Référence : Molecules 2022. — PMC9610729 · DOI 10.3390/molecules27207100 Type : étude expérimentale in vitro + phytochimie · Plante : Origan vulgaire · Propriété → Dépression & neuro Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte progressive de la mémoire et une altération cognitive dues à une perte sévère de neurones cholinergiques dans des régions cérébrales spécifiques. Elle constitue le type de démence le plus fréquent dans la population vieillissante. Bien que de nombreux médicaments anti-acétylcholinestérase (AChE) soient déjà disponibles sur le marché, leur efficacité produit parfois des résultats inattendus. Pour cette raison, des recherches sont en cours afin d’identifier des agents anti-AChE potentiels provenant de sources naturelles et synthétiques. Dans cette étude, 90 extraits issus de 30 plantes médicinales indigènes ou naturalisées sont testés par chromatographie sur couche mince (CCM) et par la méthode colorimétrique d’Ellman à 250, 125 et 62,5 μg/mL afin de déterminer leur effet inhibiteur sur l’AChE. Au total, 21 extraits sur 90 présentent une forte activité anti-AChE, correspondant à une inhibition de 75 à 100 %, de manière dépendante de la dose. Parmi eux, l’extrait éthanolique des parties aériennes d’O. vulgare ssp. vulgare présente une valeur de CI50 7,7 fois inférieure à celle de la galantamine. Cette recherche établit également le profil chimique de l’extrait d’origan par CCM, HPLC-DAD et LC-MS, et 23 composés sont identifiés et quantifiés. Les acides dihydroxycinnamiques et les flavonoïdes sont les plus abondants, avec respectivement 56,90 et 25,94 %. Enfin, les composés phénoliques totaux et les propriétés antioxydantes sont quantifiés par des méthodes colorimétriques. La teneur totale en composés phénoliques est de 207,64 ± 0,69 µg/mg d’extrait. L’activité antioxydante est mesurée vis-à-vis de deux radicaux, le DPPH et l’ABTS. Dans les deux essais, l’extrait d’origan présente une forte activité. La matrice de corrélation de Pearson montre la relation entre les acides syringiques, un type d’acide dihydroxybenzoïque, et l’activité anti-AChE (r² = −0,9864) ainsi que l’activité antioxydante (r² = 0,9409 et 0,9976). En conclusion, les résultats de cette étude démontrent le potentiel prometteur de nouvelles utilisations de ces plantes médicinales pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. Origanum vulgare ssp. vulgare et les acides syringiques, qui possèdent une activité anti-AChE et une capacité antioxydante bénéfique, peuvent être mis en avant comme candidats potentiels au développement de médicaments destinés au traitement de la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies caractérisées par un déficit cholinergique.
La maladie d’Alzheimer (MA) est la cause la plus fréquente de démence. Cette maladie neurodégénérative chronique se développe lentement et progressivement en provoquant une détérioration des capacités intellectuelles dans les domaines de Wernicke suivants : apprentissage et mémoire, capacités langagières, lecture et écriture, praxies, interaction avec l’environnement et modifications de la personnalité. La détection précoce de la maladie est importante, car la médecine ne peut actuellement pas inverser la dégénérescence, mais seulement retarder la progression neurodégénérative. Les facteurs de risque de développement de la MA comprennent à la fois des facteurs génétiques — gène ApoE4 — et environnementaux : âge, dépression et syndrome métabolique, notamment hypertension artérielle, diabète et hyperlipidémie.
Depuis les années 1970–1980, la science s’intéresse à « l’hypothèse cholinergique de la MA » en raison des observations très concordantes concernant l’altération de certains systèmes sélectifs de neurotransmetteurs chez les patients atteints de MA. Une diminution présynaptique de l’acétylcholine (ATCh) a été observée chez ces patients et, parmi les différents traitements de la maladie d’Alzheimer, les inhibiteurs de l’acétylcholinestérase, qui augmentent la concentration de ce neurotransmetteur dans l’espace synaptique néocortical, sont les plus couramment employés. Les plus importants sont le donépézil, la galantamine et la rivastigmine, utilisés en particulier aux premiers stades de la maladie et dont les effets indésirables comprennent une hépatotoxicité et des troubles gastro-intestinaux.
Le vieillissement et le stress oxydatif — production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) — étant impliqués dans la MA, les antioxydants pourraient également être potentiellement utiles dans son traitement.
L’étude ethnopharmacologique constitue l’une des meilleures voies pour la découverte et le développement de médicaments. Ces recherches sont principalement menées par des établissements universitaires plutôt que par l’industrie pharmaceutique. Lors des premières étapes des recherches, l’usage traditionnel et les techniques de préparation des plantes médicinales peuvent guider les méthodes d’extraction et le criblage pharmacologique in vitro. L’industrie peut ensuite mener des criblages ciblés in vivo et des essais cliniques.
Dans le nord de l’Espagne, où se trouve la province de Navarre, il existe une grande diversité de plantes médicinales indigènes et naturalisées. En 2003, notre groupe de recherche a commencé une étude ethnopharmacologique qui se poursuit encore aujourd’hui. Le nombre élevé de plantes recueillies à ce jour a permis la publication de plusieurs articles portant sur diverses affections, notamment des troubles neurologiques et mentaux. L’objectif de la présente étude est d’analyser 90 extraits obtenus à partir de 38 espèces végétales utilisées en Navarre pour le système nerveux, puis de sélectionner les plus actifs afin d’en réaliser la caractérisation chimique.
Au cours des deux dernières décennies, le mécanisme d’inhibition de l’AChE a acquis une grande importance clinique dans le traitement des symptômes de la MA. Certains extraits et composés phytochimiques ont présenté cette activité. Plusieurs méthodes ont été décrites pour déterminer l’activité inhibitrice de l’AChE, notamment des méthodes colorimétriques utilisant le réactif d’Ellman ou le réactif au sel Fast Blue B, des méthodes fluorométriques ou la détection en ligne par HPLC. La méthode d’Ellman, fondée sur la détermination de la quantité de thiocholine libérée lorsque l’acétylthiocholine est hydrolysée par l’AChE, est la plus largement employée, car elle est simple et permet d’obtenir rapidement des informations sur les extraits végétaux.
Afin de sélectionner les extraits végétaux présentant une forte activité inhibitrice de l’AChE, 90 extraits éthanoliques et aqueux de 38 plantes médicinales recueillies en Navarre, en Espagne, ont été analysés dans cette étude. Ces plantes médicinales, appartenant à neuf familles botaniques — Asteraceae, Lamiaceae, Crassulaceae, Equisetaceae, Euphorbiaceae, Lythraceae, Papaveraceae, Primulaceae et Verbenaceae — avaient présenté une forte activité antioxydante dans des recherches antérieures de notre groupe.
Le criblage qualitatif par CCM a montré que 20 des 90 extraits étaient inactifs à la dose de 0,20 mg. Les extraits bruts pouvant parfois produire des résultats faussement positifs ou négatifs lors de l’essai par CCM, un essai quantitatif sur microplaque a été réalisé. Au total, 20 extraits ont présenté un taux d’inhibition inférieur à 10 % à la dose de 250 μg/mL. Un résumé des études de criblage de ces extraits est présenté dans le tableau 1, classé alphabétiquement par famille et indiquant le nom scientifique, la partie botanique, le solvant d’extraction, le rendement d’extraction, le pourcentage d’inhibition et la concentration à laquelle 50 % de l’enzyme est inhibée. Soixante-dix extraits ont présenté une activité inhibitrice vis-à-vis de l’acétylcholinestérase à une concentration de 250 μg/mL : 21 avaient une activité élevée, avec 75 à 100 % d’inhibition, 34 une activité modérée, avec 50 à 75 % d’inhibition, et 15 une activité faible, avec 10 à 50 % d’inhibition.
