Référence : Biologia 2022. — PMC9379225 · DOI 10.1007/s11756-022-01200-w Type : Article de recherche original (étude in vitro sur macrophages RAW 264.7) · Plante : Vergerette du Canada · Propriété → Antioxydant Accès : ⭐ libre → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Des plantes médicinales traditionnelles comme Echinacea purpurea et Erigeron canadensis sont recommandées comme complément d’appoint pour le traitement de maladies associées à une inflammation immunologique (par ex. rhume banal, toux, bronchite, infections des voies respiratoires supérieures, immunodéficiences). Ces états pathologiques s’accompagnent d’un large éventail de dysfonctionnements ou de déséquilibres du système immunitaire, d’où la nécessité accrue de rechercher de nouvelles tendances d’immunomodulation et des phytosubstances immunopharmacologiquement actives pour une thérapie pharmaco-immunomodulatrice efficace. L’activité immunobiologique anti-inflammatoire des protéines-polysaccharides polyphénoliques d’Echinacea purpurea et d’Erigeron canadensis n’est toujours pas étudiée. Nos résultats ont démontré l’efficacité immunobiologique de protéines-polysaccharides polyphénoliques végétaux sélectionnés, isolés des fleurs des plantes médicinales Echinacea purpurea et Erigeron canadensis, aboutissant à une immunostimulation significative des cytokines inflammatoires TNF-α, IL-6, IL-1β et IL-12 (p < 0,001). Les deux protéines-polysaccharides polyphénoliques végétaux ont déclenché la libération cellulaire de l’interleukine anti-inflammatoire IL-10 (p < 0,001). En outre, la libération cellulaire inductive des facteurs de croissance M-CSF et GM-CSF a été démontrée (p < 0,001). Les protéines-polysaccharides polyphénoliques d’E. purpurea et d’E. canadensis ont accéléré l’efficacité de la phagocytose cellulaire et la libération de radicaux libres, de façon plus marquée avec le traitement par Erigeron.
Mots-clés : Echinacea purpurea · Erigeron canadensis · Protéine-polysaccharide polyphénolique · Activité immunobiologique · Cytokines · Phagocytose · Prolifération
Actuellement, du fait de l’augmentation des troubles du système immunitaire tels que les maladies auto-immunes, les déficits immunitaires, l’allergie (Muñoz-Carrillo et al.), il existe une recherche intensive de nouvelles substances immunobiologiquement actives capables de moduler les réponses immunitaires innées et adaptatives. L’étude immunobiologique de diverses plantes médicinales et de leurs composants structuraux actifs constitue un préalable prometteur au développement de nouveaux médicaments pharmacologiquement actifs, adaptés à une thérapie pharmaco-immunomodulatrice efficace. De plus, l’usage traditionnel des herbes médicinales à des fins curatives a représenté une condition préalable à une application phytothérapeutique réussie.
Des herbes médicinales traditionnelles comme Echinacea purpurea (L.) Moench (échinacée pourpre) et Erigeron canadensis L. (synonyme Conyza canadensis, vergerette du Canada) sont considérées comme des plantes aux diverses activités biologiques et pharmacologiques (Manayi et al. ; Kozuharova et al.). Les principaux principes actifs d’Erigeron canadensis sont des flavonoïdes, des huiles essentielles, des tanins, de la choline, de l’acide gallique, des résines, des cires et d’autres encore (Strzelecka et Glinkowska ; Weaver ; Al-Snafi). Il a été démontré que les extraits végétaux et les huiles essentielles d’E. canadensis possèdent diverses activités pharmacologiques et biologiques telles qu’anticancéreuse, mutagène, antioxydante, anti-inflammatoire, antiproliférative, immunostimulante, anticoagulante et antiplaquettaire, antiallergique, antibactérienne, antifongique (Pawlaczyk et al. ; Al-Snafi ; Kozuharova et al.). Récemment, la capacité radioprotectrice d’un complexe protéine-polysaccharide polyphénolique (PPP) isolé des parties florifères d’E. canadensis a été décrite (Zbikowska et al.).
Echinacea purpurea (L.) Moench (échinacée pourpre) est une plante médicinale traditionnellement utilisée pour la cicatrisation des plaies. Le traitement du rhume banal, de la toux, de la bronchite, des infections des voies respiratoires supérieures, de l’inflammation bactérienne des cavités nasale et buccale ainsi que du pharynx a été décrit (Percival ; Hudson). Les activités biologiques les plus importantes de l’herbe d’E. purpurea comprennent l’activité antioxydante, les activités antibactérienne et antifongique, les propriétés antivirale et moustiquicide, ainsi que des effets anti-inflammatoire, hypoglycémiant, antiprolifératif et anticancéreux (revu dans Manayi et al. 2014 ; Aarland et al. 2016 ; Sharifi-Rad et al.). De nos jours, plusieurs articles ont souligné l’activité efficace d’E. purpurea contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) (Aucoin et al. ; Nugraha et al. ; Khalifa et al. ; Nagoor Meeran et al.).
De nombreuses études chimiques, pharmacologiques et biologiques ont été menées pour identifier une variété de substances médicalement importantes chez les espèces d’Echinacea et leurs effets thérapeutiques possibles. Bien que de nombreux composés actifs de l’Echinacea aient été isolés et identifiés à ce jour, leurs activités biologiques possibles, leurs mécanismes d’action ou leurs effets synergiques restent inconnus. Les études résumées dans les revues (Liun et al. ; Wiesner et Knöss ; Dobrange et al. ; Percival) ont identifié les principaux principes actifs liés aux propriétés bénéfiques de la plante Echinacea. Les composés bioactifs des différentes parties d’E. purpurea sont connus pour leurs propriétés immunomodulatrices telles que le renforcement des réponses immunitaires, l’immunomodulation des immunocytes (par ex. monocytes, macrophages, cellules NKT, lymphocytes T et cellules dendritiques), la libération d’interleukines et de facteurs de croissance sélectionnés, le renforcement de la phagocytose, la modulation de la prolifération cellulaire (revu dans Manayi et al. 2014 ; El-Ashmawy et al.). En outre, l’Echinacea est connue pour induire des changements transcriptionnels activant des voies immunomodulatrices (Liun et al. ; Dobrange et al.).
