Référence : BMC Complement Altern Med 2014. — PMC4227022 · DOI 10.1186/1472-6882-14-225 Type : étude expérimentale in vitro et in vivo chez le rat · Plante : Romarin officinal · Propriété → Antioxydant Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Les produits antioxydants naturels sont de plus en plus utilisés pour traiter diverses affections hépatiques pathologiques, compte tenu du rôle du stress oxydatif dans leur pathogenèse. L’huile essentielle de romarin est déjà utilisée comme conservateur dans l’industrie alimentaire en raison de ses activités antioxydantes et antimicrobiennes, mais il a été montré qu’elle possède des bénéfices supplémentaires pour la santé. L’objectif de notre étude était d’évaluer l’effet protecteur de l’huile essentielle de romarin sur les lésions hépatiques induites par le tétrachlorure de carbone chez le rat et de déterminer si son mécanisme d’action est associé à une modulation du statut oxydatif hépatique.
La composition chimique de l’huile essentielle de romarin isolée a été déterminée par chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse. L’activité antioxydante a été déterminée in vitro au moyen du test DPPH. Les activités des enzymes marqueurs des lésions hépatocellulaires dans le sérum et des enzymes antioxydantes dans les homogénats de foie ont été mesurées au moyen de méthodes spectrophotométriques cinétiques.
Dans cette recherche, nous avons identifié 29 composés chimiques dans l’huile essentielle de romarin étudiée, dont les principaux constituants étaient le 1,8-cinéole (43,77 %), le camphre (12,53 %) et l’α-pinène (11,51 %). L’huile essentielle étudiée s’est révélée exercer des effets hépatoprotecteurs aux doses de 5 mg/kg et de 10 mg/kg en diminuant jusqu’à 2 fois les activités de l’AST et de l’ALT dans le sérum de rats présentant des lésions hépatiques aiguës induites par le tétrachlorure de carbone. L’huile essentielle de romarin a empêché l’augmentation de la peroxydation lipidique induite par le tétrachlorure de carbone dans les homogénats de foie. En outre, le prétraitement pendant 7 jours par l’huile essentielle étudiée a significativement rétabli les activités des enzymes antioxydantes catalase, peroxydase, glutathion peroxydase et glutathion réductase dans les homogénats de foie, particulièrement à la dose de 10 mg/kg.
Nos résultats démontrent que l’huile essentielle de romarin, outre l’activité de piégeage des radicaux libres déterminée par le test DPPH, exerce également ses effets hépatoprotecteurs par l’activation des mécanismes physiologiques de défense.
Le foie joue un rôle central dans le métabolisme, le transport et l’élimination des xénobiotiques et est donc très sensible à la toxicité induite par les substances chimiques. Dans le monde occidental, les lésions hépatiques médicamenteuses constituent un problème majeur de santé et sont responsables de la majorité des cas d’insuffisance hépatique aiguë [ ]. Elles sont considérées comme idiosyncrasiques et, outre les facteurs génétiques, les facteurs environnementaux et liés au mode de vie ainsi que les affections pathologiques préexistantes déterminent également la sensibilité des individus aux lésions hépatiques induites par les substances chimiques. Les mécanismes physiopathologiques de l’hépatotoxicité induite par les substances chimiques ne sont pas encore entièrement compris, mais ils sont principalement associés à la conversion métabolique des xénobiotiques en espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui induisent un stress oxydatif et endommagent les macromolécules cellulaires [ ]. Le stress oxydatif, défini comme le déséquilibre entre la production endogène de ROS et l’activité des systèmes antioxydants, a récemment été reconnu comme un facteur clé des modifications physiopathologiques observées dans un large éventail de maladies hépatiques, telles que l’hépatite subclinique sans ictère, l’hépatite inflammatoire nécrotique, la cirrhose hépatique et le carcinome hépatocellulaire [ , ]. Une meilleure compréhension du rôle du stress oxydatif dans ces troubles hépatiques pourrait conduire à l’utilisation appropriée d’antioxydants comme approche thérapeutique des maladies du foie. Les produits antioxydants naturels, particulièrement les composés phytochimiques, ont gagné en popularité dans le monde entier en raison de leur efficacité et de leur innocuité. Ils sont de plus en plus utilisés pour traiter diverses affections hépatiques pathologiques et près de la moitié des agents actuellement utilisés dans le traitement du foie sont soit des produits naturels, soit leurs dérivés [ ].
Le romarin (Rosmarinus officinalis L., Lamiaceae) est une plante ligneuse vivace originaire de la région méditerranéenne, mais désormais cultivée dans le monde entier comme plante ornementale et aromatique. Les feuilles de romarin sont couramment utilisées comme condiment pour aromatiser les aliments, mais cette plante est également largement employée à différentes fins médicinales. En médecine traditionnelle, le romarin a été utilisé comme stimulant et analgésique léger, et il a été considéré comme l’une des plantes les plus efficaces pour traiter les céphalées, la mauvaise circulation, les maladies inflammatoires ainsi que la fatigue physique et mentale. Le romarin a également été utilisé empiriquement en médecine populaire comme agent cholérétique et hépatoprotecteur [ , ]. La plupart des effets pharmacologiques du romarin résultent de la forte activité antioxydante de ses principaux constituants chimiques, qui comprennent le carnosol, l’acide carnosique, l’acide ursolique, l’acide rosmarinique et l’acide caféique. Les puissantes propriétés antioxydantes du romarin ont principalement été attribuées à ses diterpènes majeurs, le carnosol et l’acide carnosique, ainsi qu’aux composants de son huile essentielle [ ].
