont été utilisées, et les composés purs ont été dissous dans le MeOH.
Les feuilles de P. lanceolata de qualité pharmacopéiale étaient d’origine commerciale. Elles ont été réduites en une poudre fine avant tout travail ultérieur. La poudre a été extraite au MeOH sous reflux (100 g PS — 400 mL MeOH) pendant 30 min, filtrée et évaporée à sec dans un évaporateur rotatif. Ensuite, l’extrait végétal a été dégraissé à l’hexane (3 × 50 mL) et séché à nouveau. 100 g de drogue végétale ont donné 25,2 g d’extrait sec.
Des solutions à 10 mg/mL de l’extrait sec ont été préparées avec du MeOH et diluées de 100 à 250 fois pour l’analyse. Des standards authentiques de catalpol, d’aucubine et d’actéoside ont été utilisés comme standards pour construire les courbes d’étalonnage dans la plage de concentration de 0,2–20 µg mL^−1 (MeOH).
Différentes combinaisons auto-émulsifiantes ont été formulées par la méthode de dilution eau et huile avec divers tensioactifs et co-tensioactifs préalablement testés « [ ] ». Les compositions sont listées dans « [ ] ». Les composants tensioactifs ont été mélangés à 37 °C par un distributeur Schott Tritronic (SI Analytical, Mayence, Allemagne) combiné à un agitateur magnétique Radelkis OP-912 (Radelkis, Budapest, Hongrie). Les concentrations appliquées de médicaments cytostatiques ont été dissoutes dans les systèmes à température ambiante par agitation permanente. Pour évaluer tout signe de séparation de phase, les mélanges ont été équilibrés pendant 24 h. Un appareil à palette rotative Erweka DT800 (Erweka GmbH, Heusenstamm, Allemagne) a été utilisé pour évaluer l’efficacité de l’auto-émulsification des différents mélanges. Un gramme de chaque mélange a été ajouté à 200 mL d’eau distillée avec une condition d’agitation douce fournie par une palette rotative à 70 tr/min et à une température de 37 °C. Le processus d’auto-émulsification a été surveillé visuellement pour la vitesse d’émulsification et pour l’apparence des émulsions produites. Les propriétés visuelles ont été enregistrées en fonction de l’incrément du composant tensioactif appliqué dans des diagrammes triangulaires ternaires. Les points de tracé des combinaisons préférentielles ont été sélectionnés selon un calcul de coordonnées cartésiennes.
Le diamètre de la phase dispersée a été étudié par un dispositif de diffusion dynamique de la lumière (DLS) par cumulants (Malvern, Worchestershire, Royaume-Uni). La fonction de corrélation d’intensité a été analysée pour obtenir le coefficient de diffusion. Les mesures ont été effectuées par un appareil photomètre Brookhaven (Brookhaven, Upton, NY, États-Unis). La température de fonctionnement a été ajustée à 25 °C, l’angle de détection du laser à 90 degrés, Lambda à 533 nm, et l’indice à 1,334 par le programme Particle Size Program 3.1 (Malvern, Worchestershire, Royaume-Uni). Les diamètres des gouttelettes dispersées selon le coefficient de diffusion ont été évalués automatiquement par le programme informatique.
Les cellules Caco-2 (cellules cancéreuses d’adénocarcinome humain) ont été obtenues auprès de la Collection européenne de cultures cellulaires (ECACC, Public Health England, Salisbury, Royaume-Uni). Les cellules ont été cultivées dans des flacons de culture cellulaire en plastique dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Sigma-Aldrich Buchs, St. Gallen, Suisse), complété par 3,7 g/L de NaHCO3, 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal (SVF) inactivé par la chaleur, 1 % (v/v) de solution d’acides aminés non essentiels, 1 % (v/v) de l-glutamine, 100 UI/mL de pénicilline et 100 UI/mL de streptomycine à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de CO2. Les cellules ont été maintenues de routine par des repiquages réguliers. Pour les expériences de cytotoxicité et de transport, les cellules ont été utilisées entre les numéros de passage 20 et 40. Le milieu de culture a été remplacé par du milieu frais toutes les 72 h « [ ] ».