La détection et la reconnaissance interactives plante-immunocytes au cours des réponses immunitaires innées sont assurées par des structures signatures conservées, spécifiques d’espèce (arabinogalactane, galactomannane, et d’autres). La détection immunitaire de ces motifs structuraux végétaux initie la signalisation cellulaire, aboutissant à l’activation de facteurs de transcription, de facteurs régulateurs de l’interféron, et à diverses réponses cellulaires, y compris la production d’interférons et de cytokines pro- et anti-inflammatoires. De plus, il a été montré que ces polysaccharides augmentent l’activité cytotoxique des immunocytes contre les cellules tumorales et les micro-organismes (Schepetkin et Quinn ; Mahla et al.). Les polysaccharides et leurs conjugués avec des protéines ou des composés phénoliques représentent un vaste groupe de macromolécules végétales qui, outre leur fonction structurale, présentent aussi un certain nombre de fonctions biologiques (Liun et al.).
Dans nos études antérieures (Pawlaczyk et al. ; Zbikowska et al.), les activités anticoagulante, antiplaquettaire et radioprotectrice des PPP isolés des parties florifères d’E. canadensis ont été préalablement étudiées. De plus, les effets pharmacologiques (antitussif, bronchodilatateur et anti-asthmatique) des PPP isolés des parties florifères d’E. purpurea et d’E. canadensis ont été décrits (Capek et al. ; Šutovská et al. , ). Il convient de souligner que l’isolement de ces complexes a été réalisé dans des conditions alcalines à chaud, afin d’isoler le matériel polymérique présentant la plus haute teneur possible en composés phénoliques et en acides uroniques (Pawlaczyk et al. ; Zbikowska et al.). Les deux complexes sont des polysaccharides, protéines et composés phénoliques interconnectés qui ne peuvent être séparés sans destruction des composants individuels.
L’objectif de cette étude était de comparer la composition chimique de deux complexes protéine-polysaccharide polyphénoliques isolés des parties florifères des plantes médicinales E. purpurea et E. canadensis, et de vérifier leurs éventuels effets immunomodulateurs sur les cellules de macrophages murins RAW 264.7, étant donné que ces complexes naturels n’avaient pas encore été testés pour leurs effets immunobiologiques, caractérisant les réponses immunitaires innées des macrophages.
Des parties florifères sèches d’Erigeron canadensis et d’Echinacea purpurea ont été obtenues respectivement sur le marché d’Europe centrale (F-DENTAL Hodonin s.r.o, République tchèque) et sur un marché de Wrocław, Pologne. L’identité des plantes a été certifiée par le Prof. Krystyna Kromer et le Dr Magdalena Mularczyk de l’Université de Wrocław, Pologne, et les spécimens de référence (voucher), n° 019361 pour E. canadensis et n° 011493 pour E. purpurea respectivement, ont été déposés au Jardin botanique de l’Université de Wrocław, Pologne. L’isolement des protéines-polysaccharides polyphénoliques d’E. purpurea et d’E. canadensis a été réalisé selon une procédure déjà décrite (Pawlaczyk et al. 2009).
L’isolement des protéines-polysaccharides polyphénoliques d’E. purpurea et d’E. canadensis a été exécuté selon la méthode décrite précédemment (Pawlaczyk et al. 2009).
La chromatographie par perméation de gel (GPC) des PPP d’E. canadensis et d’E. purpurea a été réalisée sur une colonne (15 × 1000 mm) de Sephacryl S300 HR. Le Sephacryl a été élué avec une solution de NaOH 0,1 M, à un débit de 0,3 mL/min. Les fractions ont été analysées par spectrophotométrie pour leur teneur en glucides et en composés phénoliques (Dubois et al. ; Singleton et al.). Pour évaluer le profil de distribution des masses moléculaires, la colonne GPC a été calibrée à l’aide de standards de dextran de Mp 1, 5, 12, 25, 50, 70 et 500 × 10³ g/mol.
Les teneurs en protéines, glucides, acides uroniques et composés phénoliques ont été estimées par les dosages au phénol–acide sulfurique, au réactif de Folin–Ciocalteu, au réactif de Lowry et au m-hydroxybiphényle, en utilisant respectivement comme composés de référence l’albumine sérique, le glucose, l’acide galacturonique et l’acide gallique (Lowry et al. ; Dubois et al. ; Blumenkrantz et Asboe-Hansen ; Singleton et al.). Les dosages colorimétriques ont été mesurés à l’aide d’un spectrophotomètre UV-VIS 1800 (Shimadzu, Japon).
Les PPP ont été hydrolysés avec du TFA 2 M pendant 1 h à 120 °C, et la détermination quantitative des sucres neutres a été réalisée sous forme de leurs acétates d’alditol par chromatographie en phase gazeuse sur un chromatographe en phase gazeuse TRACE Ultra (Thermo Scientific, USA) équipé d’une colonne capillaire en silice fondue SP-2330 (Supelco, USA) (30 m × 0,25 mm × 0,2 μm), avec un programme de température de 80 °C (4 min)—(8 °C/min)—160 °C (4 min)—(4 °C/min)—250 °C (20 min) ; le débit d’hélium était de 0,4 mL/min. Le chromatographe en phase gazeuse était couplé à un spectromètre de masse TSQ Quantum XLS (Thermo Scientific, USA) avec ionisation EI sous une énergie électronique standard de 70 eV, un courant d’émission de 25 μA, une température de source d’ions de 200 °C. Un mélange d’acétates d’alditol de Rha, Fuc, Rib, Ara, Xyl, Man, Gal et Glc a été utilisé comme standard.