Récemment, les huiles essentielles et leurs composés actifs ont suscité un grand intérêt en raison de leurs propriétés pharmacologiques. Les huiles essentielles sont des mélanges complexes de composés volatils à forte odeur, synthétisés dans plusieurs organes végétaux et exerçant diverses fonctions écologiques [ ]. En raison de leurs activités biologiques, il a été rapporté que les huiles essentielles sont utiles pour la conservation des aliments, l’industrie des parfums et l’aromathérapie [ ]. L’huile essentielle de romarin (REO) est un liquide incolore ou jaune pâle, présentant l’odeur caractéristique de la plante et constitué principalement de monoterpènes tels que le 1,8-cinéole, le camphre et l’α-pinène [ ]. Grâce à ses activités antioxydantes et antimicrobiennes [ , ], la REO peut prolonger la durée de conservation des produits alimentaires et maintenir leur qualité pendant le stockage. Elle est donc déjà utilisée comme bioconservateur dans l’industrie alimentaire [ ].
Outre son action antioxydante, l’huile essentielle isolée du romarin possède divers bénéfices pour la santé et effets thérapeutiques. Selon la recommandation de 2010 de l’Agence européenne des médicaments (EMA), la REO peut être utilisée pour traiter la dyspepsie et les troubles spasmodiques légers du tractus gastro-intestinal, ainsi que comme adjuvant pour soulager les douleurs musculaires et articulaires mineures et les troubles circulatoires périphériques mineurs [ ]. Par ailleurs, les expériences menées avec la REO ont démontré plusieurs effets pharmacologiques notables, notamment des effets anti-inflammatoires et antinociceptifs [ ], antidépresseurs [ ], d’amélioration de la cognition [ ], protecteurs de l’ADN [ ] et anticancéreux [ ], entre autres.
Les effets hépatoprotecteurs du romarin ont été observés dans différents modèles expérimentaux de lésions hépatiques. L’extrait méthanolique de romarin s’est révélé efficace contre les lésions hépatiques aiguës induites par le tétrachlorure de carbone (CCl₄) [ ], et l’extrait aqueux de romarin a pu prévenir les lésions hépatiques aiguës induites par l’azathioprine chez le rat [ ]. L’extrait méthanolique de romarin a également pu prévenir l’hépatotoxicité dans des modèles expérimentaux de prévention et de réversion de la cirrhose hépatique induite par le CCl₄ [ ]. À notre connaissance, l’activité hépatoprotectrice potentielle de l’huile essentielle de romarin, qui contient des monoterpènes comme principaux composés actifs, n’avait pas auparavant été testée in vivo. L’objectif de la présente étude était d’examiner par GC/MS la composition chimique de l’huile essentielle isolée des parties aériennes de Rosmarinus officinalis, d’évaluer l’effet protecteur de l’huile essentielle obtenue contre les lésions hépatiques induites par le CCl₄ chez le rat et de déterminer si son mécanisme d’action est associé à une modulation du statut oxydatif hépatique.
Les parties aériennes de plants de romarin cultivés ont été obtenues en 2010 auprès de l’Institut d’études sur les plantes médicinales Dr Josif Pančić, à Belgrade. Un spécimen de référence de la plante (Rosmarinus officinalis L. 1753 subsp. officinalis no 2–1746, dét. : Goran Anačkov) a été confirmé et déposé dans l’herbier du Département de biologie et d’écologie de la Faculté des sciences de l’Université de Novi Sad. L’huile essentielle utilisée dans nos expériences a été isolée à partir du matériel végétal obtenu.
Le tétrachlorure de carbone a été obtenu auprès de Merck (Darmstadt, Allemagne). Sauf indication contraire, tous les produits chimiques destinés aux analyses biochimiques ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, États-Unis).
L’huile essentielle a été isolée des parties aériennes du romarin par hydrodistillation, conformément à la procédure de la Pharmacopée européenne 4 [ ]. Le n-hexane a été utilisé comme solvant de collecte, puis éliminé sous vide de l’huile essentielle obtenue.