Pour exclure tout effet toxique des SNEDDS à blanc et des PL-SNEDDS sur les cellules Caco-2, le test de viabilité cellulaire MTT a été utilisé « [ ] ». Les cellules ont été ensemencées sur des plaques de culture tissulaire à fond plat de 96 puits à une densité de 10^4 cellules/puits et ont été laissées croître dans un incubateur à CO2 à 37 °C pendant 4 jours. Pour ces études, le milieu de culture a été retiré, les solutions de tensioactif ou de SNEDDS ont été ajoutées, et les cellules ont été incubées pendant 30 min supplémentaires. Après le retrait des échantillons, une autre incubation de 3 h dans un milieu contenant du MTT à la concentration de 0,5 mg/mL a suivi. Les cristaux de formazan bleu foncé ont été dissous dans de l’isopropanol acide (isopropanol : acide chlorhydrique 1,0 M = 25:1). L’absorbance a été mesurée à 570 nm contre une référence à 690 nm avec un lecteur de microplaques FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH, Offenburg, Allemagne). La viabilité cellulaire a été exprimée en pourcentage du témoin non traité « [ ] ».
Chaque échantillon (PL-Composition 1–3, 5–8, Composition 1–3, 5–8, PL-E) a été mis à réagir avec le radical DPPH stable dans l’éthanol (96 %). Le mélange réactionnel consistait à ajouter 100 µL d’échantillon, 900 µL d’éthanol absolu et 2 mL de solution de radical DPPH (0,06 mM) dans l’éthanol absolu. Les mélanges ont été incubés pendant 30 min. Lorsque le DPPH a réagi avec un composé antioxydant, capable de donner de l’hydrogène, il a été réduit. La réaction a entraîné un changement de couleur du violet profond au jaune clair. La mesure quantitative du DPPH restant a été réalisée avec un spectrophotomètre UV (Shimadzu Spectrophotometer, Tokyo, Japon) à une longueur d’onde de λ = 517 nm. Dans le cas des mélanges à détermination photométrique, l’éthanol absolu a servi de fond. Les solutions témoins étaient les mêmes compositions sans extrait de P. lanceolata. Pour démontrer l’effet antioxydant amélioré des combinaisons, l’extrait de P. lanceolata à blanc (10 mg/mL) a également été appliqué. Le pourcentage d’activité de piégeage (AA % = activité antioxydante) a été déterminé selon Mensor et al. « [ ] ».
FORMULE : AA % = 100 − [((Abséchantillon − Absblanc) × 100)/Abstémoin].
Le test de dissolution in vitro des PL-Compositions basé sur la détermination de l’activité de piégeage des radicaux DPPH de l’extrait de P. lanceolata.
La libération in vitro du médicament à partir des PL-SNEDDS a été menée selon les méthodes de dissolution recommandées par la FDA à pH = 6,8. La condition de dissolution était de 500 mL de tampon phosphate pH 6,8 à une vitesse de palette de 75 tr/min. Des aliquotes de 3 mL ont été prélevées et filtrées à l’aide d’un filtre de 0,45 µm à des intervalles de temps prédéterminés de 5, 10, 15, 30, 60 min. Le volume retiré de chaque solution a été immédiatement remplacé par du milieu de dissolution frais. La détermination de l’extrait de P. lanceolata diffusé était basée sur l’activité de piégeage des radicaux DPPH (voir ci-dessous).
