Référence : Molecules 2018. — PMC6225355 · DOI 10.3390/molecules23092164 Type : étude in vitro · Plante : Origan vulgaire · Propriété → Peau Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Les antibiotiques sont souvent prescrits dans le traitement de l’acné ; toutefois, Propionibacterium acnes et Staphylococcus epidermidis, deux des principales bactéries associées à l’acné, ont développé une résistance aux antibiotiques. Les huiles essentielles (HE) constituent une solution thérapeutique alternative naturelle, sûre, efficace et multifonctionnelle. Cette étude visait à évaluer l’activité antiacnéique potentielle de sept HE sélectionnées, couramment utilisées en médecine populaire méditerranéenne. Le criblage de l’activité antimicrobienne de ces huiles a montré que l’origan présentait l’activité antimicrobienne la plus forte, avec une concentration minimale inhibitrice (CMI) de 0,34 mg/mL et une concentration minimale bactéricide (CMB) de 0,67 mg/mL contre P. acnes, ainsi qu’une CMI de 0,67 mg/mL et une CMB de 1,34 mg/mL contre S. epidermidis. La composition des HE les plus efficaces, celles d’origan et de thym, a été déterminée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). Les phénols monoterpénoïdes prédominaient dans les HE d’origan et de thym, le thymol représentant respectivement 99 % et 72 %. Le thymol présentait une CMI de 0,70 mg/mL contre P. acnes et S. epidermidis, tandis que sa CMB était respectivement de 1,40 et 2,80 mg/mL contre P. acnes et S. epidermidis. En outre, l’origan présentait l’effet antibiofilm le plus puissant contre S. epidermidis, avec une concentration minimale inhibitrice du biofilm (CMIB) de 1,34 mg/mL et des temps de destruction de 12 et 8 h contre P. acnes et S. epidermidis, respectivement. L’origan, l’HE la plus efficace, a été formulé puis testé sous forme de nanoémulsion dans un modèle murin animal d’acné. La formulation a présenté des effets cicatrisants et antimicrobiens supérieurs à ceux de l’antibiotique de référence. Dans leur ensemble, nos données suggèrent que la nanoémulsion d’huile d’origan constitue une solution naturelle et efficace potentielle pour traiter l’acné et surmonter la résistance émergente aux antibiotiques.
L’acné vulgaire est la huitième maladie la plus répandue et la deuxième maladie cutanée la plus fréquente dans le monde. Les adolescents des deux sexes sont généralement touchés par l’acné. Chez les adolescents, l’acné peut provoquer des troubles psychologiques et, dans les cas graves, conduire à la dépression.
L’acné est une maladie multifactorielle caractérisée par une altération pathologique des unités pilo-sébacées du cou et de la partie supérieure du tronc. Elle entraîne la formation de comédons non inflammatoires et de lésions inflammatoires telles que des papules, des pustules et des nodules. Deux bactéries sont associées à la pathogenèse de l’acné : Propionibacterium acnes et Staphylococcus epidermidis. Ces bactéries font partie du microbiote normal de la peau humaine, mais, en cas de dysbiose, l’infection des unités pilo-sébacées peut conduire à l’acné. Par conséquent, la plupart des médicaments antiacnéiques ciblent l’infection par P. acnes et S. epidermidis ainsi que les réponses inflammatoires associées.
Le traitement antiacnéique comprend des thérapies systémiques et topiques. Les traitements topiques comprennent des agents comédolytiques, des agents anti-inflammatoires et des antibiotiques. Une résistance bactérienne accompagne l’utilisation d’antibiotiques topiques contre l’acné. La résistance à ces antibiotiques est attribuée à de multiples facteurs, notamment l’emploi répété d’un seul antibiotique, l’utilisation de concentrations sub-inhibitrices ou un usage prolongé.
Afin de surmonter la résistance émergente aux antibiotiques conventionnels, des agents antimicrobiens naturels de substitution ont été étudiés. Les huiles essentielles de plantes aromatiques telles que l’origan, l’arbre à thé, la citronnelle et le thym possèdent des activités antimicrobiennes permettant leur utilisation comme solution naturelle de substitution. L’activité antimicrobienne de ces HE est attribuée à leurs principaux constituants, les phénols monoterpénoïdes. En outre, des constituants minoritaires des HE, tels que les hydrocarbures monoterpéniques, le γ-terpinène et le p-cymène, peuvent contribuer à leur activité antibactérienne.
Certaines études montrent que quelques HE possèdent une activité antiacnéique ; l’huile d’arbre à thé est utilisée commercialement. La présente étude a donc évalué le potentiel antiacnéique de sept HE utilisées en médecine populaire méditerranéenne : l’origan (Origanum vulgare), le thym (Thymus vulgaris), la citronnelle (Cymbopogon citratus), l’arbre à thé (Melaleuca alternifolia), la menthe (Mentha piperita), la lavande (Lavendula anguestifolia) et la camomille (Matricaria recutita). La région méditerranéenne est l’une des plus grandes productrices de ces plantes aromatiques. Ses conditions climatiques et culturales favorables améliorent la qualité des constituants des HE. Nous avons évalué in vitro l’activité antimicrobienne des HE sélectionnées ci-dessus contre les bactéries responsables de l’acné.