L’identification et la quantification des constituants chimiques de l’huile essentielle ont été réalisées par chromatographie en phase gazeuse couplée à une détection par ionisation de flamme (GC/FID) et à une détection par spectrométrie de masse (GC/MS). L’analyse GC/FID a été réalisée avec un chromatographe Hewlett-Packard HP 5890 série II équipé d’un échantillonneur automatique et d’un système d’injection avec/sans division. La colonne capillaire utilisée dans cette étude était une HP-5 (25 m × 0,32 mm ; épaisseur du film de 0,52 μm), couplée au détecteur à ionisation de flamme (FID). Les températures de l’injecteur et du détecteur ont été réglées respectivement à 250 °C et 300 °C, et la température de la colonne a été programmée de 40 à 260 °C à une vitesse de 4 °C/min. Le débit d’hydrogène utilisé comme gaz vecteur était de 1 ml/min. Un échantillon de 1 μl d’une solution de l’huile à 1 % dans l’éthanol a été injecté en mode avec division (rapport de division : 1:30). L’analyse GC/MS a été réalisée avec un système GCD Hewlett-Packard HP G1800C série II dans les mêmes conditions analytiques que l’analyse GC/FID. Une colonne HP-5MS (30 m × 0,25 mm ; épaisseur du film de 0,25 μm) et de l’hélium comme gaz vecteur ont été utilisés pour cette analyse. Le système fonctionnait en mode d’ionisation électronique (EI) à 70 eV, dans la plage de masse (m/z) de 40–450 Da.
L’identification des constituants de l’huile essentielle a été effectuée par comparaison des spectres de masse et des indices de rétention obtenus avec ceux de la bibliothèque de spectres de masse NIST (IBM-AT, version 2, 1990) et avec les données de la littérature. L’analyse quantitative a fourni la composition en pourcentage des composants de l’huile essentielle, calculée par la méthode de normalisation de l’aire des pics FID.
L’activité antioxydante de l’huile essentielle de romarin (REO) a été évaluée sous la forme de sa capacité de piégeage des radicaux libres (RSC). La capacité de la REO à donner un électron et à piéger le radical stable 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle (DPPH) a été étudiée [ ]. L’huile essentielle et une solution méthanolique d’α-tocophérol utilisée comme témoin positif ont été mélangées avec une solution de DPPH et, après 60 minutes, la quantité restante de radical DPPH de couleur violette a été mesurée par spectrophotométrie à 515 nm. La capacité de piégeage des radicaux libres a été calculée comme suit : RSC = 100–100 × A_échantillon/A_blanc, où A_blanc est l’absorbance de la solution diluée de DPPH et A_échantillon l’absorbance de l’huile essentielle/de la référence. Tous les essais ont été réalisés en triple et les valeurs moyennes ont été retenues. La valeur IC₅₀, qui représente la concentration d’échantillon nécessaire pour provoquer une inhibition de 50 % du radical DPPH, a été estimée par analyse de régression linéaire à partir des valeurs de RSC obtenues et exprimée en μl d’huile essentielle par ml.
La teneur en composés phénoliques de la REO a été mesurée au moyen du réactif de Folin-Ciocalteu [ ]. L’huile essentielle a été mélangée avec le réactif de Folin-Ciocalteu et une solution de carbonate de sodium dans un tube à essai. Après agitation au vortex et incubation dans l’obscurité pendant 2 h, l’absorbance a été mesurée à 740 nm. L’estimation de la teneur totale en phénols a été réalisée en triple et le résultat a été exprimé en mg d’équivalents d’acide gallique (GAE) par litre.
L’expérience a été menée sur des rats Wistar albinos des deux sexes, âgés de 7–8 semaines et pesant 200–250 g, obtenus auprès de l’Académie de médecine militaire de Belgrade. Les rats ont été hébergés dans des cages de laboratoire standard, sous un cycle lumière-obscurité de 12 h, à une température ambiante constante de 23 °C et à une humidité de 30–50 %, et ont pu s’adapter pendant 4 semaines avant le début des expériences. Les animaux ont reçu une alimentation standard sous forme de granulés (LM2, Institut vétérinaire, Subotica, Serbie) et ont eu librement accès à l’eau du robinet. Les soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales ont été conduits conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par la Commission des sciences de la vie du Conseil national de la recherche (États-Unis). L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université de Novi Sad.
Afin d’évaluer l’effet de la REO sur les lésions hépatiques induites par le CCl₄, les animaux ont été répartis aléatoirement en six groupes expérimentaux comprenant chacun six individus et traités comme suit :
La REO, préalablement mise en suspension dans une solution saline, a été administrée par gavage per os. La variabilité du volume des doses administrées a été maîtrisée en ajustant la concentration afin d’assurer un volume constant de 1 ml/kg. La REO et la solution saline ont été administrées quotidiennement pendant sept jours. Le 7e jour, 1 h après la dernière dose de REO ou de solution saline, les animaux ont reçu par voie intrapéritonéale du CCl₄ dissous dans de l’huile d’olive (1:1, 1 ml/kg). Après 24 h, les rats ont été anesthésiés avec de l’uréthane (0,75 mg/kg) et sacrifiés par cardioponction, puis des échantillons de sang et de foie ont été prélevés [ ]. Le sérum obtenu a été utilisé pour déterminer les paramètres biochimiques standard. Les homogénats de foie ont été préparés à partir de 1 g de tissu hépatique homogénéisé dans un homogénéisateur de Potter avec une solution tamponnée de saccharose-Tris–HCl selon un rapport de 1:3 (p/v), à 4 °C. Les paramètres du stress oxydatif ont été analysés dans les homogénats de foie obtenus.