Des macrophages de la lignée cellulaire RAW 264.7 (macrophages murins) (ECACC, Salisbury, Royaume-Uni) ont été cultivés dans du DMEM complet pendant 24 h (jusqu’à une confluence d’environ 80 %) à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂. La viabilité cellulaire a été évaluée par la méthode d’exclusion au bleu Trypan à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé TC20™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). L’inoculum initial de 1 × 10⁵ cellules/mL/puits (avec 93,1 % de viabilité) a été ensemencé sur plaque de culture cellulaire à 24 puits (Sigma-Aldrich, USA), et exposé à 100 μg par puits de complexes PPP d’Erigeron (EC) et d’Echinacea (EP) pendant 24 et 48 h. Les cellules sensibilisées ont été soumises à une évaluation par cytométrie en flux de l’activité phagocytaire et au phénotypage. L’expression de surface des antigènes des macrophages F4/80 et CD11b a été utilisée pour déterminer la diversité phénotypique. Les milieux de culture ont été conservés à −20 °C jusqu’à utilisation ultérieure.
La prolifération cellulaire et la cytotoxicité des cellules de macrophages RAW 264.7 induites par l’exposition aux complexes PPP d’Erigeron (EC) et d’Echinacea (EP) ont été évaluées par mesure bioluminescente de l’adénosine triphosphate (ATP) à l’aide du kit ViaLight™ plus (Lonza, USA) selon les instructions du fabricant. L’intensité de la lumière émise a été mesurée avec un lecteur multimode d’imagerie cellulaire Cytation 5 (BioTek Instruments, Inc., USA). L’émission de lumière, exprimée en unités de lumière relatives (RLU), a été enregistrée en continu pendant une seconde et évaluée sur la base des valeurs de pic. La prolifération des cellules non stimulées a été considérée comme valeur de référence (baseline). L’indice de prolifération a été déterminé comme le rapport entre la prolifération induite (cellules exposées) et la prolifération de référence (cellules non exposées).
Les taux d’interleukines et de facteurs de croissance dans les surnageants de culture cellulaire après exposition aux PPP d’Erigeron (EC) et d’Echinacea (EP) ont été déterminés par méthode ELISA (Quantikine ELISA® Mouse M-CSF (R&D, USA) ; Platinum ELISA : Mouse MCP-1, Mouse IL-12, Mouse GM-CSF, Mouse IL-17, Mouse IL-2 et Mouse IL-6 ; Instant ELISA® : Mouse IL-1β, Mouse TNF-α, Mouse IL-10 (e-Bioscience, USA)) selon les instructions du fabricant.
Les surnageants de culture cellulaire après traitement des cellules RAW 264.7 par les PPP d’Erigeron (EC) et d’Echinacea (EP) ont été analysés pour leur teneur totale en radicaux libres (kit Radicaux libres ; Sedium R&D, République tchèque). Le dosage repose sur la capacité de la chlorophylline à transférer des électrons grâce à sa structure riche en doubles liaisons électroniquement denses. La quantification des radicaux libres a été réalisée à l’aide d’une calibration basée sur un déplacement réactif Fe²⁺/Fe³⁺ et a été exprimée en mmol/L de Fe²⁺. La production de radicaux libres des cellules non stimulées a été utilisée pour déterminer la valeur de référence.
Les cellules RAW 264.7, exposées aux complexes PPP d’Erigeron (EC) et d’Echinacea (EP), ont été soumises à une immuno-cytométrie en flux à l’aide d’un cytomètre en flux Beckman Coulter FC 500 équipé du logiciel CXP (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Les fenêtres (gates) ont été réglées pour exclure les débris et les cellules endommagées par discrimination FSC vs SSC. Les réglages ont été optimisés à l’aide d’un contrôle isotypique approprié (test d’immunophénotypage) et d’un conjugué FITC de C. albicans (phagocytose). Pour chaque échantillon, des histogrammes de fluorescence de 10 000 cellules (immunophénotypage) ou de 5 000 cellules (phagocytose) ont été générés et analysés (fluorescence verte, filtre passe-bande à 525 nm, canal FL1). Tous les échantillons ont été analysés en duplicatas. Les données sont exprimées en pourcentage (moy. % ± ET) ou en moyenne d’intensité de fluorescence (MFI ± ET).
La phagocytose des macrophages RAW 264.7 a été évaluée par immuno-cytométrie en flux (CytoFLEX, Beckman Coulter Life Sciences, Inc., Indianapolis, USA). Pour chaque échantillon, un histogramme de fluorescence de 5 000 cellules a été généré et analysé. Les fenêtres (gates) ont été réglées autour de la population de macrophages pour exclure les débris. La phagocytose, c’est-à-dire l’ingestion de cellules de levure Candida albicans, a eu lieu dans des conditions contrôlées à l’aide d’un C. albicans marqué à la fluorescéine. Des aliquotes (30 μL) de cellules post-exposées ont été incubées avec du C. albicans–FITC (3 µL) pendant 15 min à 37 °C. Après traitement, la réaction a été stoppée sur glace. Le pourcentage moyen de cellules phagocytaires représente le pourcentage de cellules ingérant au moins une cellule de C. albicans–FITC.