Un autre objectif de cette étude était de développer une formulation pharmaceutique de l’HE présentant l’effet antimicrobien le plus élevé. Sur la base de nos résultats antibactériens in vitro concernant les HE testées contre les bactéries responsables de l’acné, nous avons formulé l’HE d’origan sous forme de nanoémulsion. Les nanoémulsions offrent une capacité accrue de solubilisation des médicaments hydrophobes et peu solubles, comme c’est généralement le cas des HE. Dans cette étude, nous avons évalué in vivo, dans un modèle murin d’acné, l’activité cicatrisante et antimicrobienne de la nanoémulsion élaborée à partir de l’HE la plus efficace, en tant que nouvelle formulation potentielle pour le traitement de l’acné.
L’activité antibactérienne des sept HE sélectionnées contre P. acnes et S. epidermidis a été évaluée au moyen du test de diffusion sur disque. Les résultats ont été exprimés sous forme de diamètre de la zone d’inhibition.
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P. acnes et S. epidermidis étaient sensibles aux HE d’origan et de thym, avec des zones d’inhibition comprises entre 16 et 32 mm, plus grandes que celles obtenues avec les antibiotiques de référence, l’érythromycine et la clindamycine. Alors que la citronnelle et l’arbre à thé présentaient des zones d’inhibition modérées, de 9 à 17 mm, les HE de lavande, de menthe et de camomille n’ont pas inhibé la croissance des deux bactéries. Les témoins positifs des deux études, l’érythromycine et la clindamycine, présentaient des zones d’inhibition comprises entre 10 et 20 mm. Le véhicule témoin négatif, le diméthylsulfoxyde (DMSO), n’a produit aucune inhibition contre l’une ou l’autre bactérie.
Les résultats du test de concentration minimale inhibitrice ont confirmé que les HE les plus puissantes contre P. acnes et S. epidermidis étaient celles d’origan, de thym, de citronnelle et d’arbre à thé.
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L’HE d’origan présentait les valeurs de CMI les plus faibles, respectivement 0,34 et 0,67 mg/mL contre P. acnes et S. epidermidis. L’HE de thym arrivait en deuxième position, avec des CMI respectives de 0,65 et 1,30 mg/mL contre P. acnes et S. epidermidis. En conséquence, les HE d’origan, de thym, de citronnelle et d’arbre à thé ont été retenues pour la détermination de la concentration minimale bactéricide, puisqu’elles présentaient l’inhibition la plus efficace contre P. acnes et S. epidermidis lors des essais de diffusion sur disque et de CMI.
L’activité bactéricide des quatre HE présentant les meilleures zones d’inhibition et CMI a été testée contre les bactéries responsables de l’acné. L’HE d’origan, à des concentrations de 0,67 et 1,34 mg/mL, a inhibé respectivement la croissance de P. acnes et de S. epidermidis.
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L’HE d’arbre à thé présentait l’activité bactéricide la plus faible, à 2,558 et 5,116 mg/mL contre P. acnes et S. epidermidis, respectivement. Les quatre HE sélectionnées ont ensuite été évaluées pour leur activité antibiofilm contre S. epidermidis.
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L’HE d’origan a inhibé la formation du biofilm de S. epidermidis à sa concentration bactéricide de 1,34 mg/mL. À l’inverse, l’HE la moins efficace, celle d’arbre à thé, n’a pas pu inhiber la formation du biofilm de S. epidermidis à des concentrations allant jusqu’à 2,56 mg/mL, soit 0,28 % v/v.
Comme les résultats des essais de diffusion sur disque en gélose, de CMI, de CMB et de CMIB montraient la supériorité de l’HE d’origan, la dynamique de son activité destructrice a été déterminée. La CMI, 2 × CMI et 4 × CMI de l’HE d’origan ont entraîné une diminution significative du nombre de P. acnes et de S. epidermidis après 4 h d’application.
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La capacité de destruction de S. epidermidis par l’HE d’origan était supérieure à celle observée contre P. acnes à 8 et 12 h. Les constituants volatils de l’HE d’origan ont été déterminés par analyse GC-MS afin d’identifier les agents actifs susceptibles d’être responsables des effets antiacnéiques observés.
L’origan et le thym appartiennent tous deux à la même famille, les Lamiaceae, et produisent des composés aromatiques constituant les principaux composants de leurs huiles essentielles. Notre analyse GC-MS des constituants volatils des HE d’origan et de thym a montré que le principal composé volatil était le thymol.