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Le criblage de 30 extraits issus de 11 plantes médicinales de la famille des Asteraceae a révélé que deux d’entre eux présentaient une très forte activité, avec des pourcentages d’inhibition supérieurs à 75 % : l’extrait aqueux des feuilles de Tussilago farfara (80,25 ± 13,78 %) et l’extrait éthanolique des inflorescences de Santolina chamaecyparissus (75,82 ± 6,69 %) à 250 μg/mL. Les extraits à l’acétate d’éthyle de T. dubius et T. farfara ont été décrits comme de puissants inhibiteurs de l’acétylcholinestérase et de la butyrylcholinestérase.
Concernant S. chamaecyparissus, seule l’huile essentielle obtenue par distillation à la vapeur a été décrite comme agent de lutte contre les termites en raison de cette activité. Celle-ci a également été décrite dans l’huile essentielle d’autres espèces de Santolina, telles que S. impresa et S. semidentata. Il est toutefois important de souligner que l’extrait éthanolique de S. chamaecyparissus possède une composition chimique différente de celle de l’huile essentielle et contient des composés non volatils, qui pourraient constituer une source de nouveaux composés bioactifs.
Les espèces de Lamiaceae posséderaient une vaste gamme d’activités biologiques et une grande diversité de composés phytochimiques. Cette famille botanique est riche en huiles essentielles, en acides hydroxycinnamiques et en flavonoïdes actifs, qui contribuent significativement à ses propriétés neuroprotectrices. Pour cette raison, l’activité anti-AChE de cette famille a été largement étudiée. Comme le montre le tableau 1, les extraits de Lamiaceae étaient généralement plus puissants que ceux des Asteraceae. Parmi les 42 extraits éthanoliques et aqueux de 18 plantes médicinales testés, 13 ont présenté une forte activité inhibitrice, avec des valeurs supérieures à 75 %, tandis que 14 autres ont produit une inhibition modérée de l’AChE, avec des valeurs comprises entre 50 et 75 %, à une concentration de 250 μg/mL.
L’extrait éthanolique des inflorescences, des tiges et des feuilles de Lavandula latifolia a présenté des valeurs supérieures à 90 % à 125 μg/mL. L’extrait aqueux a également présenté des valeurs similaires à 250 μg/mL. La littérature contient des informations sur l’activité inhibitrice de l’AChE des huiles essentielles de L. angustifolia et L. intermedia, L. luisieri, L. pedunculata, L. stoechas et L. viridis. Cependant, aucune étude consacrée à L. latifolia n’a été trouvée.
Dans cette étude, des différences ont été détectées entre quatre espèces de Mentha, et les meilleurs résultats d’inhibition ont été obtenus avec les extraits éthanolique et aqueux de M. longifolia, respectivement 77,98 % et 90,45 %. M. aquatica, M. pulegium et M. suaveolens ont présenté une activité plus faible. Il convient de mentionner que des données similaires existent dans la littérature pour les huiles essentielles des espèces de Mentha précitées : M. longifolia, M. aquatica, M. arvensis, M. gentilis, M. piperita, M. spicata, M. pulegium et M. suaveolens.
Les extraits éthanoliques des parties aériennes de deux sous-espèces d’Origanum vulgare, virens et vulgare, ont présenté des résultats similaires, avec des pourcentages d’inhibition respectifs de 91,75 ± 1,38 et 95,61 ± 2,02 %. Les deux extraits ont également présenté les plus faibles valeurs de CI50, respectivement 4,62 ± 0,01 et 2,59 ± 0,01 μg/mL, qui sont même inférieures à celle de la galantamine, soit 19,90 ± 4,80 μg/mL. Ces résultats sont similaires à ceux publiés par d’autres auteurs pour des sous-espèces d’O. vulgare et d’autres espèces étroitement apparentées, telles qu’O. majorana, O. compactum, O. syriacum et O. ehrenbergii. La différence entre ces travaux et notre étude réside dans la polarité des extraits. La plupart des analyses antérieures ont été réalisées sur des huiles essentielles ou des extraits hydrophobes obtenus avec du dichlorométhane ou de l’acétate d’éthyle.
Une différence nette a été observée entre les deux extraits de Prunella vulgaris : tandis que l’extrait éthanolique produisait une inhibition de 78,86 ± 7,39 % à 250 μg/mL, l’extrait aqueux pouvait être considéré comme inactif (< 10 %). À notre connaissance, il n’existe que deux données publiées concernant les propriétés inhibitrices de l’AChE du genre Prunella. Park et ses collaborateurs ont étudié les effets de l’extrait éthanolique des fleurs de P. vulgaris var. lilacina sur une altération de la mémoire induite par un médicament, concluant que cette plante serait utile pour traiter les déficits cognitifs provoqués par un dysfonctionnement cholinergique et qu’elle exerce ses effets par la voie de signalisation des récepteurs NMDA. Qu et ses collaborateurs ont déterminé que les extraits à l’acétate d’éthyle de P. vulgaris atténuaient l’altération de la mémoire induite par la scopolamine chez le rat, en améliorant les performances comportementales et en réduisant les lésions des cellules cérébrales ; cet effet était associé à une diminution notable de l’activité de l’AChE et du taux de MDA, ainsi qu’à une augmentation des activités de la SOD et de la GPx.
Deux espèces différentes de Sideritis ont été analysées : S. hirsuta et S. hyssopifolia. Seul l’extrait aqueux de S. hirsuta a présenté une forte activité inhibitrice de l’AChE (93,27 ± 3,85 %). Aucun résultat concernant ces espèces n’a été publié ; toutefois, des informations bibliographiques sur l’activité anti-AChE de ce genre ont été trouvées pour S. arborescens, S. congesta, S. arguta, S. libanotica, S. perfoliata et S. pisidica.
Les extraits éthanolique et aqueux de Teucrium chamaedrys ont présenté à 250 μg/mL une activité supérieure — respectivement 98,09 ± 1,10 % et 98,96 ± 9,85 % — à celle de la galantamine. Ces résultats sont corroborés par les recherches consacrées à différentes espèces du genre Teucrium vis-à-vis de la MA : T. arduini, T. chamaedrys, T. montanum, T. polium, T. hyrcanicum et T. royleanum. L’extrait méthanolique de T. royleanum et ses fractions ont également été étudiés en tant qu’inhibiteurs de l’acétylcholinestérase, et une activité significative d’inhibition enzymatique, comprise entre 52 et 83 %, a été observée.
Le genre Thymus comprend environ 350 espèces de plantes herbacées vivaces aromatiques et de sous-arbrisseaux. De nombreuses études ont porté sur l’activité inhibitrice in vitro des huiles essentielles de plantes de ce genre vis-à-vis de l’acétylcholinestérase. Nos résultats concordent avec ces travaux : les extraits éthanoliques de T. praecox et T. vulgaris ont présenté une forte inhibition de l’AChE, respectivement de 97,81 ± 10,90 et 82,48 ± 9,05 %.
Dix-huit extraits appartenant à sept familles différentes — Crassulaceae, Equisetaceae, Euphorbiaceae, Lythraceae, Papaveraceae, Primulaceae et Verbenaceae — ont été étudiés. Six d’entre eux ont présenté une forte inhibition de l’AChE (> 75 %). Les extraits éthanoliques d’E. arvense et d’E. telmateia ont montré un effet similaire et ont été plus efficaces que les extraits aqueux, avec des valeurs d’inhibition supérieures à 84 % à 250 μg/mL. Ces deux espèces étant proches sur les plans botanique et chimique, des résultats pharmacologiques similaires étaient prévisibles.