Les résultats des expériences in vitro avec les cellules RAW 264.7 ont été évalués sous forme de valeurs Moyenne ± ET à partir de deux réplicats biologiques et trois réplicats techniques. La normalité de la distribution des données a été évaluée selon le test de Shapiro–Wilk au seuil de signification de 0,05. La comparaison statistique a été réalisée à l’aide d’une ANOVA à un facteur et des tests post hoc de Bonferroni. Les résultats étaient significatifs si les différences égalaient ou dépassaient le niveau de confiance de 95 % (P < 0,05). Les statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel ORIGIN 2018 (OriginLab Corporation, Northampton, Massachusetts, USA). Le coefficient de corrélation de Pearson a été utilisé pour comparer la force de la relation entre les variables immunobiologiques.
Les parties florifères séchées à l’air des plantes médicinales E. purpurea (EP) et E. canadensis (EC) ont été broyées en poudre et soumises à des traitements alcalins à chaud afin d’obtenir des complexes protéine-polysaccharide polyphénoliques (PPP) présentant la plus haute teneur possible en composés phénoliques et en acides uroniques. Il a été constaté que ces composés polymériques possèdent des effets anticoagulant, antiplaquettaire et radioprotecteur intéressants (Pawlaczyk et al. ; Zbikowska et al.). Les PPP, de couleur brun foncé, ont été isolés avec des rendements de 1,8 % en poids (EP) et 0,9 % en poids (EC) des matières végétales séchées. En analyse HPLC, ils présentaient des masses moléculaires (Mw) de 10 000 (EP) et 38 000 g/mol (EC) (Pawlaczyk et al. 2009 ; Šutovská et al. , Šutovská et al.). Les analyses de composition des PPP d’Echinacea et d’Erigeron ont révélé la présence de glucides, de composés phénoliques, de protéines et d’acides uroniques (Tableau). [ ]
Il ressort du Tableau que les deux complexes PPP diffèrent par leurs teneurs en protéines, en composés phénoliques et en acides uroniques. Une différence relativement significative a été enregistrée dans le cas des rendements, par ex. le complexe d’Echinacea a montré un rendement deux fois plus élevé que celui d’Erigeron, mais dans le cas de la masse moléculaire c’était l’inverse, le complexe d’Erigeron ayant une masse moléculaire nettement plus élevée. Pour vérifier l’homogénéité, c’est-à-dire s’il s’agit d’un mélange ou d’un composé unique, les PPP ont été analysés par chromatographie par perméation de gel. L’analyse a montré que les deux complexes PPP ont un caractère macromoléculaire, les composantes polysaccharidique et polyphénolique ayant la même mobilité, indiquant leur interconnexion. Ceci est également confirmé par le fait que si les composés polyphénoliques n’étaient pas liés au squelette polysaccharidique, ils seraient insolubles (Fig.). [ ]
Les analyses des monosaccharides des complexes PPP ont montré la prédominance de quatre constituants glucidiques, à savoir les acides uroniques, le galactose, l’arabinose et le rhamnose, indiquant la dominance de l’arabinogalactane (56 %) associé au rhamnogalacturonane (30 %) chez Echinacea. D’autres sucres tels que le fucose, le xylose, le mannose et le glucose, issus d’autres types mineurs de polysaccharides, ont été trouvés en quantités bien moindres (Tableau). La composition monosaccharidique de la partie glucidique du PPP d’Erigeron différait de celle d’Echinacea principalement par la teneur en rhamnose, galactose, glucose et acide uronique. Il a été montré que le PPP d’Erigeron présentait des taux plus élevés de résidus de galactose et de glucose, et une teneur en rhamnose bien plus faible, tandis que les quantités des autres monosaccharides étaient comparables à celles du complexe d’Echinacea. D’après l’analyse des sucres, le principal composant polysaccharidique du PPP d’Erigeron semble être l’arabinogalactane (~ 65 %), tandis que la teneur en polysaccharide acide est significativement plus faible (~ 10 %) que dans le complexe d’Echinacea (Tableau). Il apparaît que les PPP étudiés diffèrent principalement par la teneur en composants polysaccharidiques dominants, à savoir l’arabinogalactane et un hétéropolysaccharide acide, c’est-à-dire le rhamnogalacturonane et le glucuronoxylane.
Une caractéristique des arabinogalactanes est la présence de protéines liées aux fractions saccharidiques. De même, des composés phénoliques peuvent être attachés aux chaînes latérales du matériel pectique (arabinogalactane-rhamnogalacturonane, RG-I) par des liaisons covalentes et ester, et former un complexe composé de polysaccharides, de protéines et de composés phénoliques. Les produits naturels testés sont des polysaccharides, protéines et composés phénoliques interconnectés qui ne peuvent être séparés sans détruire les composants individuels.