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Le thymol représentait 99,44 % de l’HE d’origan et 72 % des composés volatils du thym. Les autres composés volatils identifiés étaient présents à des teneurs beaucoup plus faibles dans les deux huiles et comprenaient le p-cymène, le cinéole et le γ-terpinène.
Les données relatives à l’activité antimicrobienne ont montré que l’HE d’origan présentait les plus grandes zones d’inhibition et la meilleure CMI parmi les sept huiles testées. Parmi les quatre HE les plus efficaces sélectionnées, l’HE d’origan présentait les meilleures CMB et CMIB, ainsi que des vitesses rapides de destruction des deux bactéries testées. En outre, notre analyse GC-MS a montré que la teneur en thymol de l’HE d’origan était supérieure à celle de l’HE de thym, ce qui suggère que le thymol pourrait expliquer les activités antimicrobiennes supérieures de l’origan. Nous avons donc ensuite cherché à évaluer l’activité antimicrobienne du thymol par comparaison avec les HE d’origan et de thym.
L’activité antimicrobienne du thymol, principal constituant volatil des HE d’origan et de thym, a été évaluée. Avec la méthode de diffusion sur disque, le thymol à des concentrations de 0,7 % et 1,4 % a inhibé la croissance de S. epidermidis et de P. acnes de façon significativement supérieure à l’érythromycine, avec une zone d’inhibition supérieure à 19 mm.
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Lors de l’évaluation de la CMI du thymol contre S. epidermidis et P. acnes, l’origan et le thym se sont révélés supérieurs au thymol. De même, la CMB du thymol contre P. acnes était inférieure à celles de l’origan et du thym. La CMB du thymol contre S. epidermidis était intermédiaire entre celles des HE d’origan et de thym. Enfin, l’activité antibiofilm du thymol contre S. epidermidis était inférieure à celle des HE d’origan, de thym, de citronnelle et d’arbre à thé.
Malgré la prédominance du thymol dans l’HE d’origan, les essais antimicrobiens in vitro ont montré que l’HE d’origan était supérieure au thymol seul. Nous avons donc sélectionné l’HE d’origan afin de la formuler en nanoémulsion et de la tester in vivo en tant que traitement topique contre l’acné.
Les HE présentent une faible solubilité dans l’eau, ce qui entrave leur utilisation dans des formulations aqueuses. Une nanoémulsion huile-dans-eau de l’HE d’origan a été formulée afin d’améliorer sa faible solubilité dans l’eau. Elle contenait moins de 5 % m/m d’HE d’origan et de Pluronic F127 et se présentait sous la forme d’une solution limpide et stable. La stabilité de la nanoformulation a été évaluée pendant quatre semaines à température ambiante. Aucun signe de turbidité, de crémage ou de séparation de phases n’a été observé. La nanoémulsion préparée avait une taille de particules de 39,54 nm et un indice de polydispersité de 0,285, indiquant une faible dispersion des tailles.
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La dose d’huile dans la formulation a été ajustée à 2 × CMI, soit 0,672 mg/mL, afin d’éviter une éventuelle irritation ou une réaction d’hypersensibilité cutanée. Nous avons évalué l’activité antiacnéique de la nanoémulsion d’HE d’origan formulée dans un modèle murin d’acné in vivo. Les oreilles de souris BALB/c ont été infectées par injection intradermique de P. acnes. Deux jours plus tard, la nanoformulation ou de l’érythromycine à 2 % a été appliquée par voie épicutanée sur les oreilles des souris, puis les activités anti-inflammatoire et antimicrobienne contre P. acnes ont été mesurées. Un troisième groupe de souris a reçu une injection de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans P. acnes et a servi de groupe témoin sain. Aucune croissance bactérienne détectable n’a été observée chez les souris du groupe témoin à oreille non infectée.
Nous avons également évalué la cicatrisation par examen histopathologique du tissu auriculaire des souris. Nous avons comparé les résultats à ceux de souris traitées par l’érythromycine à 2 % — témoins positifs — et de souris non traitées — témoins négatifs. La nanoémulsion d’HE d’origan a réduit significativement l’inflammation à la fin de l’expérience.
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Le pourcentage d’inhibition de l’inflammation a été calculé pour tous les groupes d’animaux au moyen de la formule suivante :
\frac{%,\text{d’inhibition (témoin)}-%,\text{d’inhibition (traitement)}} {%,\text{d’inhibition (témoin)}} ]
À la fin de l’expérience, l’inhibition de l’inflammation était significativement plus faible chez les souris traitées par la nanoémulsion que chez le témoin positif traité par l’érythromycine. En outre, la vitesse de diminution de l’épaisseur de l’oreille des souris après le traitement était également supérieure à celle obtenue avec le témoin positif à l’érythromycine.