Les Euphorbiaceae constituent une vaste famille de plantes à fleurs comprenant environ 300 genres et 7 500 espèces. Les espèces d’Euphorbia contiennent des glucosinolates et des glycosides cyanogènes, tels que la linamarine, en proportions variables. La différence quantitative de composition chimique pourrait justifier la variabilité des résultats observés entre les extraits aqueux des deux espèces, E. characias (44,25 ± 5,01 mg/mL) et E. helioscopia (78,74 ± 4,15 mg/mL). Enfin, les extraits aqueux de Lythrum salicaria (Lythraceae) et d’Anagallis arvensis (Primulaceae), ainsi que l’extrait éthanolique de Papaver rhoeas (Papaveraceae), ont également présenté une forte activité inhibitrice de l’AChE, respectivement de 98,50 ± 13,50, 80,02 ± 1,25 et 99,78 ± 7,57 mg/mL. Il importe de souligner les compositions chimiques différentes de ces espèces : L. salicaria est riche en tanins, A. arvensis en saponines et P. rhoeas en alcaloïdes. À notre connaissance, aucune activité anti-AChE n’a été rapportée pour aucune d’entre elles, à l’exception des espèces d’Euphorbia suivantes : E. antisyphilitica, E. characias, E. hirta, E. royleana, E. splendens, E. tirucalli et E. fischeriana, ainsi que pour les Papaveraceae.
La concentration inhibitrice médiane (CI50) est la mesure la plus largement employée de l’efficacité d’un médicament dans la recherche pharmacologique. Elle indique la quantité de médicament nécessaire pour inhiber de moitié un processus biologique et fournit ainsi une mesure de la puissance d’un médicament antagoniste. Le potentiel anti-AChE peut être classé dans les catégories suivantes selon les valeurs de CI50 : puissance élevée, CI50 < 15 µM ; puissance modérée, 15 < CI50 < 50 µM ; faible puissance, 50 < CI50 < 1 000 µM. La figure 1 présente les dix extraits les mieux classés selon leur valeur de CI50 et leur comparaison avec la galantamine.
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Deux extraits alcooliques ont présenté une puissance anti-AChE supérieure à celle de la galantamine (19,9 ± 4,80 µg/mL) : les parties aériennes d’O. vulgare ssp. virens (4,62 ± 0,01 µg/mL) et d’O. vulgare ssp. vulgare (2,59 ± 0,01 µg/mL). L’extrait aqueux des inflorescences de L. latifolia a présenté une valeur de CI50 (19,98 ± 0,49 µg/mL) égale à celle de la galantamine.
D’après les résultats du criblage, l’extrait éthanolique des parties aériennes d’O. vulgare ssp. vulgare a présenté la meilleure activité anti-AChE, 7,7 fois supérieure à celle de la galantamine. Pour cette raison, l’étude s’est poursuivie par la caractérisation chimique de cet extrait. L’activité antioxydante et les composés phénoliques totaux ont également été déterminés. Enfin, afin d’établir les relations structure-activité, les résultats ont été analysés au moyen d’une matrice de corrélation.
La chromatographie sur couche mince, la chromatographie liquide à haute performance avec détection par réseau de diodes (HPLC-DAD) et la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) ont été utilisées pour la caractérisation chimique. Celle-ci a en outre été complétée par la détermination des composés phénoliques totaux.
Les composés phénoliques totaux (CPT) ont été quantifiés par spectrophotométrie selon la méthode colorimétrique de Folin–Ciocalteu. Dans cet essai, les composés phénoliques sont oxydés en milieu alcalin par le réactif de Folin–Ciocalteu, composé d’un mélange d’acide phosphotungstique et d’acide phosphomolybdique, ce qui produit un mélange réduit d’oxydes bleus de tungstène et de molybdène pouvant être quantifié à 765 nm. La teneur en CPT de l’extrait éthanolique était de 207,64 ± 0,69 µg/mg d’extrait lyophilisé. Des études antérieures sur l’origan ont également déterminé les CPT des extraits et ont parfois présenté des résultats différents de ceux obtenus dans ce travail. Pour expliquer ces différences, il est important de souligner que la composition chimique d’un extrait varie en fonction du matériel végétal, des conditions de culture et de la méthode de préparation — solvant, durée et température.
La composition chimique de l’extrait éthanolique d’O. vulgare a d’abord été analysée qualitativement par CCM avec deux phases mobiles différentes.
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Après exposition au réactif des produits naturels (NP), les deux plaques de CCM ont permis d’identifier les principaux composés d’après leur couleur.
En haut de la plaque de CCM (Rf = 0,90) développée avec de l’acétate d’éthyle:methanol:eau (65:15:5, v/v/v), une tache rose a été détectée. Ces taches pourraient correspondre à des chlorophylles, puisque les parties aériennes d’O. vulgare ont été utilisées comme matière première. Wagner et Bladt ont observé sur une plaque de CCM des taches fluorescentes similaires présentant des valeurs de Rf élevées (> 0,70) et les ont identifiées comme des chlorophylles. Les chlorophylles sont des pigments verts participant à la photosynthèse et localisés dans les feuilles des plantes. Des taches bleues, couleur caractéristique des acides phénoliques, ont également été détectées aux valeurs de Rf de 0,70, 0,55, 0,40 et 0,25. Des acides phénoliques ont été décrits chez O. vulgare, les plus importants étant l’acide 3,4-dihydroxybenzoïque, l’acide rosmarinique et l’acide caféique. La CCM a montré une tache jaune au bas de la plaque (Rf = 0). Cette couleur indique la présence de flavonoïdes, composés potentiellement bioactifs déjà décrits chez O. vulgare.
Pour confirmer le profil chimique des extraits, des plaques de CCM complémentaires ont été préparées en modifiant la phase mobile. Selon Wagner et Bladt, le mélange acétate d’éthyle:acide acétique glacial:acide formique:eau (100:11:11:26, v/v/v/v) est l’une des meilleures phases mobiles pour détecter les flavonoïdes et les acides phénoliques après traitement par le NP. À première vue, la séparation des composés était meilleure qu’avec la première phase mobile. Les taches jaunes situées sur la ligne de dépôt de la CCM précédente ont ici été séparées en plusieurs taches. La présence d’acides phénoliques, en bleu, de flavonoïdes, en jaune, et de chlorophylles, en rose, a également été confirmée. Le même profil avait été précédemment décrit dans un extrait hydroalcoolique d’origan.
La CCM est une technique chromatographique qualitative dans laquelle ni l’intensité des bandes ne doit être utilisée comme quantification formelle, ni la couleur obtenue dans certaines conditions — réactif et longueur d’onde d’observation — ne peut servir à identifier les composés au-delà de leur groupe chimique : chlorophylles, flavonoïdes, acides phénoliques, etc. Pour obtenir des résultats quantitatifs, des techniques telles que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) doivent être utilisées. La HPLC-DAD assure la séparation et fournit le spectre UV des composés, permettant leur attribution à un groupe chimique particulier. Les pics ont ainsi été répartis en six groupes selon leur spectre UV : acides dihydroxycinnamiques (λmax 325–329 nm), acides dihydroxybenzoïques (λmax 220, 259,4 et 293,7 nm), acides syringiques (λmax 220 ép., 260–280 nm), huiles essentielles possédant un cycle aromatique (λmax 254 nm), acides salvianoliques (λmax 289, 323 ép. nm) et flavonoïdes (λmax 254,6–267 et 338–348,5 nm). Les principaux composés étaient un dérivé de lutéoline (31,4 min), l’acide 3,4-dihydroxybenzoïque (31,8 min) et l’acide rosmarinique (37,9 min), précédemment décrits. Les acides dihydroxybenzoïques, les acides syringiques, les acides dihydroxycinnamiques et les acides salvianoliques sont des acides phénoliques obtenus par la voie de l’acide shikimique chez les plantes, mais ils ont été considérés comme des groupes distincts lors de la quantification et de la discussion de nos résultats.