Les taux de cholestérol total et de triglycérides, paramètres biochimiques associés au statut lipidique, le taux de bilirubine, marqueur de la fonction excrétrice du foie, les activités des enzymes marqueurs des lésions hépatocellulaires, notamment l’alanine aminotransférase (ALT) et l’aspartate aminotransférase (AST), ainsi que les concentrations d’urée, de créatinine et d’acide urique, indicateurs de la fonction excrétrice rénale, ont été déterminés dans le sérum. Toutes les analyses ont été réalisées en triple pour chaque échantillon avec l’autoanalyseur Olympus AU 400 (Hambourg, Allemagne), au moyen de trousses disponibles dans le commerce fondées sur des méthodes spectrophotométriques bien établies et conformément aux manuels fournis.
Les triglycérides et le cholestérol ont été quantifiés par des méthodes colorimétriques enzymatiques. Les méthodes glycérol-phosphate oxydase-peroxydase (GPO-POD) et cholestérol oxydase-peroxydase (CHOD-POD) ont été appliquées pour déterminer respectivement les triglycérides et le cholestérol. Les concentrations sériques de bilirubine totale et directe ont été estimées par la méthode colorimétrique DPD, fondée sur la réaction entre la bilirubine et le sel de 2,5-dichlorophényldiazonium produisant un complexe d’azobilirubine. Les activités de l’AST et de l’ALT ont été mesurées au moyen des méthodes standard de l’IFCC. Le taux sérique de créatinine a été mesuré par la méthode de Jaffé modifiée, tandis que les taux d’urée et d’acide urique ont été déterminés respectivement par les méthodes cinétiques à la glutamate déshydrogénase (GLDH-UV) et à l’uricase-peroxydase.
Le statut oxydatif du foie a été estimé en mesurant les niveaux de peroxydation lipidique (LPx) et de glutathion réduit (GSH), ainsi que les activités des enzymes antioxydantes, notamment la catalase (CAT), la peroxydase (Px), la glutathion peroxydase (GPx) et la glutathion réductase (GR), dans les homogénats de foie, au moyen de méthodes spectrophotométriques. Toutes les mesures ont été réalisées en triple pour chaque échantillon.
L’intensité de la LPx a été estimée en mesurant la quantité de malondialdéhyde, produit terminal de la dégradation des lipides due aux lésions de peroxydation, selon la méthode de Buege et Aust [ ]. La teneur en GSH a été déterminée par réaction avec l’acide 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoïque), selon la méthode de Kapetanović et Mieyal [ ]. L’activité de la CAT a été déterminée par la méthode fondée sur le suivi de la vitesse de décomposition du H₂O₂ à 240 nm [ ], et l’activité de la Px en utilisant le gaïacol comme substrat de l’enzyme [ ]. Les activités de la GPx et de la GR ont été déterminées respectivement selon les méthodes de Beutler [ ] et de Goldberg et Spooner [ ]. Ces tests reposaient sur la mesure de la diminution de l’absorbance provoquée par l’oxydation du NADPH à 340 nm (test UV).
Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). La variation intergroupe entre les différents groupes a été mesurée par une analyse de variance à un facteur (ANOVA), suivie du test de comparaisons multiples de Tukey. Les résultats ont été considérés comme statistiquement significatifs lorsque p < 0,05. Les données ont été analysées avec le logiciel SPSS, version 19 (IBM SPSS, Chicago, IL, États-Unis).
L’huile essentielle distillée à partir du romarin présentait une couleur jaune pâle et une forte odeur, et le rendement obtenu en huile essentielle était de 1,03 % (v/p dans la matière sèche). Le nombre total de constituants chimiques identifiés était de 29, représentant 99,87 % de la teneur totale de l’huile. La composition en pourcentage de la REO est présentée dans le tableau [ ].
Composition chimique de l’huile essentielle de romarin [ ]
a RT-FID — temps de rétention dans le système GC/FID ; b RT-MS — temps de rétention dans le système GC/MS ; c RRT — temps de rétention relatif par rapport au camphre.
L’huile essentielle contient un mélange complexe composé de 95,10 % de monoterpènes et de 4,77 % de sesquiterpènes. Il a été constaté qu’elle se composait principalement de monoterpènes oxygénés (63,88 %), suivis des hydrocarbures monoterpéniques (31,22 %) et des hydrocarbures sesquiterpéniques (4,77 %). Les principaux composés identifiés et quantifiés par GC-FID et GC-MS étaient le 1,8-cinéole (43,77 %), le camphre (12,53 %), l’α-pinène (11,51 %), le β-pinène (8,16 %), le camphène (4,55 %) et le β-caryophyllène (3,93 %) (fichiers supplémentaires [ ] et [ ]).
L’activité antioxydante de la REO a été évaluée par le test de piégeage du radical libre DPPH, et le résultat a été présenté sous la forme de la valeur IC₅₀, définie comme la concentration d’antioxydant nécessaire pour piéger 50 % du DPPH présent dans la solution d’essai. Les résultats ont démontré que l’huile essentielle possédait une forte activité de piégeage des radicaux, avec une valeur IC₅₀ de 77,6 μl/ml. Une comparaison a été effectuée avec l’α-tocophérol (vitamine E), puissant antioxydant et piégeur de radicaux libres bien connu, qui présentait une valeur IC₅₀ de 25,3 μg/ml. En conséquence, 1 μg d’α-tocophérol s’est révélé équivalent à 3,1 μl de la REO étudiée.