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L’activité antimicrobienne in vivo de la nanoémulsion d’HE d’origan a été évaluée : après traitement par 0,672 mg/mL de nanoémulsion d’origan, les dénombrements bactériens de P. acnes sont passés de 1 × 10^8 à 4,3 × 10^1 UFC/mL.
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À l’inverse, le nombre de bactéries dans le groupe témoin négatif, traité avec le tampon PBS, s’est maintenu à 5 × 10^5 UFC/mL, tandis que la solution d’érythromycine administrée au témoin positif a réduit le nombre de bactéries à 3,5 × 10^3 UFC/mL.
Enfin, nous avons évalué les effets cicatrisants de la nanoémulsion d’HE d’origan par histopathologie et photographie numérique. Les oreilles infectées des souris traitées par la nanoémulsion présentaient une cicatrisation comparable à celle du témoin positif traité par l’érythromycine et ressemblaient à du tissu auriculaire normal. Pris dans leur ensemble, nos résultats in vivo suggèrent que la nanoémulsion d’origan a efficacement détruit P. acnes et guéri l’inflammation du tissu auriculaire plus efficacement que l’érythromycine, l’antibiotique de référence contre l’acné.
L’HE d’origan a présenté l’effet antimicrobien le plus puissant contre les bactéries responsables de l’acné testées. Dans les essais de diffusion sur disque, de CMI et de CMB, l’origan, le thym et le thymol étaient les trois agents antimicrobiens les plus efficaces contre P. acnes. Parallèlement, les HE d’arbre à thé et de citronnelle présentaient un effet antimicrobien intermédiaire contre P. acnes et S. epidermidis. Les deux bactéries responsables de l’acné testées étaient résistantes aux HE de camomille, de lavande et de menthe. Ainsi, dans cette étude, les effets antiacnéiques de l’HE d’origan ont surpassé ceux des autres HE évaluées, y compris ceux de l’HE d’arbre à thé, commercialisée comme traitement antiacnéique en vente libre.
La pathogenèse de l’acné implique en outre la formation d’un biofilm par S. epidermidis. Les bactéries se développant dans des biofilms sont plus résistantes aux antibiotiques que celles adoptant un mode de vie planctonique. Nous avons donc évalué la capacité antibiofilm des HE antimicrobiennes les plus puissantes et constaté que l’HE d’origan présentait l’activité antibiofilm la plus forte. En outre, à 4 × CMI, l’HE d’origan a rapidement détruit les deux bactéries responsables de l’acné testées.
Le thymol présentait une activité antimicrobienne puissante contre les bactéries responsables de l’acné, mais inférieure à celle de l’HE d’origan elle-même. Le thymol possède une activité bactéricide significative et réduit la résistance bactérienne aux antibiotiques. L’action antimicrobienne du thymol s’exerce principalement par l’inhibition de la croissance bactérienne et de la production de lactate, la diminution de l’absorption cellulaire du glucose et la lyse de la paroi des hyphes fongiques.
Le thymol était le principal composant phénolique de l’HE d’origan, à plus de 99 %, et de l’HE de thym, à plus de 70 %. Son rôle dans l’effet antimicrobien des HE est donc suggéré. Toutefois, le thymol seul était moins puissant que l’HE d’origan. Il est possible que d’autres composés volatils minoritaires, présents à des concentrations plus faibles, tels que le p-cymène, le γ-terpinène, l’α-thujène et le cinéole, aient exercé une synergie avec l’effet du thymol dans l’HE d’origan et puissent expliquer la différence d’activité entre l’origan et le thymol.
La composition des HE dépend de plusieurs facteurs, notamment des saisons de récolte, de la partie de la plante, de la méthode d’extraction et de l’origine géographique. Cela peut expliquer les différences entre les résultats obtenus dans différentes études, dans lesquelles la quantité de thymol varie de manière importante. Les HE utilisées dans cette étude provenaient de plantes récoltées pendant la floraison, ce qui pourrait expliquer leurs concentrations élevées en composés phénoliques. Dans l’ensemble, l’HE d’origan était l’agent antimicrobien le plus puissant. Elle a donc été formulée sous une forme topique de nanoémulsion afin d’être évaluée in vivo comme formulation antiacnéique dans un modèle murin d’acné induite.
Le traitement du modèle murin d’acné par la nanoémulsion d’origan proposée a entraîné une réduction de l’inflammation et de la charge bactérienne, ainsi qu’une cicatrisation tissulaire, supérieures à celles obtenues avec l’érythromycine. Les effets antibactériens des HE sont améliorés par leur formulation sous forme de nanoémulsions. L’émulsion préparée présentait une taille de particules de 39,54 nm et un indice de polydispersité de 0,285, indiquant une faible dispersion des tailles ; elle est donc considérée comme une nanoémulsion.