L’aire sous la courbe (ASC) de chaque pic a été transformée en concentration par analyse de régression linéaire. L’extrait éthanolique contenait 15,56 ± 0,14 mg/100 mg de flavonoïdes exprimés en équivalents de lutéoline (#L9283, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis) ; 35,35 ± 1,13 mg/100 mg d’acides dihydroxycinnamiques, dont 24,21 ± 1,08 mg d’acide rosmarinique, et 11,14 ± 0,15 mg/100 mg d’acides salvianoliques exprimés en équivalents d’acide caféique (#C0625, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis) ; 5,23 ± 0,04 mg/100 mg d’acides dihydroxybenzoïques et 2,89 ± 0,24 mg/100 mg d’acides syringiques exprimés en équivalents d’acide 3,4-dihydroxybenzoïque (#D109800, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis). Les huiles essentielles typiques de l’origan ont produit des pics de faible intensité en HPLC-DAD et n’ont donc pas été prises en compte dans la quantification chimique. La figure 2d présente la répartition des principaux groupes en pourcentage. Les composés les plus abondants sont les acides dihydroxycinnamiques (56,90 %), l’acide rosmarinique représentant le pourcentage le plus élevé (38,97 %), et les flavonoïdes (25,94 %).
Après séparation des composés d’un échantillon par chromatographie liquide (HPLC-DAD), des techniques analytiques instrumentales très sensibles, telles que la spectrométrie de masse (LC-ESI-QTOF-MS), peuvent être appliquées pour identifier les composés individuels. Cette technologie repose sur l’ionisation des composés séparés afin d’obtenir des informations structurales. Un grand nombre de métabolites secondaires sont des composés glycosylés ; leur fragmentation par LC-MS permet de révéler la structure principale et les sucres qui lui sont liés, ce qui en fait une technique utile pour l’identification phytochimique des composés extraits de plantes.
Les pics ont été préliminairement attribués à une famille de composés phénoliques d’après leurs spectres UV-visible. La structure de chaque composé a été proposée en fonction des profils de fragmentation obtenus lors d’expériences ESI-MS-MS, ainsi que par coélution avec plusieurs étalons. Au total, 23 composés ont ainsi été détectés et identifiés ou provisoirement identifiés. Ils sont répertoriés dans le tableau 2 avec les données UV-visible et MS.
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La figure 3 présente les structures des composés identifiés.
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L’identification des composés provisoirement caractérisés présents dans l’extrait des parties aériennes de l’origan est expliquée ci-dessous.
Les acides dihydroxycinnamiques (λmax 316–331 nm) ont été détectés en premier lors de l’analyse LC-MS. Ils avaient également été décrits précédemment chez des espèces de Lamiaceae. Ces composés pourraient correspondre aux taches bleues observées en CCM avec la phase mobile acétate d’éthyle:acide acétique glacial:acide formique:eau (100:11:11:26, v/v/v/v).
Un monomère, l’acide caféique (composé 1), a été identifié à 0,9 min (m/z 179,05 ; λmax 296 ép., 324 nm). Ce composé a produit un ion à m/z 179,05 [M−H]− et un fragment prédominant à m/z 135,04 [M−H−44]− par perte d’un groupe CO₂. L’extrait contenait également quatre formes plus complexes de l’acide caféique, les composés 2, 3, 4 et 17. Le fragment m/z 179,05 de l’acide caféique apparaît dans le spectre de masse de chacun d’eux. Le composé 2, détecté à 1,1 min et présentant [M−H]− à m/z 341,07 et [M−H−162 (résidu de glucose)]− à m/z 179,03, a été provisoirement caractérisé comme l’acide caféique 4-α-D-glucoside. La perte de 162 uma est probablement due au clivage d’un groupement glucose. L’acide chlorogénique (composé 3), association d’acide caféique et d’acide quinique (m/z 354,31), a également été détecté à 1,3 min. L’ion caractéristique très intense à m/z 191,01 [M−H−162 (résidu caféoyle)]− correspondant à l’acide quinique a confirmé la structure. Le composé 17 a été attribué à l’acide rosmarinique, un ester de l’acide caféique et de l’acide 3,4-dihydroxyphényllactique, largement décrit dans les familles des Lamiaceae et des Boraginaceae. La fragmentation MS de l’ion pseudomoléculaire de l’acide rosmarinique (m/z 358,97) a produit trois pics à m/z 197,01 [M−H−162 (caféoyle)]−, 179,05 [M−H−180] et 161,02 [M−H−198]−, correspondant aux formes déprotonées des acides 3-(3,4-dihydroxyphényl)lactique et caféique ainsi qu’à leurs formes déshydratées. Ces résultats concordent avec le schéma de fragmentation proposé par Lecomte et ses collaborateurs. L’acide rosmarinique, dont le nom dérive de Rosmarinus officinalis L., a été identifié comme l’un des composés les plus actifs de plusieurs plantes de la famille des Lamiaceae, notamment le romarin et l’origan. Son identification par HPLC-DAD et LC-MS est largement rapportée dans la littérature. L’élucidation définitive de ces structures a également été confirmée par co-injection avec des étalons de référence. Le composé 4 a été identifié comme la rabdosiine 7-O-β-D-glucoside (m/z 879,05 [M−H]− ; λmax 287 ép., 329 nm). Ce composé est un tétramère d’acide caféique lié à un squelette de lignane (m/z 718,6) et à une unité glucose [M−H−162]−. À l’origine, la rabdosiine a été isolée et identifiée dans la tige de Rabdosia japonica Hara, Labiatae. Selon les données publiées, elle a été proposée comme agent potentiel anti-VIH, antiallergique et antiprolifératif. Il s’agit du premier signalement de la présence de rabdosiine 7-O-β-D-glucoside chez une espèce d’Origanum.
Le deuxième groupe identifié était celui des acides dihydroxybenzoïques issus de la voie de l’acide shikimique. Ces acides, qui produisent une tache bleue sur la plaque de CCM, peuvent résulter de la transformation de l’acide caféique et ont été décrits dans des études antérieures sur l’origan. D’après le temps de rétention de 6,5 min, les spectres UV (λmax 217,0, 261,7 et 294,9 nm), l’ion m/z 153,01 [M−H]− et un ion fragment [M−H−44 (CO₂)]− à m/z 109,02, le composé 12, composant majoritaire, a pu être identifié comme l’acide 3,4-dihydroxybenzoïque ou acide protocatéchique, également décrit précédemment chez O. vulgare. L’identification finale a été réalisée par co-injection d’un étalon de 3,4-DHBA (#D109800, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis).
Le troisième type de pic UV (λmax 220 ép., 280 nm) correspond au groupe des acides syringiques, déjà décrit chez O. vulgare. Les acides syringiques sont des composés phénoliques dont la dénomination stricte est « acides 4-hydroxy-3,5-diméthoxybenzoïques », synthétisés à partir de l’acide férulique et de l’acide caféique par une série de réactions enzymatiques de la voie de l’acide shikimique. Bien qu’ils soient des dérivés de l’acide dihydroxybenzoïque, ils présentent un spectre UV différent. Pour cette raison, ces composés sont traités séparément. Deux acides syringiques ont été détectés, les composés 7 et 8, à 3,4 et 3,7 min. Le composé 7 a été identifié comme l’acide syringique (m/z 197,03 [M−H]−) et le composé 8 comme une forme glycosylée, l’acide syringique-4-β-D-glucoside, à m/z 359,08 [M−H]− et m/z 197,04 [M−H−162]−.