La capacité des complexes PPP d’Echinacea et d’Erigeron à moduler la prolifération des cellules de macrophages RAW 264.7 a été évaluée à l’aide de l’indicateur de viabilité cellulaire adénosine triphosphate, par le kit de bioluminescence ViaLight™ plus (Fig.). La prolifération cellulaire des cellules exposées aux PPP d’Echinacea et d’Erigeron a été suivie après 24 h et 48 h. De toute évidence, les deux formules ont reflété après 24 h d’exposition cellulaire un profil antiprolifératif comparable (p < 0,01) par rapport aux cellules de référence non traitées. Le traitement pendant les 24 h suivantes a exercé une tendance croissante par rapport aux valeurs des cellules de référence non traitées, c’est-à-dire que pour le complexe d’Echinacea le rapport entre cellules exposées et non exposées était de 0,9777, et de 1,001 pour le complexe d’Erigeron. En revanche, le mitogène cellulaire concanavaline A (ConA) a augmenté la prolifération des cellules de macrophages RAW 264.7 d’un facteur 1,25 après 24 h de traitement, et d’un facteur 1,4 après les 24 h suivantes. L’impact du temps d’exposition à la ConA sur la prolifération cellulaire a dépassé les rapports des deux PPP d’Echinacea et d’Erigeron : rapport Echinacea vs ConA 0,53 (24 h) et 0,67 (48 h), et rapport Erigeron vs ConA 0,54 (24 h) et 0,71 (48 h). [ ]
Les milieux de culture après 24 h et 48 h d’exposition des cellules RAW 264.7 aux PPP d’Echinacea et d’Erigeron ont été soumis à l’analyse des cytokines pro-inflammatoires TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-2, IL-12 et IL-17, de l’interleukine anti-inflammatoire IL-10, et des facteurs de croissance GM-CSF et M-CSF (Fig.). Les PPP d’Echinacea et d’Erigeron ont induit, après 24 h d’exposition cellulaire, l’augmentation la plus significative de la production d’IL-6 : pour Erigeron : facteur 528,168, p = 2,52E−08 et pour Echinacea : facteur 563,867, p = 7,60E−09. La libération significative suivante dans le milieu a été notée pour le TNF-α : facteur 36,843, p = 4,67E−10 pour Erigeron, et facteur 27,718, p = 4,86E−09 pour Echinacea, par rapport aux valeurs de référence. Une autre induction efficace a été démontrée pour l’IL-12 : pour Erigeron facteur 20,704, p = 1,58E−07, et pour Echinacea facteur 15,295, p = 1,99E−06. L’augmentation inductive de la libération cellulaire de l’IL-10 anti-inflammatoire a été révélée après exposition à Echinacea : facteur 28,897, p = 1,64E−09, dans une moindre mesure après exposition à Erigeron : facteur 12,814, p = 1,49E−06. [ ]
L’exposition prolongée aux deux formules pendant les 24 h suivantes a révélé les tendances croissantes de l’IL-6, pour Erigeron : facteur 621,086, p = 2,62E−10 et pour Echinacea : facteur 629,297, p = 2,36E−10. L’augmentation suivante à 48 h a été observée dans la libération d’IL-12 : pour Erigeron facteur 45,419, p = 6,09E−10 et pour Echinacea facteur 41,358, p = 1,31E−09, comparativement à la culture cellulaire non traitée. Seule une légère augmentation de la libération cellulaire d’IL-1α a été déterminée, pour Erigeron facteur 1,566, p = 0,00243 et pour Echinacea facteur 1,798, p = 1,99E−04. La comparaison entre la production de cytokines à 24 et 48 h a révélé des tendances croissantes, en particulier après 48 h de traitement par Echinacea pour l’IL-12 : facteur 2,274, le TNF-α : facteur 1,581, l’IL-2 : facteur 1,444, l’IL-17 : facteur 1,442 et l’IL-1β : facteur 1,252, par rapport aux valeurs à 24 h.
La détermination de la force d’association entre les libérations de cytokines induites par l’exposition à Erigeron a révélé la corrélation la plus étroite entre l’IL-2 et l’IL-10 (r = 0,99992, p = 8,36E−05), l’IL-2 et l’IL-17 (r = 0,99276, p = 0,00724) et pour le GM-CSF et l’IL-12 (r = 0,99798, p = 0,00202).
Pour Echinacea, un profil différent a été établi — la corrélation la plus étroite était entre les cytokines pro-inflammatoires TNF-α et IL-17 (r = 0,99996, p = 3,97E−05), TNF-α et IL-2 (r = 0,99994, p = 5,90E−05), TNF-α et IL-12 (r = 0,99932, p = 6,79E−04), et TNF-α et IL-1β (r = 0,99848, p = 0,00152). D’autres corrélations significatives ont également été établies pour l’IL-1β et l’IL-17 (r = 0,99872, p = 0,00128), l’IL-1β et l’IL-2 (r = 0,99878, p = 0,00122) et l’IL-1β et l’IL-12 (r = 0,99593, p = 0,00407). La production d’IL-10 est fortement associée à la libération cellulaire des facteurs de croissance M-CSF (r = 0,99998, p = 2,26E−05) et GM-CSF (r = 0,99915, p = 8,54E−04).
Le profil temps-dépendant de l’efficacité phagocytaire des macrophages RAW 264.7 avait révélé une accélération significative du nombre de cellules phagocytaires, en particulier après exposition à Erigeron : facteur 1,17 après 24 h par rapport au témoin non traité et facteur 1,12 après 48 h (p < 0,01) (Fig.). Des résultats similaires de phagocytose cellulaire ont été observés avec l’exposition à Echinacea : après 24 h d’exposition, le rapport entre cellules témoins et cellules exposées a été significativement augmenté d’un facteur 1,088 et, après traitement prolongé jusqu’à 48 h, une augmentation d’un facteur 1,12 (p < 0,01) a été détectée. L’analyse de corrélation globale des interactions concernant la période d’exposition et l’étendue de la phagocytose a soutenu une forte corrélation r = 0,99 entre les PPP d’Echinacea et d’Erigeron. [ ]
Les données présentées suggèrent une efficacité modérément renforcée de l’exposition à Erigeron par rapport à l’exposition à Echinacea, le rapport Erigeron/Echinacea étant de 1,077 à 24 h et de 1,03 à 48 h. Les différences entre 24 et 48 h ont révélé une augmentation d’un facteur 1,04 pour Erigeron et de 1,08 pour Echinacea (p < 0,01). De toute évidence, l’exposition plus longue à Echinacea a potentialisé l’activité phagocytaire des macrophages.