Le tensioactif Pluronic F127 a été utilisé à une concentration de 4,5 % et l’huile à 0,5 % m/m. La concentration utilisée est supérieure à la concentration micellaire critique (CMC) du Pluronic F127, qui est comprise entre 0,26 et 0,8 % massique. L’huile d’origan présente des activités anti-inflammatoire, antileishmanienne, antioxydante, hépatoprotectrice et antitumorale. À notre connaissance, il s’agit de la première étude décrivant l’effet antiacnéique de l’HE d’origan. Les effets antiacnéiques de l’origan dépassent ceux de l’HE d’arbre à thé, commercialisée en vente libre contre l’acné, ainsi que ceux d’HE sélectionnées dont les effets antimicrobiens sont documentés.
La plupart des animaux ne produisent pas suffisamment de triglycérides pour héberger P. acnes. Nous avons donc standardisé notre modèle murin d’acné chez des souris BALB/c par injection intradermique de P. acnes dans leurs oreilles. Sur la base de nos résultats in vivo, nous proposons les souris BALB/c comme une autre souche murine susceptible d’être utilisée pour développer un modèle animal d’acné.
Les huiles essentielles de plantes aromatiques offrent des effets spasmolytiques, mucolytiques et apaisants contre la toux. En outre, les effets antimicrobiens des HE contre les agents pathogènes et les contaminants alimentaires ont également été privilégiés en raison de la sécurité des produits d’origine naturelle, préférés par le public. Cependant, peu d’attention a été accordée à l’effet antimicrobien des HE contre les bactéries responsables de l’acné.
Dans l’ensemble, nos résultats indiquent que la nanoémulsion d’origan proposée présente des effets antimicrobiens et cicatrisants élevés, avec moins d’effets indésirables que les antibiotiques antiacnéiques de référence. L’utilisation potentielle de notre nanoémulsion d’origan comme agent antiacnéique ouvre la voie à de nouveaux traitements de substitution d’origine naturelle, permettant d’éviter les problèmes associés à l’utilisation d’antibiotiques contre l’acné. Des études cliniques supplémentaires portant sur notre formulation pourraient accroître son potentiel en tant que médicament destiné à une utilisation clinique chez l’être humain.
Sept HE ont été utilisées dans cette étude : l’origan (Origanum vulgare), le thym (Thymus vulgaris), la citronnelle (Cymbopogon citratus), l’arbre à thé (Melaleuca alternifolia), la menthe (Mentha piperita), la lavande (Lavendula anguestifolia) et la camomille (Matricaria recutita). Les HE de qualité pharmaceutique ont été aimablement offertes par le département des sciences et technologies alimentaires de l’Université du Nebraska, Lincoln, Nebraska, États-Unis. Nous avons déterminé la composition des HE d’origan et de thym par analyse GC-MS au département de pharmacognosie de la faculté de pharmacie de l’Université du Caire, comme indiqué à la section 4.8. Le thymol pur a été acheté auprès de Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, États-Unis.
Propionibacterium acnes ATCC 6919 et Staphylococcus epidermidis ATCC 28319 ont été aimablement fournis par la Dre Mayri A. Diaz, Université de Manchester, Royaume-Uni. S. epidermidis a été cultivé en aérobiose sur gélose cœur-cervelle (BHI ; LAB M Limited, Lancashire, Royaume-Uni) et incubé à 37 °C pendant 18 h. Des colonies isolées de S. epidermidis ont été repiquées dans du bouillon BHI et incubées à 37 °C pendant 18 h en aérobiose.
Pour P. acnes, les bactéries ont été cultivées en anaérobiose sur gélose au milieu renforcé pour clostridies (RCM ; Oxoid Limited, Basingstoke, Royaume-Uni), pendant 48 h à 37 °C et sous environ 5 % de CO₂, au moyen d’une jarre anaérobie et de sachets générateurs d’atmosphère anaérobie (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, États-Unis). Des colonies isolées de P. acnes ont été repiquées dans du bouillon RCM pendant 48 h à 37 °C en conditions anaérobies.
Des souris BALB/c mâles âgées de 6 semaines et pesant 20 g — n = 50 souris — ont été achetées auprès du Theodor Bilharz Research Institute, Gizeh, Égypte. Les procédures de recherche ont été menées conformément aux principes et recommandations du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals Association, A.V.M. (2007). Toutes les expériences animales ont été approuvées par le comité d’éthique de la recherche de la faculté de pharmacie de l’Université du Caire, code d’identification du protocole MI2002, à la date du 30 mai 2017.
À titre de criblage préliminaire, l’activité antibactérienne des sept HE a été déterminée par diffusion sur disque en gélose, selon la méthode de Kirby-Bauer modifiée. Les HE ont été diluées dans du diméthylsulfoxyde stérilisé de qualité analytique — DMSO, Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, États-Unis — et des solutions mères de chacune des huiles ont été préparées à des concentrations de 0,7 % et 1,4 %. Les solutions mères préparées ont été stérilisées par filtration à travers un filtre stérile pour seringue de 0,2 µm — Corning, New York, États-Unis.