La plupart des études publiées sur l’origan utilisent les huiles essentielles comme matériel végétal en raison de l’importante bioactivité de ces composés. Comme elles sont volatiles, une seule huile essentielle, le composé 19, a été détectée dans cette étude. Le composé 19 (λmax 254,4 nm ; m/z 149,1 [M−H]−) a été identifié comme le thymol, huile essentielle la plus importante de l’origan. L’identification finale a été effectuée par co-injection de l’étalon de thymol.
Le groupe suivant était celui des acides salvianoliques, également signalés précédemment dans l’origan. D’un point de vue chimique, ils sont considérés comme un vaste groupe d’acides dont les noms sont attribués au moyen de lettres : acide salvianolique A, B, E, etc. Ces composés possèdent une structure chimique complexe dérivée de l’acide rosmarinique et ont été distingués des acides dihydroxycinnamiques parce qu’ils présentaient un spectre UV différent (λmax 289, 323 ép. nm). En LC-MS, cinq acides salvianoliques ont été identifiés, les composés 11, 14, 15, 16 et 18. Des fragments m/z 179,04 correspondant à l’acide caféique apparaissent dans les spectres de masse de tous les acides salvianoliques détectés. Le composé 11, détecté à 6,3 min, est un trimère d’acide caféique dont l’ion déprotoné [M−H]− se situe à m/z 537,09 ; il a été attribué à l’acide salvianolique H ou à l’acide salvianolique I, qui forment une paire d’isomères. Les composés 14 (6,8 min), 15 (7,1 min) et 18 (7,5 min), des tétramères d’acide caféique, ont produit le même ion pseudomoléculaire [M−H]− à m/z 717,12 et ont été identifiés respectivement comme l’acide salvianolique E, l’acide salvianolique B et l’acide salvianolique L. Enfin, un hexamère d’acide caféique, le composé 16, a été détecté à 7,6 min avec un ion pseudomoléculaire de m/z 987,22. L’identification finale de ces composés a été établie par comparaison avec les temps de rétention et les données de fragmentation MS, à l’exception du composé 16, dont la structure n’a pas été complètement élucidée.
Le dernier groupe chimique présent dans l’origan et les Lamiaceae est celui des flavonoïdes. Ces métabolites secondaires se trouvent généralement sous forme glycosylée, la molécule principale étant liée à un ou plusieurs sucres, tels que le glucose ou le galactose. Dans les spectres UV, deux épaulements distincts et caractéristiques permettent d’identifier facilement ces composés. Neuf flavonoïdes présentant trois types différents de spectres ont été détectés. Les composés 5, 6, 9, 10 et 21 ont présenté des spectres UV typiques des flavonols. Le composé 5, détecté à 2,4 min, a présenté un ion moléculaire à m/z 609,17 [M−H]− et a été identifié comme la rutine — quercétine-3-O-rutinose, λmax 254,6 et 348,5 nm — produisant un ion MS à m/z 463,3 [M−H−146]− par perte d’un groupement rhamnose et un ion quercétine à m/z 301,8 [M−H−146−162]−. La perte de 308 uma est caractéristique des composés contenant du rutinose. De manière similaire, le composé 21, détecté à 8 min, a été identifié comme la syringétine 3-O-rutinoside, avec m/z 653,14 [M−H]−, 507,4 [M−H−146]− et 345,07 [M−H−146−162]−. La syringétine est une diméthoxyflavone, dérivée de la myricétine, dans laquelle les groupes hydroxy situés aux positions 3′ et 5′ ont été remplacés par des groupes méthoxy. Les ions m/z 330,1 [M−H−308−15]− et 315,2 [M−H−308−30]− ont confirmé la présence de deux groupes −OCH₃. Le composé 10, détecté à 5,8 min, présentant λmax 266 et 346 nm dans le spectre DAD, un anion moléculaire à m/z 739,05 dans les spectres ESI négatifs et des ions à m/z 659,07 [M−H−146]− et m/z 447,01 [M−H−146−146]−, a été identifié comme un kaempférol-3-galactoside-6″-rhamnoside-3′″-rhamnoside. Le clivage de ce glycoside a produit l’aglycone kaempférol à m/z 285,03 [M−H]−. Le composé 6, détecté à 2,5 min, était un dérivé de l’isorhamnétine présentant m/z 315,02 [M−H−314]−, correspondant à l’aglycone ayant perdu un fragment galloylhexoside. Le spectre de masse du composé 6 a montré le fragment m/z 447,03 [M−H−152]−, corroborant la substitution galloyle. En outre, la perte supplémentaire de 162 uma a confirmé la présence d’un hexoside, glucoside ou galactoside. Le composé 6 a ainsi été identifié comme l’isorhamnétine 3-(6″-galloylglucoside). Enfin, un oxalate de quercétine a été détecté à 5,6 min, sous la forme du composé 9, avec m/z 388,20 [M−H]− et m/z 301,80 [M−H−87]−.
Le composé 20, détecté à 7,9 min, est une 5-hydroxy-3,3′,4′,7-tétraméthoxyflavone, à savoir la rétusine, présentant l’ion m/z 357,09 [M−H]− et λmax 350 et 268 nm. Les ions à m/z 342,12 [M−H−15]−, 327,07 [M−H−15]−, 312,02 [M−H−15]− et 297,02 [M−H−15]− ont confirmé les quatre groupes méthoxyle.
Pour l’identification par MS des C-glycosides, les fragmentations clés utilisées étaient [M−60]−, [M−90]−, [M−120]− et [M−240]−. Les composés 22, l’orientine, et 23, l’homoorientine, ont été identifiés comme des dérivés C-glycosylés de la lutéoline (λmax 254 et 267 nm). Les ions de fragmentation des deux composés étaient m/z 447,05 [M−H]−, 357,78 [M−H−90]−, 327,22 [M−H−120]− et 285,5 [M−H−162]−.
Enfin, un glycoside de flavanone, le composé 13, détecté à 6,6 min et présentant λmax 285 et 325 nm, a été identifié comme l’ériodictyol-7-O-glucoside. Les ions à m/z 449,19 [M−H]− et m/z 287,05 [M−H−162]− ont confirmé la structure.
L’acide rosmarinique, l’apigénine, la lutéoline et la quercétine sont les composés les plus fréquemment rencontrés chez cette espèce de Lamiaceae. Compte tenu de l’accumulation de données concernant l’activité biologique des flavonoïdes et des acides phénoliques des espèces d’origan, la quantification de ces composés est importante. Des études portant sur différentes espèces d’origan ont montré que les flavones constituent le sous-groupe de flavonoïdes le plus abondant, suivies des flavonols, des flavanones et des flavanols. Les acides phénoliques les plus courants dans l’origan sont des dérivés des acides hydroxycinnamiques et hydroxybenzoïques. Leur teneur et leur répartition peuvent toutefois varier selon les facteurs géographiques et environnementaux de croissance et le stade végétatif de la plante, ce qui produit des profils chimiques différents au sein d’une même espèce. Pour ces raisons, la caractérisation chimique et l’établissement de marqueurs chimiotaxonomiques propres à chaque espèce et sous-espèce sont très importants. Dans les parties aériennes d’O. vulgare ssp. vulgare, l’acide rosmarinique et l’acide 3,4-dihydroxybenzoïque pourraient constituer deux marqueurs optimaux.