Il a été rapporté que l’activité antioxydante des huiles essentielles de romarin découlait en partie de la présence de groupes phénoliques [ ]. Nous avons mesuré la teneur totale en phénols afin de déterminer si cette classe de composés chimiques contribuait, outre les monoterpènes, à la capacité de piégeage des radicaux libres de la REO. La teneur totale en phénols de la REO étudiée a été mesurée au moyen de la méthode de Folin-Ciocalteu et une quantité relativement faible de phénols totaux, de 153,35 mg GAE/l, a été déterminée.
Dans notre étude, nous avons examiné les concentrations sériques de triglycérides et de cholestérol afin d’évaluer l’effet de la REO sur la fonction métabolique du foie. Le CCl₄ a induit une légère diminution des taux de triglycérides et de cholestérol, qui a été partiellement corrigée après l’administration de REO à la dose de 5 mg/kg. La prise de REO seule n’a pas significativement affecté la fonction métabolique du foie (tableau [ ]).
Effets de l’huile essentielle de romarin sur les paramètres biochimiques sériques [ ]
Toutes les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± SEM. (*) significativement différent du groupe Con S ; (#) significativement différent du groupe Con CCl₄ ; p < 0,05.
Le traitement des animaux par le CCl₄ a induit une augmentation statistiquement significative des taux sériques de bilirubine totale et directe. L’augmentation de la concentration sérique de bilirubine indique une altération de la fonction excrétrice du foie. Cet effet a été davantage exacerbé après le cotraitement par la REO à la dose de 10 mg/kg. Afin de confirmer la survenue des lésions hépatiques induites par le CCl₄, les activités sériques de l’AST et de l’ALT ont été mesurées. Les activités de l’AST et de l’ALT étaient respectivement 25 et 19 fois plus élevées dans le groupe Con CCl₄ que dans le groupe traité par la solution saline, ce qui, comme on le sait, résulte principalement de la fuite de ces enzymes depuis les hépatocytes endommagés vers la circulation sanguine. Le traitement des animaux par la REO a atténué ces paramètres d’hépatotoxicité, particulièrement dans le groupe traité par la REO à la dose de 10 mg/kg, dans lequel l’activité de l’AST était significativement diminuée par rapport au groupe traité par le CCl₄.
Les concentrations sériques d’urée, de créatinine et d’acide urique, utilisées comme biomarqueurs de la fonction rénale, ont également été examinées. Ces paramètres biochimiques étaient augmentés dans le groupe traité par le CCl₄, ce qui indiquait sa néphrotoxicité, mais ils ont été significativement rétablis après l’administration de REO.
Afin d’analyser le potentiel antioxydant de la REO pour prévenir les modifications biochimiques induites par le CCl₄ dans le foie des rats, nous avons mesuré les niveaux de malondialdéhyde (MDA) et de glutathion (GSH), ainsi que les activités de la catalase (CAT), de la peroxydase (Px), de la glutathion peroxydase (GPx) et de la glutathion réductase (GR), en tant que biomarqueurs des effets de la REO.
La dose unique de CCl₄ a induit une augmentation de 3,5 fois du niveau de MDA par rapport au groupe témoin négatif de rats 24 h après l’administration, ce qui suggérait une lésion oxydative des membranes cellulaires. Cette augmentation s’accompagnait d’une réduction significative de la concentration de GSH (0,73 ± 0,05 nmol contre 1,71 ± 0,17 nmol de GSH/mg de protéines dans le groupe témoin) et des activités de toutes les enzymes antioxydantes examinées, à l’exception de la GPx, qui présentait une activité accrue dans les homogénats de foie (figure [ ]).
Niveaux de peroxydation lipidique (LPx), de glutathion (GSH), de catalase (CAT), de peroxydase (Px), de glutathion peroxydase (GPx) et de glutathion réductase (GR) dans les homogénats de foie [ ]. (*) significativement différent du groupe Con S ; (#) significativement différent du groupe Con CCl₄ ; p < 0,05.
Nos résultats ont montré que l’administration quotidienne de REO pouvait normaliser partiellement les paramètres biochimiques altérés dans le modèle expérimental de lésions hépatiques aiguës. Le prétraitement pendant 7 jours par les deux doses de REO a significativement rétabli les paramètres biochimiques associés au stress oxydatif dans les homogénats de foie, particulièrement à la dose de 10 mg/kg, à laquelle la REO a ramené ces paramètres à des valeurs proches de celles du groupe témoin négatif. En outre, l’administration de REO seule a également modifié significativement la plupart des biomarqueurs du stress oxydatif étudiés et amélioré le statut oxydatif du foie.