Selon la méthode de culture décrite à la section 4.2, nous avons préparé des suspensions cellulaires de cultures de S. epidermidis et de P. acnes, dont la densité bactérienne a été ajustée à 10^8 UFC/mL. Les suspensions bactériennes ont été étalées respectivement sur des boîtes de gélose BHI ou RCM afin de tester les HE contre S. epidermidis ou P. acnes. Des disques stériles de papier-filtre ont été immergés dans 20 µL d’HE ou de DMSO à 0,7 % ou 1,4 %, puis placés sur la surface de la gélose jusqu’à séchage. Ils ont ensuite été incubés dans les conditions appropriées décrites ci-dessus pour chaque bactérie.
Deux antibiotiques de référence standards, la clindamycine à 2 µg/disque et l’érythromycine à 15 µg/disque, ont été utilisés comme témoins de référence, et le DMSO comme témoin négatif. L’activité antibactérienne de chaque HE à chaque concentration a été évaluée en mesurant, à l’aide d’un pied à coulisse de Vernier, le diamètre de la zone d’inhibition, exprimé en millimètres. Les essais ont été réalisés en trois exemplaires et répétés dans le cadre de trois expériences indépendantes.
La CMI et la CMB des HE ont été déterminées par la méthode de microdilution en bouillon dans des microplaques à 96 puits à fond en U, conformément aux lignes directrices du Clinical and Laboratory Standards Institute de 2011. Les HE ont été dissoutes dans du DMSO stérilisé à une concentration finale de 7 % v/v, puis des dilutions sériées de facteur deux ont été réalisées afin d’obtenir des concentrations d’HE comprises entre 0,00875 et 0,56 % v/v.
Des inoculums de S. epidermidis et de P. acnes ont été préparés respectivement dans du bouillon BHI et du RCM, avec une DO₆₀₀ nm ajustée à 0,5. Les inoculums ont été dilués afin d’obtenir dans les puits une turbidité finale correspondant approximativement à 10^6 UFC/mL. Des aliquotes de 50 µL de bactéries et de 50 µL des différentes concentrations de chaque HE ont été incubées à 25 °C pendant 24 h pour S. epidermidis en conditions aérobies et à 37 °C pendant 48 h pour P. acnes en conditions anaérobies.
Les variations de densité bactérienne ont été mesurées à une longueur d’onde de 620 nm au moyen d’un lecteur de plaques ELISA — Infinite F50, Tecan, Suède. La concentration la plus faible d’HE à laquelle aucune densité bactérienne n’était détectée a été définie comme la CMI de l’HE. Chaque HE a été testée à chaque concentration en trois exemplaires et l’expérience a été répétée trois fois indépendamment. Un mélange de 50 µL de bouillon exempt de bactéries et de 50 µL de DMSO a été utilisé comme témoin négatif.
Pour déterminer la CMB, 10 µL des mélanges des bactéries respectives et des HE aux différentes concentrations ont été ensemencés sur des boîtes de gélose comme indiqué ci-dessus. Après incubation à 37 °C pendant respectivement 24 et 48 h pour S. epidermidis et P. acnes, les bactéries ont été dénombrées et les résultats exprimés en UFC/mL. La CMB a été définie comme la concentration la plus faible d’HE à laquelle les bactéries respectives incubées ne produisaient aucune colonie détectable sur les géloses correspondantes. Pour déterminer la CMB, chaque HE a été testée à chaque concentration en trois exemplaires et l’expérience a été répétée trois fois indépendamment.
Nous avons déterminé la CMIB des HE contre le biofilm de S. epidermidis par la méthode des microplaques, précédemment décrite et légèrement modifiée. En résumé, 100 µL de S. epidermidis à 10^8 UFC/mL dans du BHI contenant 1 % m/v de glucose ont été incubés avec 100 µL d’HE à des concentrations comprises entre 0,00875 et 0,56 % v/v, à 25 °C pendant 24 h.
Après incubation, le contenu de chaque puits a été retiré et les puits ont été délicatement rincés deux fois avec 300 µL de PBS. La plaque a été séchée à l’air pendant 30 min, puis le biofilm formé a été coloré avec du violet de cristal à 0,1 % m/v pendant 30 min à température ambiante. L’excès de violet de cristal a ensuite été éliminé de la plaque par lavage avec 200 mL de PBS par puits ; le lavage a été répété trois fois, puis la plaque a été séchée à l’air.
Afin de mesurer le biofilm coloré au violet de cristal, celui-ci a été solubilisé avec de l’éthanol à 95 % v/v et l’intensité de la coloration a été mesurée à une DO₅₉₅ nm au moyen d’un lecteur de microplaques Infinite F50 Tecan. La CMIB a été déterminée pour les HE d’origan, de thym, de citronnelle et d’arbre à thé ainsi que pour le thymol. Du bouillon BHI a été utilisé comme témoin négatif et une culture cellulaire de S. epidermidis sans HE comme témoin positif. La CMIB a été définie comme la concentration d’HE à laquelle la DO₅₉₅ nm était égale à celle du témoin négatif. Les expériences ont été réalisées en trois exemplaires pour chaque concentration d’HE et l’essai a été répété trois fois indépendamment.