Des souris mâles Swiss (22 ± 3 g), fournies par l’animalerie de la Faculté de médecine, Faculté de pharmacie, Université Ahvaz Jundishapur des sciences médicales, Ahvaz, Iran (le numéro d’approbation éthique est IR.AJUMS.REC. 1394.139) ont été utilisées. Les animaux ont été maintenus dans un cycle de 12 h lumière/obscurité, à température constante, avec accès à la nourriture et à l’eau du robinet ad libitum. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université Ahvaz Jandishapur des sciences médicales, Faculté de pharmacie, Ahvaz, Iran. Pendant les expériences, les animaux ont été traités selon les lignes directrices éthiques internationales suggérées pour le soin des animaux de laboratoire. Cinquante-quatre animaux ont été utilisés pour les investigations des marqueurs de la fonction hépatique et quarante-huit animaux pour les tests d’œdème de l’oreille. Pour la première expérience, les souris ont été divisées en neuf groupes (un témoin et huit groupes pour l’investigation des SMEDDS-PL), pour la seconde expérience, huit groupes de souris ont été composés (un témoin positif et un témoin négatif et six groupes pour l’investigation des SMEDDS-PL). Les extraits (150 mg/kg/jour) ont été administrés par gavage gastrique (100 µL trois fois par jour). Les témoins ont reçu le même volume que dans le groupe de test.
Les souris ont été anesthésiées le dernier jour des expériences, et le sang a été collecté à partir des veines caves avant que les souris soient euthanasiées par dislocation cervicale.
Le sang collecté a été placé dans des tubes héparinés et centrifugé pendant 15 min à 2000 tr/min afin d’obtenir des échantillons de plasma, qui ont été utilisés immédiatement pour déterminer les activités de l’ALT et de l’AST.
Les activités plasmatiques de l’aspartate aminotransférase (AST) et de l’alanine aminotransférase (ALT) ont été évaluées par la méthode spectrophotométrique en utilisant des kits disponibles dans le commerce (réactifs Roche, Meylan, France), selon les indications du fabricant.
L’anesthésie a été induite par le thiopental à raison de 50 mg/kg par voie intrapéritonéale (i.p.), répété selon les besoins. La zone postérieure de l’oreille droite a ensuite été injectée avec une solution de diméthyl-benzène à 3 m/m %. Ce traitement a été appliqué 30 min après le gavage oral. Ainsi, l’administration orale des SNEDDS-PL a été effectuée en premier, et l’induction de l’inflammation a été réalisée en second.
L’épaisseur de l’oreille a été mesurée par un pied à coulisse micrométrique (Oxford Precision, Leicester, Royaume-Uni), avec une précision de 0,1 mm, avant le traitement au diméthyl-benzène et 15 min après la première application de diméthyl-benzène, puis à chaque heure pendant une période de 6 h après chaque traitement au diméthyl-benzène à 3 m/m % selon Ujhelyi J., et al. « [ ] ». Le traitement SNEDDS-PL a été effectué 30 min avant le temps de début de l’induction de l’œdème de l’oreille. Les données ont été exprimées en micromètres.
Les données ont été traitées et analysées à l’aide de Microsoft Excel 2013 et SigmaStat 4.0 (version 3.1 ; SPSS, Chicago, IL, États-Unis, 2015), et présentées ici comme moyennes ± SD. La comparaison des résultats des tests de viabilité cellulaire MTT, des marqueurs de la fonction hépatique (AST, ALT), du test d’activité de piégeage des radicaux libres, du test de dissolution in vitro et du test d’œdème de l’oreille a été effectuée avec une ANOVA à un facteur et une ANOVA à mesures répétées suivie d’un post-test de Tukey ou de Dunnett. La différence des moyennes a été considérée comme significative en cas de p < 0,05. Toutes les expériences ont été réalisées en quintuplicat et répétées au moins cinq fois (n = 5).
Enfin, on peut conclure que les compositions PL-SNEDDS ont un potentiel élevé pour améliorer la stabilité des API de l’extrait de Plantago lanceolata et peuvent également améliorer l’effet antioxydant et anti-inflammatoire des composés naturels. Ces échantillons pourraient être une alternative réalisable à des fins médicales.
Néanmoins, la cytocompatibilité in vitro et les études animales in vivo ont indiqué que davantage de tests sont nécessaires pour estimer le profil de toxicité global des compositions PL-SNEDDS.
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