Les composés phénoliques sont des métabolites secondaires présents dans un large éventail de plantes médicinales et dont la structure chimique peut agir comme donneur d’hydrogène, ce qui en fait des composés potentiellement antioxydants. L’oxygène moléculaire (O₂) intervient dans les fonctions métaboliques. Cependant, à la suite de ces réactions enzymatiques, il peut également se présenter sous forme de dérivés hautement réactifs à courte durée de vie, les espèces réactives de l’oxygène (ERO). L’anion superoxyde (O₂•−), le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂) et le radical hydroxyle (•OH) font partie de ces dérivés susceptibles de provoquer des lésions cellulaires. Ils peuvent affecter l’ADN et les acides gras polyinsaturés de la membrane. Les organismes sont préparés à contrecarrer ces dommages grâce à des systèmes de défense antioxydants. Toutefois, selon la théorie du vieillissement et des radicaux libres, l’efficacité de ces systèmes protecteurs tend à diminuer avec l’âge, et l’accumulation de ces molécules nocives peut engendrer des pathologies dans l’organisme et conduire à des maladies telles que la maladie d’Alzheimer et le diabète. La plupart des recherches actuelles sur les produits naturels visent à trouver des coadjuvants externes capables de contrecarrer ces dommages oxydatifs, à des fins préventives ou thérapeutiques. Les composés capables de contrecarrer ces dommages oxydatifs sont appelés antioxydants. En tant qu’aide exogène destinée à prévenir les dommages causés à l’organisme, ces composés antioxydants peuvent réduire la formation de ces radicaux libres ou les neutraliser.
Parmi les essais in vitro, la méthode fondée sur le DPPH• est probablement la plus populaire en raison de sa simplicité, de sa rapidité et de son faible coût. Le DPPH• — 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle — est un radical libre stable pouvant être réduit par transfert d’hydrogène provenant d’autres composés. Depuis 1995, lorsque Brand-Williams a publié et examiné en détail cette méthodologie pour la première fois, plusieurs variantes ont été développées. Selon l’équipement et l’objectif de l’étude, la réaction peut être quantifiée à un temps prédéfini, principalement 30 min, ou faire l’objet d’études cinétiques. Le principe de la réaction reste néanmoins toujours le même : la réduction du DPPH• est suivie en mesurant la diminution de son absorbance à une longueur d’onde caractéristique au cours de la réaction. Sous sa forme radicalaire, le DPPH• absorbe à 517 nm, mais l’absorption disparaît après sa réduction par un antioxydant (AH) ou une espèce radicalaire (R•).
Conformément aux recommandations de Brand-Williams, la réaction a été suivie dans le temps afin d’établir une échelle cinétique en fonction du moment de sa stabilisation. Un échantillon est considéré comme un antioxydant rapide si le point de stabilisation de la réaction est atteint avant 30 min, comme un antioxydant intermédiaire s’il se stabilise entre 30 et 60 min, et comme un antioxydant lent s’il lui faut plus de 60 min pour se stabiliser. La réaction est stable lorsqu’aucune différence statistique (p > 0,05) n’est observée entre deux valeurs consécutives. L’extrait éthanolique était un antioxydant intermédiaire, avec un point de stabilisation compris entre 30 et 60 min, et présentait une CI50 de 3,22 ± 0,19 µg/mL à 60 min.
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Les valeurs de CI50 de l’activité antioxydante dépendent de la concentration de DPPH, ce qui rend difficile leur comparaison avec d’autres études publiées. Néanmoins, l’indice d’activité antioxydante (IAA), indépendant de la concentration de DPPH, peut être calculé en divisant la concentration de DPPH dans la solution finale (20 µg/mL) par la valeur de CI50. Cet indice détermine la puissance de l’activité antioxydante indépendamment de la concentration de DPPH. Selon la classification actuelle, les extraits végétaux sont considérés comme de faibles antioxydants lorsque l’IAA < 0,5, comme modérés lorsque l’IAA est compris entre 0,5 et 1,0, comme puissants lorsque l’IAA est compris entre 1,0 et 2,0 et comme de très puissants antioxydants lorsque l’IAA > 2,0. L’indice d’activité antioxydante a donc également été calculé afin de déterminer la puissance de l’activité antioxydante des extraits indépendamment de la concentration de DPPH. Les résultats ont montré que l’extrait était un très puissant antioxydant, avec un IAA de 6,21 ± 0,10.
En complément de la détermination de l’activité antioxydante par le DPPH, la méthode de la capacité antioxydante équivalente au Trolox (TEAC), également appelée essai de décoloration du cation radicalaire ABTS, a été réalisée in vitro. Au moyen d’un protocole simple et peu coûteux, cet essai détermine la capacité d’un composé antioxydant à contrecarrer le radical libre ABTS. Contrairement à d’autres essais antioxydants in vitro couramment utilisés pour déterminer cette activité, cette méthode ne nécessite ni enzymes ni conditions particulières. Elle peut en outre être appliquée à l’étude des antioxydants hydrophobes et hydrophiles. L’essai in vitro ABTS a été réalisé selon García-Herreros et ses collaborateurs. Il repose sur la formation d’un cation radicalaire ABTS qui produit un changement de couleur mesurable par spectrophotométrie à 741 nm. L’essai a été réalisé avec l’extrait à une concentration de 1 mg/mL et les résultats ont été exprimés sous forme de quantité de Trolox (ET) par mg d’extrait lyophilisé, après substitution des données dans la courbe d’étalonnage du Trolox. L’activité antioxydante était de 34,24 ± 0,20 mg/100 mg d’extrait.
La corrélation est un type d’association entre deux variables quantifiables qui évalue la tendance des données, positive ou négative. Dans une corrélation, une valeur positive indique une relation directe positive, tandis qu’une valeur négative indique une relation indirecte négative entre les variables. La grandeur indique la force du lien, avec des valeurs comprises entre −1 et 1. Plus la valeur est proche de l’unité, plus la relation est forte, ce qui se traduit généralement sur un graphique par une plus faible dispersion des valeurs. L’un des coefficients les plus largement employés pour calculer une corrélation linéaire est celui de Pearson, qui suppose que la tendance est linéaire, qu’il n’existe aucune valeur aberrante et que les variables sont numériques et comportent un nombre raisonnable de valeurs.
Les coefficients de corrélation de Pearson, qui montrent la relation entre l’activité biologique de l’extrait éthanolique d’O. vulgare ssp. vulgare et sa composition chimique, sont présentés dans le tableau 4.
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La CI50 de l’activité sur l’AChE était fortement corrélée (R² > 0,85), de manière linéaire et négative, à l’activité antioxydante — DPPH-IAA (R² = −0,8649) et ABTS (R² = −0,9487) — ainsi qu’aux teneurs en acides syringiques (R² = −0,9864), en flavonoïdes (R² = −0,9563) et en acides dihydroxybenzoïques (R² = −0,9247). Une corrélation modérée et négative (R² = 0,76) entre la CI50 de l’activité sur l’AChE et les teneurs en acides dihydroxycinnamiques et en acide rosmarinique a également été observée. L’activité de piégeage du radical libre DPPH, exprimée par l’indice d’activité antioxydante, présentait une forte corrélation avec l’activité ABTS (R² = 0,9378) et avec tous les principaux composés analysés (R² > 0,9). Ces résultats concordent avec de nombreuses études portant sur l’activité des polyphénols en tant qu’inhibiteurs de l’AChE : outre leur inhibition de l’activité de l’AChE, ils exercent également un effet antioxydant, notamment par piégeage des formes radicalaires libres de l’oxygène et par leur capacité à chélater les métaux de transition, ce qui réduit la formation d’une inflammation susceptible de provoquer la destruction de structures neuronales.