Un essai de cinétique de destruction en fonction du temps a été réalisé avec l’HE d’origan contre S. epidermidis et P. acnes, selon une méthode précédemment décrite. Des suspensions bactériennes d’une concentration finale de 10^8 UFC/mL ont été utilisées comme inoculum initial.
Le temps de destruction par l’HE d’origan a été évalué à des concentrations de [illisible] mg/mL — 0,035 % —, [illisible] mg/mL — 0,07 % — et [illisible] mg/mL — 0,14 % —, équivalant respectivement à 1, 2 et 4 × CMI. Les différentes concentrations d’HE d’origan ont été incubées avec les deux cultures bactériennes et la capacité de destruction a été mesurée à 0, 1, 2, 4, 8, 12 et 24 h par la méthode de microdilution en bouillon.
À chaque point temporel, 50 µL de la solution d’essai ont été utilisés pour réaliser des dilutions sériées de facteur dix et des dénombrements de cellules viables ont été effectués sur des boîtes de gélose BHI et RCM pour les bactéries respectives. Les boîtes de gélose ont été incubées à 25 °C pendant 24 h en conditions aérobies pour l’une des bactéries et à 37 °C pendant 48 h en conditions anaérobies pour l’autre. Le nombre de bactéries viables a été exprimé en UFC/mL. Le solvant DMSO et le bouillon correspondant ont été utilisés comme témoins négatifs. Chaque concentration d’HE a été évaluée en trois exemplaires et l’ensemble de l’essai a été répété trois fois indépendamment.
Nous avons analysé les composants chimiques des HE d’origan et de thym par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, au moyen d’un chromatographe en phase gazeuse Shimadzu modèle GC-17A relié à un spectromètre de masse Shimadzu modèle QP-5000 — Shimadzu, Kyoto, Japon.
Les composés volatils ont été séparés sur une colonne DB5-MS présentant les caractéristiques suivantes : longueur de 30 m, diamètre interne de 0,5 mm et film de 0,25 µm — J&W Scientific, Santa Clara, Californie, États-Unis. Les HE ont été injectées selon un rapport de division de 1:10 pendant 30 s. Les conditions opératoires suivantes ont été utilisées : injecteur à 220 °C ; four de la colonne à 38 °C pendant 3 min, puis augmentation programmée à une vitesse de 12 °C·min⁻¹ jusqu’à 220 °C et maintien pendant 2 min ; hélium comme gaz vecteur à 1 mL·min⁻¹. Les températures de la ligne de transfert et de la source d’ions ont été ajustées respectivement à 230 et 180 °C.
Le spectromètre de masse quadripolaire HP a été utilisé en mode d’ionisation électronique à 70 eV et la plage de balayage a été réglée sur m/z 40–500. Les composants volatils ont été identifiés selon des procédures précédemment décrites. Les pics obtenus ont d’abord été déconvolués avec le logiciel AMDIS — www.amid.net — puis les composés ont été identifiés d’après leurs indices de rétention relatifs aux n-alcanes C6–C20 et par comparaison de leurs spectres de masse avec les bases de données des bibliothèques NIST et WILEY — correspondance supérieure à 90 % — ainsi qu’avec ceux d’étalons authentiques lorsqu’ils étaient disponibles.
Une méthode à faible énergie a été utilisée pour préparer la nanoémulsion d’origan, avec 95 % m/m d’eau et 5 % m/m d’un mélange d’HE et de Pluronic F127. Le mélange d’HE et de tensioactif a été préparé avec 4,5 % de Pluronic F127 et 0,5 % m/m d’huile. Les quantités définies d’huile d’origan et de Pluronic F127 ont été ajoutées puis mélangées par agitation à 800 tr/min pendant 30 min.
Une nanoémulsion stable a été formée par ajout d’eau goutte à goutte, à un débit de 3,5 mL/min, sous agitation à 800 tr/min pendant 1 h. La nanoémulsion obtenue a été conservée à 25 °C et observée 24 h ainsi que 1, 3 et 4 semaines après sa préparation. La taille des gouttelettes et l’indice de polydispersité de la nanoémulsion préparée ont été mesurés par spectroscopie de corrélation de photons — Zetasizer ZS, Malvern, Royaume-Uni. Le diamètre moyen des gouttelettes a été exprimé en µm et toutes les mesures ont été réalisées en trois exemplaires.