Dans cette recherche, nous avons déterminé la composition chimique de la REO étudiée, son activité de piégeage des radicaux libres et son potentiel à atténuer les lésions hépatiques induites par l’agent pro-oxydant CCl₄. Des études antérieures portant sur la composition chimique des huiles essentielles isolées du romarin indiquent l’existence de trois principaux chémotypes. Le principal composant des huiles tunisiennes, turques, marocaines et italiennes est le 1,8-cinéole, généralement présent à plus de 40 %, tandis que la plupart des huiles espagnoles, françaises et grecques contiennent du 1,8-cinéole, de l’α-pinène et du camphre dans des proportions approximativement égales (20–30 %). Le chémotype d’huile de romarin riche en myrcène a été signalé en Amérique du Sud [ ]. Les principaux constituants de l’huile essentielle de romarin étudiée dans notre étude étaient le 1,8-cinéole (43,77 %), le camphre (12,53 %) et l’α-pinène (11,51 %). La REO de notre étude peut donc être classée dans le type marocain/tunisien. Il convient de noter que d’importantes variations de la composition chimique des huiles essentielles de romarin ont été rapportées. Plusieurs facteurs se sont révélés influencer la composition des huiles essentielles, notamment l’origine géographique, la partie de la plante, la saison de récolte et donc le stade phénologique de la plante, ainsi que la méthode d’isolement de l’huile essentielle [ ]. Tous les effets de la REO doivent donc être examinés avec prudence, en tenant compte de la composition chimique de l’huile étudiée.
Nous avons évalué l’activité antioxydante in vitro de la REO et démontré une capacité relativement élevée de piégeage du radical DPPH, avec une valeur IC₅₀ de 77,6 μl/ml. Nos résultats concordent avec les données précédemment rapportées concernant l’activité antioxydante des huiles essentielles de romarin. L’activité de piégeage des radicaux libres, ainsi que la composition chimique de l’huile que nous avons étudiée, étaient similaires à celles de l’huile essentielle obtenue à partir de romarin cultivé dans le Sud-Ouest tunisien, comme l’a démontré l’étude de Kadri et al. [ ]. Les valeurs IC₅₀ varient généralement considérablement d’une étude à l’autre, ce qui peut s’expliquer par les différentes compositions chimiques des huiles essentielles de romarin. Il a récemment été montré que le chémotype des huiles essentielles de romarin riches en myrcène présentait l’activité antioxydante la plus élevée [ ]. Dans une étude visant à évaluer et à comparer les propriétés de piégeage des radicaux libres de la REO à celles de trois de ses composants — le 1,8-cinéole, l’α-pinène et le β-pinène —, la REO présentait une valeur IC₅₀ plus faible, et donc une activité antioxydante supérieure, à celles de tous ses composants ainsi qu’à celle de l’antioxydant synthétique hydroxytoluène butylé (BHT) [ ]. Cela signifie qu’en plus des composés majeurs, les composants mineurs peuvent également contribuer significativement à l’activité de la REO. Dans une autre étude, les huiles essentielles de cinq plantes largement utilisées dans le régime méditerranéen — origan, thym, clou de girofle, sauge et romarin — ont été testées quant à leurs propriétés antioxydantes au moyen de six méthodes in vitro, et les résultats ont montré que la REO possédait la plus forte capacité de chélation du fer. En outre, la REO présentait une teneur totale en phénols de 225 mg GAE/l [ ], qui peut être considérée comme faible par comparaison avec les autres huiles essentielles étudiées et qui est relativement similaire aux résultats de notre étude. Cela signifie que les monoterpènes oxygénés, probablement les cétones monoterpéniques aux propriétés antioxydantes établies, pourraient contribuer le plus fortement à la capacité antioxydante de la REO.
Les effets hépatoprotecteurs de la REO ont été étudiés en mesurant les activités sériques de l’ALT et de l’AST, utilisées comme enzymes marqueurs des lésions hépatocellulaires. Dans notre étude, nous avons également évalué les effets de la REO sur les fonctions métabolique et excrétrice du foie, ainsi que sur la fonction excrétrice rénale. Il est bien connu que le CCl₄, agent hautement toxique et pro-oxydant, provoque des lésions des hépatocytes entraînant de fortes augmentations des activités de l’ALT et de l’AST et une élévation de la teneur sérique en bilirubine. La REO s’est révélée exercer des effets hépatoprotecteurs aux deux doses en diminuant les activités sériques de l’AST et de l’ALT, qui sont les marqueurs les plus spécifiques des lésions hépatiques, par rapport au groupe traité par le CCl₄. De même, les résultats des études de Sotelo-Félix et al. [ ] et de Gutiérrez et al. [ ] ont montré qu’un extrait méthanolique de romarin à la dose de 200 mg/kg pouvait rétablir l’activité élevée de l’ALT dans des modèles expérimentaux de lésions hépatiques aiguës et de cirrhose hépatique. Fait intéressant, la coadministration de REO à la dose de 10 mg/kg avec le CCl₄ a entraîné une exacerbation des valeurs sériques de bilirubine, indiquant une altération de la fonction excrétrice du foie. À l’inverse, la REO à la dose de 5 mg/kg n’a pas exercé cet effet. Cela concorde avec les observations antérieures selon lesquelles de nombreux monoterpènes ne présentent pas d’effets dépendants de la dose et qu’il est nécessaire de déterminer la plage de doses la plus appropriée montrant une efficacité [ ]. Parmi les nombreux terpénoïdes, le camphre, monoterpène bicyclique présent dans notre REO en quantité relativement élevée (12,53 %), est un composé potentiellement toxique dont une faible quantité peut provoquer une intoxication chez les enfants. Le camphre est neurotoxique et également toxique pour le foie, mais ses mécanismes restent à élucider. Il a été démontré que le camphre est oxydé en dérivés de la 5-exo-hydroxyfenchone dans les microsomes hépatiques humains, ce qui pourrait contribuer à l’altération de l’excrétion hépatique après l’administration de REO à la dose de 10 mg/kg [ , ]. Le monoterpène α-pinène pourrait également exercer des effets toxiques à fortes doses. Il a été démontré que l’α-pinène présentait une cytotoxicité sur des cellules sanguines humaines cultivées lorsqu’il était appliqué à forte concentration (200 mg/l) [ ], et il a également été confirmé que ce composé était porphyrogène et donc particulièrement dangereux pour les personnes présentant des anomalies de la synthèse hépatique de l’hème [ ].