L’exposition des macrophages RAW 264.7 aux PPP d’Erigeron et d’Echinacea avait révélé une induction significative des radicaux libres libérés par les cellules, en particulier après exposition à Erigeron : facteur 1,22 après 24 h par rapport au témoin non traité et facteur 1,14 après 48 h (p < 0,01) (Fig.). Avec l’exposition à Echinacea pendant 24 h, le rapport entre cellules témoins et cellules exposées était plus faible, représentant 81,1 % des valeurs d’EC, et a augmenté significativement jusqu’à 90,17 % après un traitement prolongé de 48 h. Le rapport entre les valeurs d’Erigeron et d’Echinacea de la libération inductive de radicaux libres a été d’un facteur 1,23 après 24 h et d’un facteur 1,11 après 48 h d’exposition. De toute évidence, Erigeron est plus efficace pour accélérer la production de radicaux libres qu’Echinacea. En ce qui concerne le traitement prolongé, les valeurs à 48 h ont dépassé les valeurs à 24 h, davantage pour Echinacea c’est-à-dire un facteur 1,14 et pour Erigeron c’est-à-dire un facteur 1,03 d’augmentation. [ ]
Comme l’ont montré les analyses chimiques, les PPP isolés des parties florifères d’E. purpurea (Ep) et d’E. canadensis (Ec) diffèrent chimiquement par la teneur en composants individuels, c’est-à-dire en phénols, glucides et protéines. La chromatographie sur gel des complexes PPP a indiqué un caractère macromoléculaire des biopolymères étudiés. Les composantes polysaccharidique et polyphénolique se sont révélées avoir la même mobilité, indiquant qu’elles sont interconnectées. Les fractions glucidiques ont montré des différences dans la teneur des monosaccharides individuels impliqués dans leurs structures. En outre, des différences dans la teneur en arabinogalactanes et en hétéropolysaccharides acides ont été déterminées dans les PPP. Dès lors, la question se pose de savoir si ces différences structurales dans leurs fractions polysaccharidiques peuvent également refléter des différences dans leurs effets immunobiologiques.
Conformément à cela, l’évaluation sélectionnée de l’activité immunobiologique des complexes PPP d’Echinacea et d’Erigeron dans les cellules de macrophages RAW 264.7 a comporté la détermination de la prolifération cellulaire, de la phagocytose cellulaire, de la libération de radicaux libres, et de la production d’interleukines inflammatoires et anti-inflammatoires ainsi que de facteurs de croissance.
Nos résultats (Fig.) concordent avec l’observation de Roesler et al. (1991) démontrant l’augmentation de la prolifération cellulaire basée sur l’incorporation de ³H-thymidine dans les monocytes de souris C3H/HeJ et BALB/c après exposition à des polysaccharides xyloglucane et arabinogalactane purifiés à partir d’Echinacea. Classen et al. (2006) ont observé une réduction de la prolifération induite par l’arabinogalactane d’Echinacea comparativement à la ConA dans des cellules de rate de souris C3H/HeJ (Classen et al. 2006). L’exposition cellulaire aux deux PPP a exercé un profil comparable, une prolifération cellulaire diminuée par rapport à celle induite par la ConA (Fig.). Yang et al. ont montré que des concentrations de 0,0039–0,5 mg/mL de polysaccharides bruts d’Echinacea tétraploïde et diploïde pouvaient favoriser la prolifération de lymphocytes de rate de souris normaux stimulés par la ConA. De plus, la stimulation de la prolifération des lymphocytes T par la fraction polysaccharidique d’Echinacea (M 5 000–50 000) avait été démontrée. Les poudres d’herbe et de racine d’Echinacea ont renforcé la prolifération des PBMC humaines in vitro (Rininger et al.). Un effet antiprolifératif d’Echinacea a été rapporté avec les lignées cellulaires MCF-7, HeLa et HCT-15 (Aarland et al.). L’activité antiproliférative et inhibitrice de la croissance cellulaire d’Erigeron a été étudiée contre des lignées de cellules cancéreuses telles que HeLa, A431 et MCF7 (Kozuharova et al.).
De manière générale, les interleukines et les facteurs de croissance sont des modulateurs essentiels des réponses immunitaires engagés dans divers processus du système immunitaire, tels que l’activation et la prolifération cellulaires, la signalisation, la polarisation, la phagocytose et l’inflammation, au sein d’un réseau complexe d’interactions de cellules immunitaires cibles. Par conséquent, ces indicateurs polyvalents de la polarisation cellulaire reflètent le mode et l’efficacité de la réactivité des cellules immunocompétentes.
L’évaluation immunobiologique de l’impact des PPP d’Echinacea et d’Erigeron sur les RAW 264.7 a révélé une induction efficace des réponses Th1 (TNF-α, IL-10, IL-12) et Th2 (IL-6) et la libération de cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12) ainsi qu’anti-inflammatoire (IL-10). La libération de cytokines la plus élevée après exposition à EP et EC a été déterminée pour le TNF-α et l’IL-6, molécules inflammatoires extrêmement puissantes, cytokines primaires médiant l’inflammation aiguë (Fig.). Ce fait, associé à la libération induite de radicaux libres, a soutenu l’immunomodulation cellulaire efficace après exposition aux PPP d’EP et d’EC. De plus, les effets régulateurs de l’IL-6 impliquent l’inhibition de la libération cellulaire de TNF-α, fournissant ainsi un rétrocontrôle négatif pour limiter la réponse inflammatoire aiguë. L’IL-6 est fréquemment utilisée comme marqueur de l’activation systémique des cytokines pro-inflammatoires suivantes.