Une expérience préliminaire initiale — n = 5 souris BALB/c — a été réalisée afin d’examiner le potentiel irritant de la nanoémulsion d’origan. Lors de cette expérience préliminaire, 10 µL de nanoémulsion — à 2 × CMI contre P. acnes, selon nos essais in vitro — ont été appliqués par voie épicutanée sur les oreilles d’un groupe de souris saines non infectées, qui ont été observées pendant 5 jours afin de détecter tout signe d’inflammation.
Dans nos expériences in vivo destinées à évaluer l’efficacité de la nanoémulsion d’origan, nous avons utilisé 45 souris BALB/c mâles réparties en trois groupes — n = 5 souris par groupe et par expérience. L’épaisseur des oreilles des souris a été mesurée avant les injections. Nous avons ensuite injecté par voie intradermique dans l’oreille droite 20 µL de PBS — oreille témoin saine — au moyen d’une seringue Hamilton de 50 µL, modèle 705 RN — Hamilton Co., Reno, Nevada, États-Unis.
L’infection et l’inflammation acnéiques ont été induites par injection de 20 µL contenant 10^8 UFC de P. acnes dans l’oreille gauche, conformément à un protocole précédemment établi. Les souris ont été observées pendant 24 à 72 h afin de détecter la formation de microcomédons, et les variations quotidiennes de l’épaisseur de l’oreille ont été mesurées à l’aide d’un micromètre numérique électronique — 0–25 mm/0,001 mm. L’apparition de microcomédons et une augmentation d’au moins 10 % de l’épaisseur de l’oreille des souris ont été considérées comme des indicateurs de l’induction de l’acné.
Sur les oreilles infectées, nous avons appliqué par voie épicutanée, pendant 3 jours, soit 20 µL de nanoémulsion formulée d’origan à 2 × CMI — groupe expérimental —, soit de l’érythromycine à 2 % — témoin positif —, soit aucun traitement — témoin négatif. Les variations quotidiennes de l’épaisseur des oreilles et du poids des souris ont été enregistrées, et des photographies numériques de leurs oreilles ont été prises. À la fin de l’expérience, les oreilles ont été excisées afin de procéder au dénombrement des bactéries viables et à l’analyse histopathologique.
Le pourcentage d’inflammation après l’application épicutanée du traitement a été calculé pour tous les groupes d’animaux à l’aide de la formule suivante :
\frac{\text{épaisseur de l’oreille infectée}-\text{épaisseur de l’oreille non infectée}} {\text{épaisseur de l’oreille infectée}} ]
Le pourcentage d’inhibition de l’inflammation a été calculé pour tous les groupes d’animaux à l’aide de la formule suivante :
\frac{%,\text{d’inhibition (témoin)}-%,\text{d’inhibition (traitement)}} {%,\text{d’inhibition (témoin)}} ]
Pour l’examen histologique, les oreilles entières excisées ont été conservées dans une solution saline formolée à 10 % avant la préparation des coupes histologiques par inclusion en paraffine. Toutes les coupes ont été déshydratées dans des bains d’éthanol de concentrations croissantes, clarifiées dans du xylène, puis incluses dans de la paraffine. Des coupes transversales de 4 à 5 µm d’épaisseur ont été montées sur des lames de verre et colorées à l’hématoxyline-éosine. Toutes les coupes ont été examinées afin d’évaluer la réponse inflammatoire.
Pour évaluer in vivo l’activité antimicrobienne de notre nanoémulsion, les oreilles excisées des souris ont été homogénéisées dans du PBS. Les homogénats ont ensuite été cultivés par la méthode d’ensemencement de dilutions sériées sur des boîtes de gélose RCM, puis P. acnes a été dénombré après 72 h d’incubation anaérobie à 37 °C.
Toutes les données ont été enregistrées dans des feuilles de calcul Excel — Microsoft Office 2010. Les résultats ont été analysés et représentés graphiquement à l’aide de Microsoft Excel et du logiciel GraphPad Prism, version 6.1. Les données présentées proviennent d’au moins trois expériences indépendantes et sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type. Pour évaluer la significativité statistique, le test t et une ANOVA à un facteur avec test de comparaisons multiples de Turkey ont été utilisés ; le seuil de significativité retenu était p ≤ 0,05.
Cette étude in vitro et in vivo a montré que l’huile essentielle d’Origanum vulgare L., testée contre Propionibacterium acnes ATCC 6919 et Staphylococcus epidermidis ATCC 28319, présentait respectivement des CMI de 0,34 et 0,67 mg/mL, des CMB de 0,67 et 1,34 mg/mL et, contre le biofilm de S. epidermidis, une CMIB de 1,34 mg/mL ; dans un modèle d’acné induite dans l’oreille de souris BALB/c, sa nanoémulsion à 0,672 mg/mL a réduit P. acnes de 1 × 10^8 à 4,3 × 10^1 UFC/mL, contre 3,5 × 10^3 UFC/mL avec l’érythromycine à 2 %, résultats précliniques ne constituant pas une preuve d’efficacité clinique chez l’être humain.
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