Outre les effets hépatoprotecteurs indiqués par les valeurs de l’AST et de l’ALT, le potentiel néphroprotecteur de la REO a également été observé dans notre étude. La prise de REO à la dose de 10 mg/kg a entraîné une diminution statistiquement significative des taux d’urée et de créatinine par rapport au groupe Con CCl₄. Ces résultats suggèrent que la REO est capable de rétablir une fonction excrétrice rénale altérée. Cela concorde avec les résultats de l’étude de Sakr et Lamfon [ ], qui indiquent que l’extrait aqueux de romarin pouvait réduire les taux sériques d’urée et de créatinine chez le rat par comparaison avec le groupe d’animaux traité par le CCl₄.
Compte tenu du rôle des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les lésions hépatiques induites par les substances chimiques et dans diverses maladies hépatiques, nous avons utilisé le modèle de lésions hépatiques aiguës induites par le CCl₄, puisque le stress oxydatif constitue le principal mécanisme impliqué dans l’hépatotoxicité du CCl₄. Ce composé est métabolisé par déshalogénation réductrice faisant intervenir le cytochrome P450, ce qui s’accompagne de la formation des radicaux CCl₃• et Cl₃COO•, responsables de la peroxydation des lipides membranaires. Le MDA est l’un des produits secondaires bien connus de la peroxydation lipidique et a été utilisé comme indicateur des lésions de la membrane cellulaire. Comme le montre la figure [ ], la REO s’est révélée capable d’empêcher l’augmentation du niveau de MDA induite par le CCl₄, ce qui suggère qu’elle peut préserver l’intégrité cellulaire et que cet effet pourrait résulter de l’activité de piégeage des radicaux libres déterminée par le test DPPH. Des observations antérieures ont montré que les extraits méthanoliques de romarin, bien que leur composition chimique diffère de celle de la REO, pouvaient également inhiber la peroxydation lipidique dans le foie des rats traités par le CCl₄ [ ]. Outre son activité antilipoperoxydante, il a également été constaté que la REO réduisait efficacement les niveaux de lésions oxydatives de l’ADN induites par le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂) et la 2,3-diméthoxy-1,4-naphtoquinone (DMNQ) dans des hépatocytes isolés de rat ainsi que dans des cellules testiculaires [ , ].
Les effets des ROS sont contrebalancés par le système de défense antioxydant, qui fait intervenir divers mécanismes enzymatiques et non enzymatiques. Le GSH est le principal antioxydant endogène non enzymatique des cellules. Les enzymes antioxydantes Px, GPx et CAT catalysent la réduction des peroxydes en alcools ou en eau. La GR réduit le disulfure de glutathion (GSSG), produit pendant la réduction des peroxydes, en forme sulfhydryle du glutathion (GSH) [ ]. Dans notre étude, nous avons également examiné les effets de la REO sur le système de défense antioxydant des hépatocytes, et nos résultats ont montré que l’administration de CCl₄ induisait une diminution significative du niveau de GSH dans les homogénats de foie. Outre son rôle de cofacteur de plusieurs enzymes antioxydantes, le GSH peut interagir directement avec certaines ROS afin de les piéger et est donc utilisé pour détoxifier les métabolites du CCl₄. La diminution du GSH s’accompagnait d’une réduction significative des activités de la CAT, de la Px et de la GR, qui peut s’expliquer par leur inactivation induite par une production excessive de ROS. Fait intéressant, l’activité de l’enzyme antioxydante GPx était accrue dans le foie après l’administration de CCl₄. Des résultats similaires ont été obtenus dans l’étude de Hsiao et al. [ ], dans laquelle il a été démontré que le CCl₄ induisait une augmentation de l’activité de la GPx et une réduction de l’activité de la CAT. Ces enzymes sont activées dans la défense contre les lésions cellulaires oxydatives. La CAT joue un rôle important dans l’élimination des ROS issues des processus d’oxydoréduction des xénobiotiques dans le foie, et il a été suggéré qu’elle était facilement inactivée par les peroxydes lipidiques [ ]. En revanche, dans des conditions de stress oxydatif, la GPx peut être régulée à la hausse en tant que réponse adaptative des hépatocytes aux lésions oxydatives, et le GSH est alors largement consommé, ce qui concorde avec les résultats de notre étude. L’huile essentielle isolée du romarin a significativement rétabli tous ces paramètres biochimiques relatifs au statut oxydatif du foie, particulièrement à la dose de 10 mg/kg.