La cytokine suivante, fortement induite, l’IL-12 (Fig.), est produite par les cellules présentatrices d’antigènes et joue un rôle critique dans la défense de l’hôte contre l’infection microbienne intracellulaire via sa capacité à stimuler les cellules effectrices immunitaires à la fois innées et adaptatives. Dans la plupart des infections, l’IL-12 régule l’ampleur de la réponse IFN-γ à l’initiation de l’infection, potentialisant ainsi la résistance naturelle, favorisant le développement des cellules Th1 et inhibant les réponses Th2. Par conséquent, l’induction temps-dépendante efficace de la libération d’IL-12 par les PPP d’Echinacea et d’Erigeron (p < 0,001) est une observation importante, suggérant une accélération de l’immunité cellulaire. Nos résultats avec les PPP d’Echinacea concordent avec des constatations publiées antérieurement démontrant que l’accélération de la libération in vitro de TNF-α par les macrophages RAW 264.7 correspondait à la concentration en extraits d’Echinacea (Lee et al.). L’arabinogalactane représentait le principal polysaccharide du PPP d’Echinacea (Tableau). Des macrophages périphériques de souris traités avec de l’arabinogalactane (10–100 µg/mL) ont présenté une induction de TNF-α et d’IL-6, et il a été montré que l’arabinogalactane était mitogène dans les splénocytes et les macrophages périphériques de souris (Choi et al.). L’augmentation de la production de TNF-α, IL-6 et IL-1α par des monocytes humains soumis aux polysaccharides xyloglucane et arabinogalactane (2:1) isolés de cultures cellulaires du complexe EP a été démontrée (Roesler et al. 1991). Fait intéressant, l’arabinogalactane issu de culture cellulaire d’Echinacea a démontré une faible stimulation de la production d’IL-6 dans une culture de macrophages alvéolaires de souris (Roesler et al. 1991, Yang et al.). L’induction des macrophages, et l’augmentation de la production de TNF-α, IL-1 et interféron-β2 par l’arabinogalactane acide d’Echinacea a été décrite (Luettig et al.). Des augmentations significatives de l’IL-2 circulante ont été trouvées chez des rats après traitement avec les parties aériennes d’Echinacea (Cundell et al.). Plusieurs études d’extraits d’Echinacea cultivés avec des macrophages de souris et humains ont rapporté une production significativement augmentée d’IL-1, TNF-α, IL-6 et IL-10 par rapport au témoin non traité (Aarland et al.). L’augmentation de la production à 24 h de GM-CSF et M-CSF induite par Echinacea, dépassant celle d’Erigeron, a été révélée (Fig.). Nous avons observé une production induite d’IL-17 (p < 0,001) après le traitement cellulaire prolongé de 48 h par Echinacea. Park et al. ont décrit que la formule d’Echinacea (EFLA®894) induit l’expression de l’ARNm d’IL-17, IL-6 et IL-10 dans la rate de souris Balb/c présentant une immunosuppression induite par un stress de contention, et que ces cytokines pourraient avoir des effets bénéfiques. L’induction d’IL-17 après exposition d’EP et d’EC des cellules RAW 264.7 (Fig.) est importante, car l’interleukine-17 est une cytokine pro-inflammatoire aux effets variés sur les cellules immunitaires innées. L’IL-17 induit la production du facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF) et des chimiokines CXCL1 et CXCL2. Au cours de l’infection, l’IL-17 est engagée dans l’élimination des bactéries et champignons extracellulaires, en induisant des peptides antimicrobiens. Les mécanismes anti-inflammatoires de l’extrait d’Erigeron sur la stimulation des cellules A549 induite par le TNF-α, l’IL-4 et l’IL-1β ont été étudiés (Sohn et al.). Ils ont révélé que des gènes liés à l’inflammation tels que NOS1, NOS2A, IL-1β, IL-8 et CSF2, ainsi que des gènes liés à l’adhésion cellulaire tels que SELE, MMP3, VCAM1, ICAM1, ITGA7 et ITGB2, étaient sous-régulés (downregulated) dans les cellules A549 traitées par Erigeron qui avaient été prétraitées avec le TNF-α, l’IL-4 et l’IL-1β (Sohn et al.).
Nos expériences ont révélé que le traitement des cellules RAW 264.7 avec le complexe PPP d’Erigeron a induit une libération dans le milieu de TNF-α et d’IL-1β dans une moindre mesure comparativement au traitement avec le complexe PPP d’Echinacea (Fig.).
Fondamentalement, la phagocytose cellulaire représente le processus fonctionnel complexe d’engloutissement, d’ingestion et d’élimination des pathogènes, des cellules apoptotiques et des grosses particules étrangères > 0,5 μm. La phagocytose est exécutée par les phagocytes professionnels tels que les macrophages, les neutrophiles, les cellules dendritiques, etc., et elle est fondamentale pour l’homéostasie tissulaire globale, engagée dans plusieurs aspects des réponses inflammatoires et immunitaires, comprenant l’induction de la génération d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote, et de cytokines pro-inflammatoires. Par conséquent, le mode de modulation du processus de phagocytose par divers immunomodulateurs est important. La stimulation de la phagocytose des granulocytes humains (Borchers et al.) et de la phagocytose des cellules mononucléées du sang périphérique (Rininger et al.) par les matières premières d’Echinacea a été documentée (Borchers et al. ; Rininger et al.). Ensuite, l’effet stimulateur des polysaccharides bruts d’Echinacea sur la digestion cellulaire simulée a également été observé dans des macrophages murins (Yang et al.) ; ces résultats concordent avec les données résultant de l’exposition directe des cellules RAW à Echinacea (Fig.). La phagocytose renforcée des macrophages de moelle osseuse murine avec un extrait enrichi en polysaccharides d’Echinacea (100 μg/mL) a été révélée (Fu et al.). Des macrophages traités avec 10–100 μg/mL d’arabinogalactane ont présenté une phagocytose augmentée (Choi et al.). La stimulation de la phagocytose par des composants polysaccharidiques aqueux tels que l’arabinogalactane d’Echinacea sp. a été rapportée (Luettig et al. ; Bauer et al. ; Roesler et al. 1991). Ainsi, nous pourrions suggérer que la fraction arabinogalactane des PPP d’EP et d’EC a soutenu l’immunostimulation de la phagocytose des macrophages RAW 264.7 après exposition aux PPP d’EP et d’EC (Fig.).