L’effet neuroprotecteur des flavonoïdes et des acides dihydroxycinnamiques a été largement étudié par de nombreux auteurs. L’effet inhibiteur de certains acides phénoliques sur l’activité de l’AChE a également été rapporté, dans l’ordre suivant : acide rosmarinique > acide caféique > acide gallique = acide chlorogénique > acide homovanillique > acide sinapique. Des flavonoïdes tels que la quercétine, le kaempférol et, dans une moindre mesure, la lutéoline ont également été décrits comme des inhibiteurs efficaces de l’AChE.
Il est toutefois important de souligner l’activité des acides syringiques sur l’AChE. À notre connaissance, seuls quelques travaux leur sont actuellement consacrés. Les acides syringiques présentent une vaste gamme d’applications thérapeutiques dans la prévention du diabète, des maladies cardiovasculaires, du cancer et de l’ischémie cérébrale ; des activités antioxydantes, antimicrobiennes, anti-inflammatoires, antiendotoxiques, neuroprotectrices et hépatoprotectrices ont été décrites. Une étude récente a analysé 16 acides hydroxybenzoïques en tant qu’inhibiteurs de l’AChE par calorimétrie et simulation d’arrimage moléculaire. Tous les composés testés se sont révélés capables d’inhiber l’hydrolyse de l’ACh, et le syringate de méthyle a présenté les meilleures propriétés ; l’acide syringique a également montré un pourcentage d’inhibition élevé. Étant donné que le potentiel inhibiteur de l’AChE a principalement été étudié pour les huiles essentielles de la famille des Lamiaceae, ces résultats suggèrent la forte influence d’autres constituants chimiques tels que les composés syringiques, qui pourraient présenter un grand intérêt pharmacologique et ouvrir une nouvelle voie de recherche.
Les plantes ont été recueillies à Santacara, en Navarre, en Espagne — longitude : O1°32′38,33″ et latitude : N42°22′47,71″ — et identifiées par la botaniste Dre Rita Yolanda Cavero. Des spécimens de référence ont été déposés dans l’herbier PAMP de l’Université de Navarre. Les plantes ont été séchées à l’air libre, dans l’obscurité et à température ambiante. Toutes les espèces sont répertoriées dans le tableau 1.
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Le matériel végétal (10 g) a été broyé en poudre fine (tamis de 180 mailles) et extrait par macération avec 250 mL d’éthanol (EtOH) et d’eau (H₂O), à température ambiante dans un récipient fermé, à trois reprises pendant 24 h chacune. Les extraits ont été séchés sous pression réduite à 30 °C dans un évaporateur rotatif (Buchi R-300), puis lyophilisés (Virtis BT3-SL, New York, États-Unis). Enfin, les extraits secs ont été conservés dans des flacons en verre à −80 °C.
L’activité antiacétylcholinestérasique qualitative a été étudiée par CCM selon la méthode décrite par Uriarte-Pueyo et Calvo. Les extraits et la galantamine (#Y0001191, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis) ont été déposés à raison de 0,20 mg sur la plaque de CCM et développés avec le mélange acétate d’éthyle:methanol:eau (65:15:5, v/v/v) comme phase mobile. Les plaques ont ensuite été pulvérisées avec un mélange 1:1 de DTNB, ou acide 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoïque) (#D218200, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis), et d’ATCI, ou iodure d’acétylthiocholine (#01480, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis). Elles ont été laissées à sécher pendant 3 à 5 min, puis une solution d’acétylcholinestérase (AChE) (#C2888, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis) à 3 U/mL a été pulvérisée. Après application de l’AChE, un fond jaune est apparu, avec des taches blanches correspondant aux extraits ou aux composés inhibiteurs de l’AChE.
L’activité inhibitrice quantitative de l’AChE a été mesurée par la méthode spectrophotométrique mise au point par Rhee et ses collaborateurs et modifiée par Carpinella et ses collaborateurs. Les extraits lyophilisés ont été dilués dans leur solvant respectif, éthanol ou eau, afin d’obtenir une solution mère de 20 mg/mL, puis trois solutions en série ont été préparées, de 10 à 2,5 mg/mL. Dans une microplaque à 96 puits, 25 μL de chaque solution ont été ajoutés à 25 μL d’ATCI à 15 mM, 125 μL de DTNB à 3 mM, 25 μL d’acétylcholinestérase et 5,0 μL de tampon phosphate de sodium à 0,1 mM (pH 8,0), puis incubés pendant 15 min à 25 °C. L’hydrolyse de l’iodure d’acétylthiocholine a été suivie par la formation de l’anion jaune 5-thio-2-nitrobenzoate résultant de la réaction du DTNB avec la thiocholine, catalysée par les enzymes. L’absorbance a été lue à une longueur d’onde de 405 nm au moyen d’un spectrophotomètre pour microplaques PowerWave™ (BioTek, Winooski, Vermont, États-Unis), et les résultats ont été traités avec le logiciel d’analyse de données KC Junior BioTek. L’inhibition (%) de l’AChE a été calculée à l’aide de l’équation suivante : inhibition (%) = [1−(Aéch/Acon)/Aét] × 100, où Aéch, Acon et Aét sont les absorbances mesurées respectivement avec un échantillon, avec un échantillon mais sans enzyme, et sans échantillon. La concentration inhibitrice (CI50) a été calculée par analyse avec GraphPad Prism v 4.00. La galantamine, dissoute dans du méthanol, a été utilisée comme témoin positif. Chaque mesure a été réalisée au moins en triplicat.
Les composés phénoliques totaux (CPT) ont été quantifiés par spectrophotométrie selon la méthode colorimétrique de Folin–Ciocalteu. L’extrait éthanolique d’O. vulgare ssp. vulgare a été dissous dans l’éthanol à 1 mg/mL. Pour la réaction, 15 µL d’échantillon ont été mélangés à 75 µL de réactif de Folin–Ciocalteu (#47641, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis) et laissés à réagir pendant 2 min. L’éthanol a été utilisé comme blanc. Ensuite, 225 µL de Na₂CO₃ et 1 185 µL d’eau distillée ont été ajoutés et, après agitation, le mélange a été incubé à température ambiante pendant 2 h.
Dans une plaque à 96 puits, 300 µL de solution ont été déposés dans chaque puits et l’absorbance à 765 nm a été mesurée. L’absorbance a été transformée en µg d’acide gallique par mg d’extrait lyophilisé par extrapolation à partir d’une courbe d’étalonnage préalablement obtenue (y = 0,001x + 0,0038 ; R² = 0,999, où y correspond à l’absorbance et x à la concentration d’acide gallique).
Cette activité a d’abord été confirmée au moyen de la chromatographie sur couche mince (CCM), utilisée comme essai qualitatif, en déposant 10 μL d’extrait hydroalcoolique à 10 mg/mL sur une plaque de gel de silice 60 F254 nm à support plastique (#105554, Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne), éluée dans une cuve chromatographique avec les mélanges acétate d’éthyle:methanol:eau (65:15:5, v/v/v) et acétate d’éthyle:acide acétique:acide formique:eau (100:11:11:26, v/v/v/v). Les taches ont été observées à 366 nm après traitement avec le réactif NP (#126705, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis).