L’activité hépatoprotectrice de l’huile essentielle de romarin étudiée peut être attribuée au 1,8-cinéole, son composé majeur. Il a été rapporté que ce monoterpène possédait divers effets pharmacologiques, notamment des effets relaxants sur les muscles lisses, anti-inflammatoires, antioxydants et hypotenseurs. Dans un modèle murin in vivo de syndrome de choc septique induit par la D-galactosamine/le lipopolysaccharide, caractérisé par une apoptose précoce suivie d’une lyse des hépatocytes, le 1,8-cinéole a non seulement supprimé l’augmentation du poids du foie et l’élévation de l’activité sérique des transaminases, mais il a également prévenu la nécrose et l’hémorragie dans une plus grande mesure que la dexaméthasone. Il a été suggéré que l’hépatoprotection était associée à une réduction de la concentration sérique de TNF-α [ ]. Chez des rats traités pendant 30 jours par le contaminant environnemental 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD), les activités des enzymes antioxydantes GPx et CAT ainsi que les niveaux hépatiques de GSH étaient significativement diminués, tandis que les niveaux de MDA étaient significativement augmentés par rapport au groupe non traité. Lorsqu’il était administré avec la TCDD, le 1,8-cinéole augmentait les niveaux de GPx, de CAT et de GSH, tout en réduisant la concentration de MDA jusqu’à une valeur proche de celle du groupe témoin, ce qui suggère que l’activation des systèmes de défense antioxydants constitue l’un des mécanismes de l’hépatoprotection induite par le 1,8-cinéole [ ]. De même, il a été constaté que le traitement par le 1,8-cinéole améliorait l’équilibre oxydatif du côlon chez des rats présentant une colite induite par le TNBS, puisqu’il pouvait réduire l’activité de la myéloperoxydase, marqueur de l’accumulation des leucocytes polymorphonucléaires, et rétablir les niveaux tissulaires de GSH, principal antioxydant intracellulaire [ ]. Outre le 1,8-cinéole, une activité antioxydante a également été déterminée pour l’α-pinène, monoterpène bicyclique présent dans l’huile essentielle étudiée en quantité relativement élevée (11,51 %), et ce composé pourrait également contribuer à l’activité hépatoprotectrice de la REO [ ]. La contribution de divers composés présents en petites quantités dans l’huile essentielle pourrait également être importante pour les effets sur le foie, et leurs mécanismes d’action restent à élucider.
En résumé, les présents résultats démontrent que l’administration de REO, qui présente une activité de piégeage des radicaux libres déterminée par le test DPPH, exerce des effets bénéfiques dans la prévention de l’hépatotoxicité induite par le CCl₄ chez le rat en limitant l’ampleur de la peroxydation lipidique et donc des lésions des membranes cellulaires. Compte tenu de son effet significatif sur les activités des enzymes antioxydantes examinées, il est clair que la REO exerce ses effets hépatoprotecteurs non seulement en piégeant les radicaux libres nocifs, mais aussi en activant les mécanismes physiologiques de défense. Il convient de souligner que la composition chimique des huiles essentielles obtenues à partir du romarin présente des variations considérables et que, pour cette raison, l’utilisation de la REO dans la prévention et/ou le traitement de diverses maladies hépatiques nécessite l’identification des principes actifs et des recherches supplémentaires sur leurs mécanismes d’action.
Les auteurs déclarent ne présenter aucun intérêt concurrent.
Le travail expérimental a été réalisé par IM sous la supervision d’AR, qui a conçu tous les essais. TĆ a effectué les analyses des enzymes antioxydantes. SV a réalisé une partie des expériences. NP a analysé les données et rédigé le manuscrit. MM était le coordinateur du projet. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
L’historique avant publication de cet article est accessible ici :
http://www.biomedcentral.com/1472-6882/14/225/prepub
Chromatogramme en phase gazeuse normalisé de l’huile essentielle de romarin indiquant les temps de rétention relatifs (RRT) par rapport au camphre et les quantités relatives de 29 composants.
Cliquer ici pour accéder au fichier.
Spectre de masse de l’huile essentielle de romarin.
Cette étude expérimentale montre que, chez des rats Wistar albinos des deux sexes présentant des lésions hépatiques aiguës induites par le CCl₄, l’huile essentielle de romarin administrée à 5 mg/kg ou 10 mg/kg pendant 7 jours diminue les activités sériques de l’AST et de l’ALT, empêche l’augmentation de la peroxydation lipidique et rétablit les activités de la CAT, de la Px, de la GPx et de la GR, particulièrement à 10 mg/kg. L’huile contenait principalement du 1,8-cinéole (43,77 %), du camphre (12,53 %) et de l’α-pinène (11,51 %) et présentait in vitro une activité de piégeage du DPPH avec une IC₅₀ de 77,6 μl/ml. Les résultats indiquent une hépatoprotection associée au piégeage des radicaux libres et à l’activation des mécanismes physiologiques de défense, avec un niveau de preuve expérimental in vitro et in vivo chez le rat.
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