La génération d’espèces réactives de l’oxygène, d’espèces réactives de l’azote et de radicaux libres au cours des différentes conditions physiopathologiques est responsable du stress oxydatif global. Le stress oxydatif représente un processus complexe caractérisant le déséquilibre entre la formation de radicaux libres et la capacité de l’organisme à éliminer ces espèces réactives par des antioxydants endogènes et exogènes. Les espèces réactives de l’oxygène et les radicaux libres peuvent provoquer de grandes réactions chimiques en chaîne dans l’organisme et sont potentiellement inducteurs de lésions tissulaires (Bauer et al.). Ainsi, l’évaluation du stress oxydatif et du mode par lequel les antioxydants sont capables de prévenir les lésions tissulaires par la régulation des voies de transduction du signal et de l’expression génique aux niveaux cellulaire et tissulaire revêt de l’importance. L’activité antioxydante des polysaccharides d’Echinacea a été soutenue par l’étude de Lee et al. (2009). Ensuite, l’effet antioxydant des conjugués polyphénolique-polysaccharide d’Erigeron et d’autres plantes médicinales sélectionnées a été démontré par Saluk-Juszczak et al. (et).
La sécrétion de radicaux oxygénés par les macrophages activés avec des polysaccharides purifiés d’Echinacea a été augmentée (Stimpel et al. ; Choi et al.).
Dans nos expériences, l’augmentation significative des radicaux libres au-delà de la valeur physiologique (p < 0,01) a été observée avec le complexe PPP d’Echinacea (Fig.). Cette observation, associée à l’augmentation de l’activité phagocytaire et à la stimulation des cytokines pro-inflammatoires, représente le rôle prometteur des PPP d’EP et d’EC dans la défense immunitaire. Hou et al. ont révélé une réduction in vitro et in vivo du stress oxydatif par un polysaccharide d’Echinacea (2020). Mishima et al. ont observé, dans le cas de la leucopénie induite par irradiation, une augmentation de l’activité antioxydante du sang périphérique de souris par Echinacea, suggérant une relation entre l’effet suppresseur sur la leucopénie induite par irradiation et l’effet antioxydant d’Echinacea.
Des complexes protéine-polysaccharide polyphénoliques ont été isolés des parties florifères d’E. purpurea et d’E. canadensis dans des conditions fortement alcalines afin d’obtenir des matériaux polymériques à haute teneur en composés phénoliques et en acides uroniques. Les arabinogalactanes associés à des polysaccharides acides étaient les polysaccharides majeurs des deux complexes PPP. Il semble que la charge relativement élevée des chaînes polymériques soit responsable de leurs effets biologiques tels qu’anticoagulant ou antiplaquettaire. Elle pourrait également affecter les propriétés immunologiques des complexes. L’évaluation immunobiologique in vitro des deux complexes PPP dans les cellules RAW 264.7 a démontré une immunomodulation efficace concernant l’induction de la libération d’interleukines et de facteurs de croissance, la prolifération cellulaire, la phagocytose et la libération de radicaux libres. L’exposition in vitro des cellules RAW 264.7 aux complexes PPP d’Echinacea et d’Erigeron a révélé une induction efficace des réponses Th1 (TNF-α, IL-10, IL-12) et Th2 (IL-6) et la libération de cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12) ainsi qu’anti-inflammatoire (IL-10). Ensuite, les deux formules ont reflété, après 24 h et 48 h d’exposition cellulaire, le profil antiprolifératif. Le profil temps-dépendant de l’efficacité phagocytaire des macrophages RAW 264.7 avait révélé une accélération significative du nombre de cellules phagocytaires, en particulier après exposition au PPP d’Erigeron. Une induction significative temps-dépendante des radicaux libres libérés par les cellules, en particulier après exposition à Erigeron, a été révélée. Selon ces résultats, les complexes végétaux isolés sont des composés immunomodulateurs prometteurs pour de futures études immunobiologiques et immunotoxicologiques in vitro et in vivo. D’après l’immunomodulation des cytokines, l’induction de la phagocytose et l’activité antiproliférative, les complexes PPP d’E. purpurea et d’E. canadensis représentent des macromolécules naturelles intéressantes, avec une application thérapeutique ou prophylactique potentielle comme remède végétal immunomodulateur.
Encart — synthèse : Composés étudiés = complexes protéine-polysaccharide polyphénoliques (PPP) isolés en milieu alcalin à chaud des parties florifères ; chez Erigeron canadensis (vergerette du Canada), la fraction glucidique est dominée par l’arabinogalactane (~ 65 %), avec peu de polysaccharide acide (~ 10 %), une masse moléculaire élevée (38 000 g/mol) et un rendement de 0,9 %. Activité : immunomodulation in vitro sur macrophages murins RAW 264.7 — forte induction des cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12) et de l’anti-inflammatoire IL-10, des facteurs de croissance (M-CSF, GM-CSF), accélération de la phagocytose et de la libération de radicaux libres, effet antiprolifératif ; le stress oxydatif/radicalaire renvoie à l’axe Antioxydant (effet antioxydant des conjugués polyphénol-polysaccharide d’Erigeron, Saluk-Juszczak et al.). Place de la vergerette : E. canadensis est l’une des deux plantes comparées (avec E. purpurea) ; elle s’est montrée plus efficace qu’Echinacea pour accélérer la phagocytose et la production de radicaux libres, mais induit un peu moins de TNF-α et d’IL-1β. Niveau de preuve : étude expérimentale in vitro (lignée cellulaire de macrophages de souris), 2 réplicats biologiques × 3 techniques ; pas de données cliniques humaines. ↩ Retour : Vergerette du Canada · Antioxydant · Index : _INDEX études vergerette du Canada (accès libre)