Les principaux groupes de composés de l’extrait ont ensuite été identifiés qualitativement et quantitativement par chromatographie liquide à haute performance avec détecteur à réseau de diodes : système HPLC Waters 600E de distribution multisolvant, injecteur Waters U6K et détecteur à réseau de photodiodes Waters 991 (Waters Corp., Milford, Massachusetts, États-Unis). Les échantillons ont été injectés dans une colonne en phase inverse C18 (Nova-Pak 150 mm × 3,9 mm, 4 μm, Waters Corp., Milford, Massachusetts, États-Unis) à 25 °C, avec un débit de 0,8 mL/min, puis élués avec de l’acétonitrile (solution A) et de l’eau de type I acidifiée et ajustée à pH 2 avec de l’acide formique (solution B), selon les proportions suivantes de solution B : 0–10 min, 95 % ; 10–20 min, 95–90 % ; 20–35 min, 90–80 % ; 35–45 min, 80–60 % ; 45–50 min, 80–20 %, puis 95 % en 5 min. La plage de détection a été établie entre 190 et 600 nm. La quantification des principaux groupes de composés a été réalisée selon la méthode précédemment publiée par notre groupe. Les aires sous la courbe (ASC) des principaux pics ont été exprimées en mg de composé étalon pour 100 mg d’extrait par analyse de régression linéaire.
Les composés individuels ont été identifiés par LC-ESI-QTOF-MS au moyen d’un système Ultimate 3000 RSLCnano (Thermo Fischer Scientific, Idstein, Allemagne) couplé à un spectromètre de masse quadripolaire à temps de vol (QqToF) Impact II équipé d’une source d’électronébulisation (Bruker Daltonics, Brême, Allemagne). Les conditions de la méthode appliquée étaient les suivantes : colonne Nova-Pack® C18 (150 × 2,1 mm, 1,7 µm) comme phase stationnaire, à 25 °C, avec un débit de 0,8 mL/min ; élution avec de l’eau distillée contenant 0,1 % d’acide formique (solution A) et de l’acétonitrile contenant 0,1 % d’acide formique (solution B) comme phase mobile, selon les proportions suivantes de solution B : 0–1,5 min, 5 % ; 1,5–13 min, 5–75 % ; 13–18 min, 75–100 % ; 18–21 min, 100 % ; 21–23 min, 100–50 %, puis 5 % en 7 min. Les paramètres optimisés ont été réglés comme suit : tension de pulvérisation ionique, +4,5/−2,5 kV ; décalage de la plaque terminale, 500 V ; gaz de nébulisation (N₂), 2,8 bars ; gaz de séchage (N₂), 8 L/min ; dispositif de chauffage du gaz de séchage, 200 °C. L’étalonnage interne a été réalisé en mode d’étalonnage de haute précision (HPC) avec une solution de formiate de sodium à 10 mM introduite dans la source d’ions au moyen d’une boucle de 20 µL au début de chaque analyse, à l’aide d’une vanne à six voies. L’acquisition a été réalisée en mode balayage complet dans la plage m/z 50–1 300 et en mode MS/MS dépendant des données, avec une acquisition à 3 Hz selon une méthode dynamique dont le temps de cycle fixe était de 3 s. La durée de l’exclusion dynamique était de 0,4 min. Les données acquises ont été traitées avec le logiciel Data Analysis 4.1 (Bruker Daltoniks, Brême, Allemagne). Les pics ont été numérotés automatiquement et la masse des fragments a été comparée aux données obtenues dans la base de données en ligne PubChem.
L’activité antioxydante peut être suivie au moyen de l’effet de piégeage des radicaux sur le DPPH• (#D9132, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis), qui passe du violet au jaune en présence d’un composé antioxydant. Ce changement peut être quantifié par spectrophotométrie à 517 nm au moyen d’un spectrophotomètre UV PowerWave XS (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, États-Unis), selon la méthode précédemment décrite. Les résultats ont été exprimés sous forme d’activité de piégeage — pourcentage d’inhibition — et de CI50, concentration à laquelle 50 % du radical libre DPPH• est réduit. En outre, l’indice d’activité antioxydante (IAA) a été calculé à partir des valeurs de CI50 selon la formule suivante : IAA = concentration finale de DPPH (µg/mL)/CI50 (µg/mL).
L’essai in vitro ABTS (#10102946001, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, États-Unis) a été réalisé selon García-Herreros et ses collaborateurs. L’absorbance à 741 nm a été mesurée au moyen d’un analyseur spectrofluorométrique FLUO Star Omega (BMG Labtechnologies, Offenbourg, Allemagne). Les résultats ont été exprimés en équivalents Trolox — acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique, ET. La transformation des données a été obtenue par extrapolation à partir de la courbe d’étalonnage du Trolox, dont l’équation était y = 0,2802x + 0,8694 ; R² = 0,9952, où y représente le pourcentage d’inhibition (% I) et x la concentration de Trolox (mM).
Les moyennes, les écarts-types et les graphiques ont été obtenus avec Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corp., Redmond, Washington, États-Unis). Les expériences ont été réalisées en triplicat. L’analyse statistique a été effectuée avec Stata v.12 (StataCorp LLC, College Station, Texas, États-Unis), et les différences ont été calculées pour chaque paire d’intérêt au moyen d’un test t de Student bilatéral à variances égales. Elles ont été considérées comme significatives lorsque p < 0,05. La relation entre les CPT, les différents groupes de composés, l’activité antioxydante et l’activité inhibitrice de l’AChE a été analysée au moyen des coefficients de corrélation de Pearson.
L’inhibition de l’AChE a été recherchée dans les extraits alcooliques et aqueux de plantes utilisées en médecine traditionnelle navarraise contre les maladies neurologiques. Les activités inhibitrices de ces extraits confortent l’usage traditionnel de ces espèces. Au total, 21 extraits sur 90 ont présenté une forte activité sur l’AChE, avec 75 à 100 % d’inhibition. Parmi eux, l’extrait éthanolique des parties aériennes d’Origanum vulgare ssp. vulgare a été sélectionné comme candidat prometteur constituant une source d’inhibiteurs puissants de l’AChE ainsi qu’un agent antioxydant. L’étude phytochimique de l’extrait a mis en évidence 23 composés phénoliques. Parmi ceux-ci, les acides syringiques pourraient être intéressants en raison de leurs effets neuroprotecteurs et antioxydants. Des évaluations supplémentaires sont nécessaires afin d’étudier leur innocuité et leur biodisponibilité dans des modèles animaux in vivo.
Étant donné qu’O. vulgare L. comprend plusieurs sous-espèces telles que hirtum (Link) Ietsw., vulgare L., viridulum (Martrin-Donos) Nyman, glandulosum (Desfontaines) Ietswaart, gracile (Koch) Ietsw., virens (Hoffmanns. & Link) Ietsw. et viride L., des études supplémentaires de ces sous-espèces devraient être menées afin de rechercher des composés chefs de file pour le traitement de la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies neurologiques.
Cette étude expérimentale in vitro et phytochimique, sans micro-organisme ni lignée cellulaire testés, a criblé à 250, 125 et 62,5 µg/mL 90 extraits de plantes médicinales de Navarre, dont 21 ont produit 75–100 % d’inhibition de l’AChE ; l’extrait éthanolique des parties aériennes d’Origanum vulgare L. ssp. vulgare a présenté 95,61 ± 2,02 % d’inhibition et une CI50 de 2,59 ± 0,01 µg/mL, contre 19,90 ± 4,80 µg/mL pour la galantamine, contenait 207,64 ± 0,69 µg/mg de composés phénoliques totaux et 23 composés identifiés ou provisoirement identifiés, et a montré in vitro une activité antioxydante DPPH de CI50 3,22 ± 0,19 µg/mL à 60 min et d’IAA 6,21 ± 0,10 ainsi qu’une activité ABTS de 34,24 ± 0,20 mg/100 mg d’extrait, résultats précliniques nécessitant encore une évaluation de l’innocuité et de la biodisponibilité dans des modèles animaux in vivo.
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